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Summary

識別し、並べ替え (MAC および FACS) 蛍光と磁気の組み合わせを使ってマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の 6 のサブセットを分離する方法を示します。このプロトコルは、体外培養の試金 (セルロースまたは液体文化)、養子の転送実験生体内RNA ・ タンパク質解析に使用できます。

Abstract

好中球、単球や樹状細胞 (Dc) をもたらす骨髄前駆細胞はで識別でき、血液学的および免疫学的解析のためのマウスの骨髄から分離しました。たとえば、骨髄前駆細胞集団の細胞・分子物性研究は白血病変換のメカニズムを明らかにしたり免疫系が病原体に応答する方法を示します。以前の myeloid 祖先識別のため説明流れ cytometry 戦略は、多くの分野で重要な進歩を有効にしているが、彼らを識別する分数は非常に異質。最も一般的に使用されるゲートの戦略目的の集団に濃縮されているもが多数「汚染」の前駆細胞の骨髄分数を定義します。私たちの最近の研究は、この不均一性の多くを解決したし、ここでは提示プロトコル寡能性 6 集団の隔離を可能に前述の 2 系列コミット骨髄前駆細胞骨髄分数。プロトコルは 3 つの段階を記述: 1) 分離骨髄の細胞、2) 磁気活性化細胞ソーティング (MAC で血統の枯渇)、および 3) (を含むフローサイトメトリーによる骨髄系前駆細胞サブセットの識別によって造血前駆細胞の濃縮蛍光活性化細胞選別、FACS、必要な場合)。このアプローチは、前駆の定量化と様々 なin vitroとin vivoのアプリケーションの分離が可能、既に経路と好中球、単球、および DC 分化のメカニズムに新しい洞察力をもたらした。

Introduction

単球、好中球、樹状細胞 (Dc) は、イエウサギと呼ばれるプロセスによって主に骨髄での造血前駆細胞から生じる骨髄系の細胞です。一般的な骨髄前駆細胞 (Cmp の) 骨髄細胞と同様に巨核球、赤血球、ないリンパ様細胞を生成する可能性があります。顆粒球単球前駆細胞 (適性) Cmp から派生した、顆粒球、単球が巨核球と潜在的な赤血球を失っています。単球および古典的な樹状 (cDCs/Pdc) も Cmp 徐々 に分化能の制限の血統で、コミット結果最終的によって作り出される球 DC 前駆細胞 (MDPs) として知られている共通の前駆細胞から生じると考えられている。前駆細胞: 顆粒球前駆細胞、単球前駆細胞、樹状細胞前駆細胞 (図 1)。

ワイズマンと同僚の報告林^– c-キットに⁺ Sca-1^– (^–以下 LKS) CD34 既に報告がある⁺ FcγR^loの一部マウス骨髄、省は、LKS^– CD34 に含まれている間⁺ FcγR^{こんにちは}分数¹。しかし、これらの”の CMP”と”GMP”分数が非常に異質です。たとえば、”GMP”分数には、リネージュ コミット顆粒球前駆細胞と単球前駆細胞^1,2も含まれています。CX3CR1 をこと MDPs が別々 に報告された⁺ Flt3⁺ CD115⁺前駆細胞 CD34 と FcγR^3、4を表す。MDPs は、cDC/pDC 生産共通 DC 前駆細胞 (Cdp)、c-Kit (CD117) のより低いレベルを表現する報告されてきたを生じ、LKS^–一部⁵には含まれません。

それは従来の単一経路 (CMP-GMP-民主党-単球) 単球が発生する予想。(単球前駆細胞、MPs の名前) 省によって生成されるこのモデル, 単球コミット前駆細胞と一貫性のある²と (一般的な単球前駆細胞、cMoPs の名前) MDPs⁶共有表面マーカー式に基づいて同一の細胞のように見える.しかし、我々 は最近単球によって生産されているいない独立して省と MDPs、実証、単一細胞 RNA シーケンス⁷MPs と cMoPs を区別することができた。

最近、c57bl/6 j マウス骨髄異なる寡能性と系統コミットの myeloid 祖先のサブセットを含む 6 亜分画を識別するワイズマン”の CMP”と”GMP”ゲート戦略を変更しました。寡能性省と同様、顆粒球前駆細胞 (GPs) と単球前駆細胞 (MPs および cMoPs は、我々 は現在を区切ることができない) の隔離を可能に Ly6C と CD115 のために汚れることをまず報告”GMP”分数² (LKS から^–CD34⁺ FcγR^{こんにちは}ゲート;図 1)。我々 はその後 MDPs は”の CMP”の割合で主に見られることを実証 (LKS^– CD34⁺ FcγR^loゲート)、Flt3 が含まれている⁺ CD115^lo Flt3^–サブセット⁷ (図 1).CMP Flt3⁺ CD115^lo分数は、養子の転送時に適性と MDPs を生成します。CMP Flt3^–のサブセットには、CMP Flt3⁺ CD115^lo細胞と省の間の中間体のように見える前駆細胞が含まれています。MDPs とは異なり両方、CMP Flt3⁺ CD115^loおよび CMP Flt3^–分数も所有している球および赤血球の潜在的です。

ただし、”の CMP”分数に寡能性 (例えば、個々 のセル CMP Flt3⁺ CD115^lo分数内好中球を所有していることは、本当に前駆細胞が含まれているかどうかは現在のところ明確のことにそれが重要です。単球、DC、巨核球、および潜在的な赤血球)、または、代わりより制限されている血統で、潜在的な前駆細胞の混合物を構成します。コロニー形成アッセイ (セルロース文化) 明らかに細胞顆粒球 (好中球)、赤血球、単球、巨核球潜在的な (ジェム細胞)”CMP”の CMP Flt3⁺ CD115^loと CMP Flt3^{– 1 、7}、直流電位の評価を許可しないが。対照的に、コロニー形成アッセイ”GMP”分数^1、2、寡能性適性 (好中球と単球の潜在的な前駆細胞) の存在とこれは最近単一セルによってサポートされてトランスクリプトーム解析⁸。それは現在知られていない、しかし、これらの寡能性適性はまた他の顆粒球 (好酸球、好塩基球、肥満細胞) を生成するかどうか。

今を示すこれらの研究に基づいて 7 表面のマーカー (cd34 陽性、FcγR、Flt3、Ly6C と CD115 の c キット、Sca-1) 使用でき、寡能性と系列拘束された骨髄前駆細胞のこれらの 6 のサブセットを分離します。体外培養の試金 (セルロースまたは液体文化) のここで説明されているプロトコルを適用ことができますマウス、および分子解析 (バルクで単一細胞の RNA シーケンス、西部にしみが付くこと、の生体内で養子転送実験など)。

プロトコルは 3 つの段階で構成されています: 1) 骨髄の単一細胞懸濁液調製された細胞、2) (磁気活性化細胞ソーティング)、造血前駆細胞、3) 識別、および分離の流れによって前駆細胞サブセットの望まれた場合の濃縮フローサイトメトリー (適切なアナライザーまたは、ソーターを使用)。最初のステップは、大腿骨から骨骨髄細胞の分離と安楽死させたマウスの脛骨、⁹その他の前述のプロトコルに似ています。次に、サンプルは、幹・前駆細胞の赤血球、好中球、単球、リンパ球などの細胞表面マーカーに対する抗体のカクテルを使用して分化した細胞を破壊するために濃縮されています。これは必須、前駆細胞のサブセットの検出を最適化し、前駆細胞の識別に必要な抗体とフローサイトメトリーに必要な時間の量を低減する強くお勧めします。以下の血統の枯渇プロトコル説明 Magnetic-Activated セルの並べ替え (MAC) のいずれもマウス系統の細胞枯渇キットを使用して (CD5、CD45R ビオチン化抗体が含まれている (B220) テル-119、Gr-1 (Ly6G/C)、7-4、CD11b 反ビオチン プラスマイクロ ビーズ) と自動磁選機。最後のステップは、識別 (と必要な場合、並べ替え) フローサイトメトリーによる前駆細胞サブセットの。抗体パネルが下記 4 レーザーで流れの cytometer (アナライザーまたは選別機) で使用する設計されています (テーブル 1を参照してください) (405 488 nm nm、561 nm、640 nm)。

図 1: 好中球、単球および DC 前駆細胞と分化経路。”Cmp”(青)、「適性」(グリーン)¹オーバーレイ ワイズマン ゲート イエウサギ⁷の最近改正されたモデルを示します。この図は、ヤーニェスら2017⁷から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Protocol

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ヒマラヤスギ シナイの医療センターによって承認されました。 1. 分離マウス骨髄と単一細胞懸濁液の調製 制度のガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。 その裏に euthanized マウスを置き、70% エタノール (エタノール) をスプレーします。鋭い、先の尖ったはさみ、足から取り外して、筋肉や骨を公開の体に向かって皮膚を引き上げて使用して足首レベルで各後肢での (3 ~ 5 mm) の小切開を行います。 はさみ、次の骨の方向でそれらをトリミングすることによって、骨から筋肉 (大腿四頭筋、膝腱など) を削除します。骨を傷つけないように注意します。 股関節から大腿骨を脱臼し、結合組織と骨を切らないように注意しながら、足を切断する筋肉を切り取る。 脛骨から足首を脱臼して足を削除、管内滅菌 PBS またはメディアの骨を配置、組織培養室に氷の上にそれらを輸送します。注: いくつかの他のアプリケーション (例えば、全骨髄細胞からマクロファージの派生) それはしばらくの間、氷の上の骨を残すが、前駆細胞の分離のためのダウンレギュレーションを避けるためにできるだけ早く進めることが重要です。重要な表面マーカー (特に CD115)。 バイオ セーフティ キャビネット、ティッシュ ペーパーでこすって骨から任意の残りの軟部組織を削除します。注: プロトコルは滅菌サンプルがセルの文化や生体内での試金 FACS を並べ替えた後のため必要な場合、バイオ セーフティ キャビネットで実行必要があります。無菌細胞が必要ない場合は、研究室のベンチに全体のプロセスを実行できます。 簡単に 70% の骨を浸し、それら、それらを洗浄する滅菌 PBS での消毒にエタノール。 膝を通って切断によって両脚の腓骨と脛骨、大腿骨を分離し、両脚の腓骨を破棄します。 鋭いハサミで骨の両端をカットします。 骨が白く表示されてまで冷滅菌 PBS で骨髄をとおり収穫します。 各骨鉗子、グリップ、1 つの端の骨軸に冷滅菌 PBS を含む 10 mL の注射器に接続されている 26 G 針を挿入します。 50 mL の遠心管の上の骨を押し、骨、骨髄を収穫する 2-5 mL PBS をフラッシュします。 マウス (2 大腿骨と脛骨 2) あたりのすべての 4 の骨から骨髄を収穫します。 細胞懸濁液を形成する骨髄の分解および 1 mL ピペットでピペットの上下に優しく。 骨の部分を排除し、セルの集計、単一細胞懸濁液を生成するために 30 μ m ナイロン メッシュの部分を介して骨髄懸濁液をフィルター処理します。 5 分の滅菌染色バッファー (PBS 0.5 s + 2 ミリメートルの EDTA)、細胞ペレットを再懸濁します 280 x g で単一細胞懸濁液を遠心分離機では、染色バッファー マウス (例えば、セルから大腿骨および脛骨 2 マウスのプールの 10 mL) あたり 5 mL を使用しています。 10 μ L のサンプルの分注を取る、10 μ L を混ぜてトリパン ブルーと診断に結果トリパン ブルー ラベル サンプルのロード 10 μ L。光学顕微鏡を使用してセルをカウントします。注: セルに信頼性の高いカウントのためあまりにも集中している場合は、トリパン ブルーを追加する前にサンプルを希釈します。 2. 前駆濃縮磁気活性化細胞 (MAC) の並べ替えで 全体の単一細胞懸濁液を遠心分離 (または同数のセルとして、目的の収率を取得する必要) 40 細胞ペレットを再懸濁します、4 ° C で 5 分間 280 x g で μ 10 の7セルごとのバッファー (PBS + 0.5 s + 2 ミリメートルの EDTA) を染色します。注: それはまた血統の枯渇のキット メーカーから MAC バッファーを使用することが可能 (材料表参照) 染色バッファーの代わりに。 血統の枯渇のキットに付属している指示に従って血統の枯渇を実行します。次の手順は、テーブルの材料で見られるキットです。別のキットを使用する場合、製造元の指示に従って、2.3 の手順に進みます。 107細胞あたり 10 μ L ビオチン抗体カクテルを追加、ピペッティングで混ぜるし、4 ° C で 10 分間インキュベート 30 μ L を追加染色バッファー/マック 10 の7セルごとのバッファーし、ミックスします。 10 の7セルあたり 20 μ L 抗ビオチン マイクロ ビーズを追加します。よく混合し、4 ° C でさらに 15 分間インキュベート注: 渦マイクロ ビーズのセルにそれらを追加する前に完全に分散配置されていることを確認します。 280 x g は 5 分、再懸濁します 500 μ L 染色バッファー/MAC で細胞ペレットを最大 10 の8セルのバッファーで細胞を遠心分離機、染色バッファー/MAC バッファー 107セルあたり 1 mL を追加します。以上 10 の8セルのバッファー/MAC バッファーをそれに応じて染色のボリュームをスケール アップします。 製造元の指示に従って自動磁選機を準備します。 区切り文字にラベル付きセルを含むチューブを置き、負の選択プログラムを選択します。 リネージュ陰性 (Lin-) の前駆濃縮細胞が含まれている負の分数を収集します。磁気標識リネージュ陽性細胞が含まれている正の分数を破棄します。 林- 280 x g で 5 分で細胞を遠心し、染色バッファー/MAC バッファー マウス (例えば骨髄を 2 マウスからプールされた場合 4 mL) あたり 2 mL で細胞ペレットを再懸濁します。注: ペレットはず赤ではなく白、赤血球が減ったためです。 林-細胞分注 10 μ L を取る、10 μ L を混ぜてトリパン ブルーと診断に結果トリパン ブルー ラベル サンプルのロード 10 μ L。光学顕微鏡を使用してセルをカウントします。注: セルに信頼性の高いカウントのためあまりにも集中している場合は、トリパン ブルーを追加する前にサンプルを希釈します。 3. 骨髄前駆細胞の同定と分離によって蛍光活性化セル (FACS) を並べ替え ラベル 9 遠心 (1.5 または 2 mL) チューブ: 1) 2-8 細胞の無染色) セル単一 FcγR (CD16/32)、蛍光標識抗体で染色 c キット、Sca 1、CD34、Flt3 (CD135)、Ly6C と電圧の選択と色の補正、および 9 の CD115)サンプル細胞前駆細胞の識別および並べ替えのためのすべての 7 抗体で染色されます。 サンプル管 (管 9) に各コントロール チューブ (管 1-8)、100,000 セルと残りのすべてのセル (または少ない必要な場合) を配布します。注: サンプル ボリュームが 1.5-2 mL よりも大きい場合は、必要があります 15 mL チューブにサンプル細胞を配布、遠心分離機のそれらと (以下ステップ 3.3) ペレットを再懸濁します、以降の染色手順微量遠心チューブにセルを転送します。 1,500 × g で 5 分で細胞を遠心し、100 μ L で制御管ペレットを再懸濁します (例えば1 x 10 の7セル 200 μ L) を細胞 5 × 106ごとにバッファーを染色染色バッファー (PBS + 0.5 s + 2 ミリメートルの EDTA)、100 μ L のサンプル チューブのペレット。 FcγR 単一染色管、サンプル管に 2 μ g/mL 抗-CD16/CD32-APC-Cy7 を追加します。ミックス、および 4 ° C で 10 分間インキュベートする優しく渦注: 非特異的 Fc を介した抗体の結合のための競争を防ぐために他の抗体を追加する前に FcγR (CD16/32) 抗体サンプル細胞を染色することが重要です。試薬をブロック、FcγR のセルを孵化しないで。 他の抗体を追加し対応する単一染色チューブ (1 抗体)、サンプル チューブ (すべて 6 抗体): 10 G/ml c-キット-パシフィック ブルー、2 μ g/mL Sca 1-PE Cy7、25 μ g/mL CD34 FITC、10 μ g/mL Flt3 APC、2 μ g/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5 4 μ g/mL CD115 PE。渦優しく、4 ° C で 15 分間インキュベートし、 900 μ L 染色バッファー コントロール チューブと 1 mL のサンプル管に 10 の7セルごと染色バッファーを追加します。5 分間 1,500 × g 細胞を遠心し、バッファーを染色の細胞ペレットを再懸濁します: コントロール チューブあたり 200 μ L、サンプル チューブ内の 25 x 106セルあたり 500 μ L。5 mL FACS の管に再懸濁細胞を転送します。注: サンプル ボリュームが 1.5-2 mL よりも大きい場合は、必要があります 15 mL 遠心チューブにセルを転送します。 製造元の指示に従って流れの cytometer (アナライザーまたは選別機) を準備します。 制御電圧と色補正を設定する流れの cytometer 細胞を染色無染色と 1 つを実行します。 サンプル細胞を実行、下記の図 2に要約として前駆細胞サブセットのゲートおよび必要な場合実行 FACS 関連前駆細胞サブセットを分離する並べ替え。注: それは通常約 200,000 セル前駆門ごとに少なくとも 1,000 イベントを取得するを取得する必要です。 FSC A (x 軸) と SSC A (y 軸) に表示するすべてのセルのドット プロットを作成して、ゲートの破片や死んだ細胞を除外する = >「ライブ」のセル。 FSC H (x 軸) と FSC W (y 軸) に表示する、「ライブ」のセルのドット プロットを作成および二重項を除外するゲート = > (FSC) のライブ/一重項ゲート。 ライブ/一重項のドット プロット (FSC) 細胞、SSC H (x 軸) と SSC W (y 軸) の表示を作成し、ダブレットを除外するゲート = > (FSC) のライブ/一重項/一重項 (SSC) ゲート。 (FSC) のライブ/一重項のドット プロットを作成/Sca 1 (x 軸) と c キット (y 軸) に表示する、一重項 (SSC) 細胞と c キット+ Sca 1-のセルを選択するゲート = > LKS-細胞。 LKS-セル、CD34 を表示のドット プロットを作成 (x 軸) FcγR (y 軸) と門のと CD34 を選択する+ FcγRloセル = >「Cmp」と CD34+ FcγRこんにちはセル = >”適性”。注: 可能な限りゲート”Cmp”および「省」として正確にすることが重要です。正確なゲート pseudocolor 密度プロットとコンター プロットを使用することをお勧めします。 CD115 を表示する”Cmp”のドット プロットを作成 (x 軸) および Flt3 (y 軸) とゲートを選択します。Flt3+ CD115loセル = > CMP Flt3+ CD115lo細胞、Flt3- CD115loセル = > CMP-Flt3-セル、Flt3+ CD115こんにちはセル = > MDPs 。 Ly6C を表示する「省」のドット プロットを作成 (x 軸) FcγR (y 軸) と門のと Ly6C を選択する-セル = >「GMP-Ly6C-セル」, と Ly6C+セル = >「GMP Ly6C+細胞」。 「GMP-Ly6C-セル」, CD115 の表示のドット プロットを作成 (x 軸) および Flt3 (y 軸) とゲートを選択します。Flt3- CD115loセル = >適性。 「GMP Ly6C+セル」, CD115 の表示のドット プロットを作成 (x 軸) および Flt3 (y 軸) とゲートを選択します。Flt3- CD115loセル = > GPs、Flt3- CD115こんにちはセル = > MPs + cMoPs.

Representative Results

上記プロトコルを使用して、それは大腿骨から脛骨 (2 脚) 1 つの c57bl/6 j マウス (6-8 週古い、男性または女性) の 1 億の細胞 (赤血球、または 5000 万の有核細胞を含む) を取得することが可能です。1-200 万林-細胞は、Lin+細胞の枯渇を MAC でマウスあたりに分離できます。 6 骨髄前駆細胞サブセットのそれぞれ…

Discussion

マウス骨髄前駆識別¹のための戦略をゲート ワイスマン教授は免疫のゴールド スタンダードと約 20 年間、血液をされているが、それは今”の CMP”と”GMP”ゲート、非常に異質かつ精確であることが明らかゲートの戦略が必要です。我々 はここで記述したプロトコルが特定の骨髄前駆細胞のより正確な定量のイエウサギ経路のマッピングだけでなく、調査の c57bl/6 j マウスの寡能?…

Materials

Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2)	The Jackson Laboratories	Cat#JAX:000664
Lineage Cell Depletion Kit, mouse	Miltenyi Biotec	Cat#130-090-858
Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC	BD Biosciences	Cat#553733
Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7	BioLegend	Cat#101327
Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7	BioLegend	Cat#108114
Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue	BioLegend	Cat#105820
Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5	BioLegend	Cat#128012
Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE	BioLegend	Cat#135506
Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC	BD Biosciences	Cat#560718
CountBright Absolute Counting Beads	Thermo Fisher Scientific	Cat#C36950
AutoMACS Separator	Miltenyi Biotec	N/A	Use the "deplete" program
BD LSRFortessa	BD Biosciences	N/A	5 lasers, 15 colors
BD FACS Aria III cell sorter	BD Biosciences	N/A	5 lasers, 13 colors
FlowJo	FlowJo, LLC	https://www.flowjo.com	For further analysis of the .fcs files