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方法論記事

ウサギモデルにおける最適胚期における低侵襲胚移植と胚ガラス化

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DOI：

10.3791/58055

⸱

2019年5月16日

 ,  ,  , 
1Departament of Animal Science, Institute for Animal Science and Technology (ICTA), Universitat Politècnica de València (UPV), 2Animal Technology and Research Center (CITA), Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA)

この記事について

サマリー

補助生殖技術 (ARTs) は、結果を改善し、関連するリスクを軽減するために継続的に評価されています。本稿では、ヒト生殖の理想的な動物モデルとしてのウサギの使用を可能にする効率的な凍結保存プロトコルを用いた低侵襲胚移植手順について述べる。

要約

胚培養または胚凍結保存などの補助生殖技術は、周産期および出生後の結果によって自然発症パターンに影響を及ぼす。アートアプリケーションの安全性を確実にするためには、動物モデルに関する研究が必要である。さらに、胚発生研究では、最後の段階として、健常な子孫を育てる能力を評価する必要があります。ここで、子宮への胚の移植は、あらゆる芸術関連実験を行うために不可欠である。

ウサギは、1世紀以上にわたって哺乳類の生殖を研究するモデル生物として使用されてきた。人間の種とその小さなサイズと低い維持費への系統の近接に加えて、誘発された排卵、ヒトに類似した初期の胚発生の年表、短い妊娠のような重要な生殖特性を有するそれは私たちが簡単に芸術のアプリケーションの結果を研究することができます。さらに、芸術 (細胞質内精子注入、胚培養、または凍結保存など) は、この種で適切な効率で適用される。

この記事で提示された腹腔鏡胚移植技術と凍結保存プロトコルを使用して、1) 簡単に、最小限に侵略的な技術を通して胚を移す方法および 2) ウサギの長期保存のための効果的なプロトコール時間の柔軟な物流能力とサンプルを輸送する能力を提供する胚。異なる発達段階でウサギの胚を移した後に得られた結果は、桑実胚がウサギの胚の回復および伝達にとって理想的な段階であることを示している。したがって、oviductal 胚移植が必要であり、外科的処置を正当化する。さらに、ウサギ morulae は、正常にガラス化および laparoscopically 転写され、記載した技術の有効性を証明する。

概要

ヒトの不妊症を迂回すること、または遺伝価値の高い家畜の繁殖を改善し、動物の遺伝資源を保全することを目的として、superovulation のような補助生殖技術と総称される一連の技術体外受精、胚培養、または凍結保存、1、2を開発した。現在、卵巣を刺激し、多数の腹腔卵巣卵胞を生成するホルモン治療が与えられています1.これらの卵胞から採取した卵母細胞は、成熟し、受精し、そして、それらが凍結保存されるか、または代理母3に移されるまで、インビトロで発達させることができる。しかし、これらの治療の間、配偶子および zygotes は、これらの条件4、5で生き残るために胚の適応を必要とする可能性のある一連の非生理的プロセスに暴露される。この適応は、初期胚の可塑性によって可能であり、これは胚の遺伝子発現および発達的プログラミング6の変化を可能にする。しかし、これらの修飾は成人するまでの胚発生のその後の段階に影響を及ぼし、現在広く受け入れられている方法、タイミング、凍結保存手順または培養条件は、胚の運命7に異なる結果を示す,8.したがって、芸術の具体的な誘発効果を解明するためには、よく特徴付けられた動物モデルの使用は不可避である。

哺乳動物胚の移動によってもたらされる最初の記録された生年月日は 18909において起こった。今日、サロゲートメスへの胚移入 (ET) は、その後の胚発達段階10での着床前中の芸術誘発効果を研究する上で極めて重要なステップである。ET の技法は、各動物のサイズおよび解剖学的構造に依存する。大型動物モデルの場合、あおむけ非外科的 ET 法によって ET を行うことが可能であったが、より小型の種では子宮頸部のカテーテル法がより複雑であり、外科的な技術が頻繁に使用されている11.しかし、外科的 ET は、血液が子宮内腔に浸潤して、移植および胚発生を損なう可能性のある出血を引き起こし、胚死10を引き起こす可能性がある。あおむけ非外科的 ET の技術は、依然としてヒト、ヒヒ、ウシ、ブタおよびマウス12、13、14、15、16、17において適用されるが、外科ETs は依然としてヤギ、ヒツジ、またはウサギなどの追加の困難10、18、19、20、21を提示する他の動物などの種で使用されている (2独立 cervices) またはマウス (小サイズ)。それにもかかわらず、外科的伝達方法は、より少ない侵襲的方法で徐々に置き換えられている傾向がある。内視鏡は、例えばウサギ、ブタおよび小さな反芻動物18、19、20において胚を移送するために用いられた。これらの低侵襲性内視鏡検査法は、ウサギに不可欠であり、いくつかの種20で有益な効果を実証している infundibulum を介して合流に胚を移すために使用することができる。これは、卵管の初期胚段階における胚と母親の間の正しい対話の重要性に基づいている。前述したように、卵管を介した胚遊走の間にウサギで起こる胚リモデリングは、22,23を移植することができる胚を達成するために不可欠である。

ウシのような大型動物モデルは、生化学的および着床前の特徴がヒト種24のものと類似しているため興味深い。しかし、大規模な動物は予備試験で使用するには高価すぎる、とげっ歯類は、実験室の研究25のための理想的なモデル (76% モデル生物がげっ歯類である) と考えられています。それにもかかわらず、ウサギモデルは、ヒトによって示されるいくつかの生殖生物学的プロセスがマウスのものよりもウサギの方が類似しているので、生殖研究においてげっ歯類よりいくつかの利点を提供するヒトおよびウサギは、同様の経時的な胚ゲノム活性化、gastrulation および hemochorial 胎盤構造を提示する。加えて、ウサギを用いて、それらの誘発排卵25による受精および妊娠段階の正確なタイミングを知ることができる。ウサギのライフサイクルは短く、31日で妊娠を完了し、約4-5 ヶ月で思春期に達する。動物は、その従順で非攻撃的な行動のために扱いやすいです、そして、その維持は、より大きな動物の費用に比べて非常に経済的です。さらに、ウサギは2つの独立した cervixes11,25を有する二重子宮を有することを言及することが重要である。これにより、異なる実験群からの胚は同じ動物に、しかし別の子宮の角に移すことができるので、ウサギは優先的な位置に置かれる。これにより、両方の実験効果を比較し、母体因子を結果から減らすことができます。

今日では、非外科的 ET 法はウサギでは使用されていません。あおむけ ET 技術を用いて90年代後半に実施されたいくつかの研究は、外科的方法によって 5.5% 〜 20.0%11、26対 50-65% までの低い送達率をもたらしたが、それらの中でも記載の腹腔鏡検査手順Besenfelder と Brem18.ウサギにおけるこれらの非外科的 ET 法の低い成功率は、あおむけ ET で回避される卵管において必要な胚リモデリングの欠如と一致する。ここでは、モデル生物としてウサギを用いた効果的な低侵襲性腹腔鏡 ET 手順について述べる。この技術は、大型動物およびヒトにおけるさらなる生殖研究のためのモデルを提供する。

ウサギは胚移植のために特に狭い時間枠を有するので、この種での ET は、胚の発生段階とレシピエント27の生理的状態との間で高い程度の同期性を必要とする。場合によっては、胚の発育を遅らせ (体外培養など)、または子宮内膜の受容性を変化させる生殖治療 (superovulation 治療など) の後に、胚と母体子宮との間の同調性はない。このような状況は、結果に悪影響を及ぼします。これらの文脈で応答するために、我々は、実験を一時停止し、組織化し、再開することを可能にする効果的なウサギ桑実胚ガラス化プロトコルを説明する。このプロセスは生殖研究のためにロジスティックに望ましい、私達に胚の長期貯蔵のための容量を与え、輸送を許可する。腹腔鏡処置および凍結保存戦略は、より少ない動物での研究のより良い計画を可能にします.このように、我々の方法論は、衛生的で経済的な優位性を提供し、動物研究の 3R (置換、還元、精製) の概念に準拠し、実験動物の人間の治療を改善するという目標を掲げています。したがって、これらの方法を用いて、ウサギはインビボ生殖アッセイのための理想的なモデル生物を構成する。

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プロトコル

本研究で使用されたすべての実験手順は、動物実験のための指令 2010/63/EU EEC に従って行われ、ウニベルシタット Politècnica ・デ・バレンシアの動物との実験のための倫理的委員会によってレビューと承認を受けました。スペイン (研究コード: 2015/VSC/エンドウ/00170).XGD、FMJ、MPVC、JSV はバレンシア政府が発行した承認証明書を持って、動物実験を行います。XGD は実験の間に動物の福利および心配を現場で監督するために認可される。

1. 胚移植

  1. レシピエント女性の作製
    1. 性的に成熟した女性だけを使用してください (> 4.5 ヶ月).
    2. ET の1週間前に, 16 h 光/8 時間の暗い体制に女性を適応させる濾胞成長を開始し、女性の受容を強化.
    3. 受信者の女性を選択し、外陰部の turgidity と色を観察する。外陰部が turgid、赤みがかっている場合、メスは受容型である。
    4. 体重に関係なく酢酸ブセレリン (ゴナドトロピン放出ホルモンの合成アナログ) の1μ g の単一筋肉注射によって pseudopregnancy (排卵) を誘発する。
      注: 通常、0.8 μ g は、中サイズのウサギ (4-5 kg) での排卵誘発に適した用量であるため、1μ g は一般的に排卵を保証する。
    5. (例えば、新鮮な桑実胚 ET の前に 70-72 h)、移入される胚の年齢として、できるだけ多くの日前に排卵を誘導します。
  2. 麻酔と鎮痛
    1. ウサギを計量し、次の麻酔薬と鎮痛薬をロードします。
      1. 30G 針で1ml の注射器で: 負荷キシラジン (5mg/kg) と塩酸ブプレノルフィン (0.03 mg/kg).別の 1 mL シリンジで 23G pericranial 針を用いて、塩酸ケタミン (35 mg/kg) を負荷する。
    2. ウサギを持ち、キシラジン・ブプレノルフィン混合物を筋肉内に注入する。
    3. Pericranial 針をマージナル耳静脈にケタミンで挿入し、すべてのシリンジの中身を静脈内に徐々に導入する。
    4. 針を固定し、必要に応じてより多くの麻酔を管理するために残りの手順を通して挿入を残します.
    5. うさぎをケージの中に残します (きれいにして、他の動物なしで) 暖かい段階で。
    6. 無意識のうちに、目の乾燥を避けるために目の軟膏を塗布し、瞼 freflex が存在しないかどうかを確認します。
      注: この議定書は最低30分の外科麻酔の平面を提供する。より長い時間が必要な場合は、1.2.1 の30分後に記載されている塩酸ケタミンの量の半分で追加の投薬量を注入します。
    7. ペダル反射と呼吸の動きをチェックして、麻酔の深さを監視します。不規則で速い速度への呼吸のパターンの変化は麻酔の適切な平面の損失を示す。
    8. 粘膜の色 (目、唇など)、呼吸数(1 分あたり30-60 の呼吸)、心拍数 (1 分あたり120-325 拍) および直腸の温度 (38-39.6 ° c) を監視します。
    9. 転送の8時間前に、ET プロセスが終了するまで、より大きな腸のサイズと活動を避けるために動物から食物を差し控えます。水への無料アクセスを残します。
  3. 胚調製
    1. 25° c に胚操作メディアを温めます: ベース培地 (BM)、ダルベッコ改変のリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) で構成され、ウシ血清アルブミンの 0.2%(w/v) を添加した。
    2. 実体顕微鏡の下で働いて、新鮮または解凍された (ステップ 2) 胚を凍結します。
    3. 滅菌手袋を使用して、適切に構成された17G 硬膜外カテーテルを1Ml のシリンジに取り付けます。
    4. カテーテルに BM の1センチメートルを吸引し、続いて小さな気泡を注入します。
    5. 10μ l の BM の容積に 5-7embryos を吸引し、その後に別の小さな気泡が続く。
    6. BM の 1 cm を吸い出すことによってカテーテルのローディングを完了しなさい。
  4. 胚移植
    1. 無菌環境を確保するために無菌手袋、ガウンおよびマスクの使用を考慮してください。
    2. 外科手術器具を滅菌し、手術が行われる表面を清浄にし、70% のエタノールで拭き取ってください。
    3. 前に詳述したように麻酔を行い (ステップ 1.2)、反射神経の喪失をチェックする。
    4. 電気かみそりで腹部から毛皮を剃る。
    5. 腹側腹部無菌的を準備します。
      1. 外科区域をきれいにし、残りの毛を取除きなさい。クロルヘキシジングルコン酸石鹸で手術場を洗う。クロルヘキシジン溶液およびエタノール96º (3 回) で領域を消毒します。
    6. 暖かい外科テーブルの上に動物を置き、トレンデレンブルクの位置 (45 °で頭を下げる) で胃と腸が cranially に位置していることを確認します。それが turgid である場合、膀胱の避難を検討してください。もしその過程で内臓が損傷した場合、その動物は死ぬかもしれません。したがって、それらを適切に配置することが重要です (図 1)。
    7. 滅菌タオルを使用して領域を覆い、剃毛領域を露出させた穴 (開窓) を用いて、手術部位を任意の潜在的な汚染領域から分離する。
    8. 1つの内視鏡用トロカール 5 cm を腹腔内に挿入し、2cm 尾部を剣状突起プロセスにかけ、それにより、圧力調節機械注入で腹膜腔を insufflate。
      注: 腹腔内圧は、CO2で 8-12 mmHg とする必要があります (図 1a)。
    9. 内視鏡用のカメラを内視鏡用トロカールを通して挿入します (図 1b)。
      注: 次のステップを容易にするために、ET 前に infundibulum と合流の状態と位置を決定し、生殖管を特定します。
    10. Infundibulum から 2-3 cm の間の鼠径部に 17-G 硬膜外針を挿入します (図 1b)。
    11. Infundibulum の入り口を識別します (図 2a, 2b)。
    12. ロードされたカテーテル (ステップ 1.3) を硬膜外針を通して腹部に挿入する (図 1c)。
    13. 卵管を見つけ、合流の infundibulum を通して硬膜外カテーテルの 1-2 cm を挿入します (図 2a~ 2c)。損傷や出血を防ぐために、卵管に非常に遠くまで進まないでください。
    14. 注射器のプランジャーをカテーテルに結合させることによって、卵管に胚を放出する (図 2d-2f)。両方の気泡は、カテーテルを終了する必要があります。
    15. 胚が放出された直後にカテーテルを除去する。
    16. 吸引し、胚の不在を確認し、その成功した転送を確認するために操作媒体を解放し、カテーテルをすすぎます。
    17. 必要に応じて、子宮の反対側に1.4.16 するために、ステップ1.4.11 を繰り返します。
    18. 硬膜外針と内視鏡カメラを取り外します。
    19. 内視鏡トロカールを介して co2 を放出する。余分なガスは、動物の腹部に残っている場合、それは痛みや不快感を持つことになります。
    20. 腹腔から内視鏡用トロカールを除去する。手術タオルを取り外します。
    21. 麻酔を中止する。
    22. クロルヘキシジン溶液でトロカールによって作られた切開をきれいにします。微粉化したアルミニウムとプラスチック製のドレッシングでトロカールによって作られた切開を閉じます。
  5. 術後ケア
    1. 抗生物質で動物を治療:10 mg/kg のエンロフロキサシン, 皮下, すべての 24-h 5 日間.
    2. 鎮痛薬の投与: 塩酸ブプレノルフィン (0.03 mg/kg)、筋肉内、3日間の各12時間;メロキシカム (0.2 mg/kg)、皮下、3日間のすべての 24-h。
    3. 手術後少なくとも30分間は動物を観察してください (動物と使用する麻酔の量によって異なります) 生理的条件を回復させるようにしてください。
    4. 適切な環境条件を持つ清潔なケージの中で、受信者 (例えば、耳の入れ墨) と動物を個別に識別します。

figure-protocol-1
図 1: 腹腔鏡検査 (外部視野) によって支援される腹腔鏡下胚移植。A)内視鏡用トロカール (1 つのポート) の挿入。B)内視鏡カメラと硬膜外針 (黒色矢印) の挿入。C)硬膜外針を介した胚移植カテーテル (白色矢印) の挿入。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-2
図 2: 腹腔鏡検査 (内部ビュー) によって補助される腹腔鏡下胚移植。A:硬膜外針を通したカテーテルの腹部ゾーンへの挿入。アスタリスクは、infundibulum を示します。B、C、D:胚を装填したカテーテルは、infundibulum を横切って合流領域に挿入される。E、F:胚の放出は、膨潤した卵管の可視化によって確認される。この図は、マルコ-・ヒメネスet al.38この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

2. 胚ガラス化・加温

  1. 室温 (22 ° c 前後) ですべての操作を行い、より暖かい温度でのガラス化溶液の毒性を低減します。
    注: 胚はこの議定書で 0.1-2 μ l の自動ピペットを使用して動くことができるが、最低の容積をドラッグする胚を動かす他の類似した装置は適することができる。
  2. 2段階の添加手順で胚を Vitrify:
    1. 10%(v/v) エチレングリコールと 10%(v/v) BM に溶解したジメチルスルホキシドで構成される平衡化溶液中で2分間胚を配置する。
    2. (ステップ2.2.1 から) 胚を1分間移動して、20%(v/v) エチレングリコールおよび 20%(v/v) BM に溶解されたジメチルスルホキシドで構成されるガラス化溶液にする。
  3. 125μ l のプラスチック ministraw (綿プラグと1つのオープンエクストリームを持つ1つの閉じた端が含まれている) に胚をロードします。このプロセスは図 3で図式化されています。
    1. 0.125 μ l ministraw の閉端を適切な microdispenser (例えば Captroll III®) と結合させる。
    2. このストローの長さが1/3 になるまで BM を吸引除去し、小さな気泡により追従させる。
    3. 40μ l のガラス化溶液の容量で胚を吸引除去し、続いて別の小さな気泡が続く。
    4. BM を吸引して最初の液体分画 (ステップ 2.3.2) 綿に到達する。
    5. 開いた端をストロープラグで閉じます。
  4. ステップ2.3 が行われている間にステップ2.2.2 を実行し、1分間を超えないようにして、胚に対して有毒であろう。
  5. Ministraw を液体窒素に直接突入させることでガラス化を実現します。
  6. 所望の時間のための窒素のデュワーに ministraw を保存します。
  7. 胚を1ステップで解凍します。
    1. Ministraw を液体窒素蒸気から 20-30 s の水平 10 cm に置きます。
    2. 結晶化プロセスは、ministraw の内側に開始すると、10-15 s のために25° c の水浴で ministraw を浸します。
    3. Ministraw プラグを取り外し、綿栓を切ってください。
    4. カップリング microdispenser を使用して、ministraw のすべての内容を5分間 BM で25° c で 0.33 M ショ糖溶液を含むプレートに排出します。
      注: ガラス化溶液への胚曝露を減らすために、このステップを迅速に行う必要があります。
    5. 別の5分間 BM 溶液を含む新しいプレートに胚を移動します。
    6. (そのままのムチンコートと透明帯を持つ) 損傷していない胚のみが ET を継続することを考慮してください。
      注: 解凍された胚では、非同期転送 (例えば、桑実胚転送における 60-62 h) は、胚と母体の子宮内膜との間の再同期を可能にすることによって結果を改善し得ることを考慮してください。

figure-protocol-3
図 3: Schematization が正しく装填されていること。A) BM は、ガラス化中に用いられる媒体を操作する胚を指す。胚はガラス化保存液に装填しなければならない。B)胚の位置の詳細を拡大した、装填されたわらの巨視的な外観。この大量の装置は最低の容積装置とは違って私達が多数の胚を vitrify ことを可能にする。なお、この装置の処理は最低の容積装置と比較され易く、結果はウサギ41で類似している。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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結果

新鮮なまたはガラス化された胚の低侵襲的な腹腔鏡下移動は、生殖研究のための最高のモデル動物の中にウサギを配置します。表 1は、転移した胚の異なる発達段階 (図 4) における新鮮な ET の結果を示す。出生時の生存率 (pup に起因する胚の割合) は、この論文で説明されている腹腔鏡技術の有効性を証明した。より高い値は、ET が桑実胚段階の胚で行われたときに達成された, 早期またはコンパクト morulae のいずれか.これらの結果に基づいて、これらの胚のガラス化後の生存率を実証するための第2の実験を行った。このように、表 2では、同時に回収したガラス化ウサギ morulae を移送した後に得られた結果を示し、良好な圧縮度に達していたそれらの胚間の分化を示す。出生時の生存率は、異なる胚の段階の間で異なっていた, 圧縮された morulae で高くなっています.したがって、腹腔鏡下胚移植は、ウサギに新鮮なおよびガラス化された胚を移す信頼性の高い技術で...

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ディスカッション

移入された胚9からの最初の文書化した生きた出生例以来、この技術およびウサギ種は生殖研究において決定的になっている。また、操作、生産、凍結保存などを含む胚研究の研究は、最後のステップとして、健康な完全期の子孫を生成する胚容量の評価を必要とします。従って、胚移植技術は13、28に不可欠である。長年にわたって、母体の子宮に胚を移すために最初に用いられた外科的な方法は、種13、14、15の大多数において徐々により少ない侵襲法によって置換される。21,27,29,<...

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開示事項

作者は何も開示することはありません。

謝辞

この作業は、スペインの経済産業省 (AGL2017 ・ 85162) と Generalitat バレンシアナ研究プログラム (PrometeoII 2014/036) の資金によって支えられました。N. Macowan 英語サービスによる英語テキストバージョンの改訂

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ウシ血清アルブミン(BSA)VWR332
プレノルフィン塩酸塩アルベットエスカートí626資格のある獣医師が注文する。
ブセレリンアセテートシグマアルドリッチB3303
クロレキシジンジグルコン酸塩石鹸アルベットエスカートí0265DCCJ500B
クロレキシジンジグルコン酸溶液Alvet Escartí0265DCCA500B
CO2Air Liquide99921CO2 N48.
CO2インキュベーターFisher scientific15385194
Dimethyl SulfoxideSigma AldrichW387509
Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水(DPBS)Sigma AldrichD5773塩化カルシウムなし。
電気かみそりオスターゴールデンA5078005-140-002
内視鏡カメラオプトミックスペインSAOP-714
シリコーンリーフレットバルブ付き内視鏡トロカールカールストルツ内視鏡IbéリカS.A.30114GK軽量トロカールモデル。
エンロフロキサシンアルベットエスカートí9993046獣医師の資格を持つ医師が注文してください。
エピクレニードル23Gアルベットエスカートí514056353小さめの針も使用できます。
硬膜外カテーテルVygon corporate187.10
硬膜外針Vygon corporate187.10
エチレングリコールSigma Aldrich102466-M
眼軟膏Alvet Escartí5273
塩酸ケタミンアルベットエスカートí184資格のある獣医師が注文する。
腹腔鏡検査装置Karl Storz Endoscopia IbéリカS.A.26003 AAホプキンス®腹腔鏡、0º-mmストレートビューイング腹腔鏡、長さ30cm、5mmの作業チャネル。
光源Optomic Spain S.AFibrolux 250
液体窒素空気 リキードP1505XXX
機械式 CO2 吸気器カール ストルツ 内視鏡 IbéリカS.A.エンドフレーター®
メロキシカムアルベットエスカートí9993501獣医師の資格を持つ医師が注文してください。
ペトリ皿、35 mmシグマ アルドリッチCLS430165-500EA
プラスチックドレッシング (Nobecutan)IBOR medica7140028
プラスチック ストロー 0.25 mLIMV - 技術6431
ポビドン ヨウ化物溶液Alvet Escartí02656DPYS500S
さみROBOZRS-5880通常の外科用グレードのスチール製小型ストレートはさみで機能します。
吸入器用シリコーンチューブカールストルツ内視鏡IbéリカS.A.
実体顕微鏡ライカMZ16FライカMZ8、ニコンSMZ-10、SMZ-2Bなど、安価なオプションがあります。
滅菌手袋アルベットエスカートí087GL010075
ガウンアルベットエスカートí
滅菌マスクアルベットエスカートí058B15924B
わら栓IMV - 技術6431
ショ糖シグマAldrichS7903
シリンジ、1 mLフィッシャー科学11750425
シリンジ、5 mLフィッシャー科学11773313
尿道カテーテルIMV - 技術17722
バスRAYPABAE-4
キシラジンアルベットエスカートí525225獣医師の資格
ウサギUniversitat Politèクニカ・デ・ヴァルènciaLine ALine VやLine HPなどの他の母系を使用できます。
ブ は20400040滅菌12261501ウォーターを持つ医師のご注文となります。

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