高スループット、高コンテンツ、液体ベースのc. の elegans病態システム

Summary

ここでは適応可能、全体のホスト、ホスト病原体の相互作用を研究し、創薬に使用することが出来、高コンテンツ スクリーニング ツール プロトコルについて述べる。

Abstract

識別される新薬の数によって、伝統的な体外画面は暮れゆき、多剤耐性を戦闘に新たな武器を求めてこのアプローチの成功を減らすこと。これは、研究者はのみ新しい薬を見つける必要はありませんが、またそれらを見つける新しい方法を開発する必要があります結論につながっています。最も有望な候補の中でメソッドは、全体の生物、生体内でその使用の高スループット、表現型のリードアウトを試金して動脈分布を線虫からその範囲をホストします。これらのホストには、ホストまたは biounavailable に有毒な化合物は、通常を高価なフォローする前に、最初の画面にドロップした時に誤検出での劇的な削減を含むいくつかの強力な利点があります。

ここで我々 の分析が定評のc. の elegansのホスト変化を調査する使用されている方法を紹介-緑膿菌液殺害病態システム。よく働いたこの技術のいくつかの拡張機能を紹介します。たとえば、我々 は 24 または 96 ウェルで RNAi を用いた高スループット遺伝スクリーンをこのホスト病原体の相互作用でクエリ ホスト要因にプレート フォーマットを運ぶことができます。この試金を使用して、可能性のある骨の折れるの生化学的な浄化方法を必要とせず、創薬のターゲットを識別するタスクを大幅に効率化できる、少数の月だけで全ゲノム スクリーンを完了できます。

我々 もここでグラム陰性病原菌膿のグラム陽性菌腸球菌を代替となる手法の変化を報告します。ずっと膿の場合に、腸球菌による殺害は時間依存です。以前c. の elegansのとは異なり、腸球菌の試金、我々 の分析腸球菌は、preinfection を必要としない、その安全性の向上、液体処理機器の汚染の可能性を減らすこと。試金は非常に堅牢な 〜 95% 死亡率 96 h ポスト感染を示します。

Introduction

身分証明書と有効な広域スペクトル抗生物質の開発今ほぼ世紀前に、公衆衛生における重要な分岐点につながった病気は過去の惨劇になる感染が広まった信念があった。いくつかの短い十年以内この楽天主義は病原体病原体がこれらの一度奇跡的な治療法が限られて抵抗機構を開発した後として、衰え始めた。いくつかの時間のため、薬剤の発見の努力と病原体の間の軍拡はバランスの取れたように見えた。しかし、抗菌薬の誤用は最近肺炎桿菌、アシネトバクター属 baumanii、セラチア、および膿^{1、パン薬剤耐性菌の出現に結実して 2,3,4}。

膿は、人免疫不全状態、または嚢胞性線維症のある重症の熱傷患者へ深刻な脅威である日和見のグラム陰性、マルチホスト菌です。それはまたますます特に抗菌薬耐性の継続的な買収のための深刻な院内感染の原因となるエージェントとして識別されます。この脅威に対処するには、我々 は、定評のc. の elegans-膿感染システム⁵を使用しています。私たちの研究室⁶ホストを殺すために病原体の能力を制限する新規化合物を識別するために液体ベース、高スループット、高コンテンツ スクリーニング プラットフォームを開発するこのシステムが活用されています。興味深いことに, これらの化合物は抗菌剤⁷および病原性阻害剤⁸を含む少なくとも 3 つの一般的なカテゴリに属しているようです。線虫c.エレガンス他高コンテンツ薬物検出アッセイ結核菌 tuberculosum、クラミジア ・ トラコマチス、仮性結核菌、リステリア菌、野兎病菌、黄色ブドウ球菌、カンジダ ・ アルビカンス、報告されていると腸球菌、他の中で^{9,10、11,12,13,14,,1516}。これらの種類のアッセイのホストと病原体、化学画面とを超えてヒットを識別する能力に比べてバイオアベイラビリティの可能性の増大に有毒かもしれない誤検出の制限など、いくつかのよく知られている利点があります。単に反 virulents、免疫促進分子、またはそれ以外の場合前者を支持して宿主-病原体相互作用のバランスを傾ける化合物など、微生物の増殖を制限すること。さらに、これらの画面で発見された化合物は、哺乳類のホストで効果的。

それは、少なくとも 2 つ他の試金^17,18が液体にc. の elegansの高スループット画面を実行する使用できることは注目に値するです。しかし、これらのアッセイのそれぞれは液体で実行する遅い殺害として知られている、典型的な腸の植民地化アッセイができる変更のスループットが向上しより容易に選別する化合物。慎重に評価は決定的な細菌の病原性のメカニズムがこれらの試金および液体ベースのスクリーン⁷間で異なっていることを示しています。病原性の両方のタイプは、哺乳類システムで観察される、ので、アッセイの選択前に実験者の利益に最も関連するどの病原性を規定を検討することが重要です。

液体ベースの最適化されたバージョンを示すC. elegans P. 緑膿菌の試金。グラム陽性の細菌の病原体に対応する液体を用いた測定手法の適応を述べる腸球菌。膿のようなe. フェカリスますます深刻な院内の脅威として抗菌薬耐性経路¹の成長している兵器で識別されます。腸球菌の高速スクリーニング法の前に¹⁴が存在する病原体は、手順が複雑になりますし、COPAS FlowSort のような機器に汚染の可能性が高くなると preinfection が必要です。提案プロトコルの安全性プロファイルを改善、感染前の必要があります。最後に、これらのアッセイのいずれかは、確立の役割を果たすホストの要因を検索するユーザーを許可する RNAi や感染に対する抵抗性を餌と併用できる手段を報告します。

Protocol

注意:膿と腸球菌バイオ セーフティ レベル 2 の病原体は、偶発的な感染を防ぐため、表面の汚染を最小限に抑えるため、適切な安全対策が取られなければなりません。すべてのメディアや病原体と接触する材料を滅菌または破棄する必要があります。CDC の文書バイオ セーフティの微生物学的および生物医学研究所 (BMBL)、第 5 版からさらにガイドラインがあります。

1. 準備や膿のメンテナンス

1. ストリーク (ホストゲノム スープ) LB 寒天培地プレート冷凍ストックから膿。37 ° C で 16 ~ 24 時間インキュベートします。
   注: は、BSL 2 生物学的安全キャビネットの無菌性を確保するための内部の膿の実験を行います。病原菌の感染や汚染の可能性を最小限に抑えるために適切な安全予防策を使用します。
2. このプレートを 4 ° C に転送します。このプレートを 4 ° C に保持し、1 週間文化を接種するために使用可能性があります。1 週間後染しプレートを破棄し、新しい LB ストリーク プレートを作る。
   注: P. 緑膿菌の病原性は、長期貯蔵後低下します。
3. アッセイ プレートを設定する前に 2 日間は、1.1 で作られたプレートから膿の単一コロニーを滅菌流体培養基 LB の 3-5 mL を接種します。12 に 16 h の 37 ° C で孵化させなさい。
   注: はない 16 h 以上孵化させなさい。豊富な液体培養膿PA14 は溶解を開始します。
4. 遅い殺すメディアで滅菌 10 cm プレートを準備 (3 g, 塩化ナトリウム 3.5 g ペプトン, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgSO₄、25 mL のリン酸バッファー (1 リットルあたりの量: 132 mL K₂HPO₄ (1 M)、868 mL KH₂PO₄ (1 M)) と 18 g 寒天/L)。
   注: 事前にプレートを準備します。4 ° C で気密の容器で 3 週間まで格納できます。
5. 各 10 cm 低速殺すプレート (SK) を新鮮な一晩 LB 文化から緑膿菌 350 μ l をシードします。滅菌細菌拡散機を使用すると、メディアの表面を渡って均等に細菌を広げるし、BSL 2 生物学的安全キャビネットで乾燥することができます。
6. 24 h の 37 ° C でプレートを孵化させなさい。

2. RNAi 細菌の準備

1. うち連勝またはピン転送希望凍結ストックから適切な抗生物質 (100 μ g/mL で carbenicillin) と Ahringer やヴィダル ライブラリ 15 μ G/ml にテトラサイクリンを含む LB 寒天培地プレートに RNAi を含む細菌系統。
   注: 非病原性細菌を扱う場合を使用、BSL 2 A/B の生物学的安全キャビネットまたは BSL 1 層流フード文化の無菌性を確保するため、ライブラリの交差汚染の可能性を最小限にします。
2. 37 ° C で 24 時間の版を孵化させなさい
3. 2 週間の 4 ° C でプレートを格納します。
   1. 2 週間後、プレートを破棄し、たての板に置き換えてください。
4. 並列で複数の RNAi 系統をテストするには、carbenicillin 補足ポンド、24 ウェルのディープ ウェル プレートのシングルで 4 mL にまたは滅菌試験管に各クローンから単一コロニーを個別に接種します。
   注: テトラサイクリンは RNAi の効率が低下する報告されています。このメディアには使用しないでください。
5. Multiwell プレートの最適振動定温器に 24 井戸ディープウェル プレートを置き、950 rpm で揺れながら 16 h の 37 ° C で孵化させなさい。
   注: それは従来の振動インキュベーターを使用して multiwell の板で均一の細菌の増殖を取得するは難しいです。揺れのインキュベーターは、正常に成長する文化のために 750 rpm 以上で振ることができる必要があります。専用シェーカーがない場合は、個々 の管でそれぞれの文化を育てることは可能です。文化は、必要な場合、遠心分離後、24 ウェル プレートに転送できます。
6. 2,000 x g で 5 分間遠心分離によって細菌を収集します。
7. 上清をデカント プレートを反転、活発に揺することによって。RNAi の S の基底 (5.85 g 食塩 1 g K₂HPO₄, 6 g KH₂PO₄純水 1 L に溶解し、オートクレーブで滅菌) 100 μ L の細菌を再懸濁します。
8. Multiwell NGM プレートの井戸の適切な数にピペットの再懸濁の細菌 (マツ材線虫病の成長媒体、3 g, 塩化ナトリウム 2.5 g ペプトン, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgSO₄、25 mL のリン酸バッファー (1 リットルあたりの量: 132 mL K₂HPO₄ (1 M) の868 mL KH₂PO₄ (1 M))、水 1 リットル当たり 18 g 寒天) IPTG (最終濃度が 1 ミリメートル) と carbenicillin (100 μ g/mL 最終濃度) 補われます。
   1. 6 ウェル プレート、24 ウェル プレートのウェルあたり 1 mL または 150 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートのウェルあたり 3.5 mL NGM メディアを使用します。
   2. 6 ウェル プレートを 100 μ L/ウェル菌を使用します。50 μ L/ウェル; 24 ウェル用または 20 μ L/ウェルの 96 ウェル プレート。乾燥することができます。
      注: 急速、均一な乾燥を促進するため滅菌流フードでは、乾燥が行われる通常。均一乾燥は、非常に重要です。寒天のひび割れを促進するワームの穴を掘る、過剰乾燥は避けてください。これは、ワームの損失および液体ハンドリング システムの潜在的な詰まりに します。
9. すぐに準備されたプレートを使用してまたは 2 週間後で使用のための 4 ° C で保存します。
   注: を乾燥から防ぐためにプレート、プラスチック パラフィン フィルムで密封したり少し湿らせたペーパー タオルでしっかりと密封されたコンテナーに配置されます。

3. メンテナンスと線虫の準備

注: 実験を開始する前に妊娠、アダルト的雌雄同体ワームの同期された人口をとおり生成します。

1. 洗って妊娠からの大人 (すなわち、生殖腺内で目に見える複数の胚を) 4 6 10 cm NGM プレート プレート、優しく、旋回し、15 mL の円錐管に注ぐ S 基底の 4 つの mL を追加して 15 mL の円錐管に。
2. 1,000 x g で 30 秒間遠心分離を介してワームをペレットします。
3. ワームのペレットを妨害しないように世話上清を吸引します。
4. ワームの漂白剤の解決の 3.5 mL を追加 (最終濃度 0.5 M NaOH、1% ナトリウム次亜塩素酸、滅菌水で) ワーム ペレットとミックス 1分間反転します。
5. 簡単に渦と 1,000 x g で 30 秒間遠心します。
6. 吸引またはワーム ペレットを邪魔しないように世話、上清をデカントします。
7. ワームの餌に 3.5 mL の新鮮なワーム漂白剤溶液を追加します。
8. 積極的に漂白剤溶液でワームをミックスします。定期的に (約 10 秒) が視覚的に解剖顕微鏡の下でワームを検査します。卵を解放を破るワーム キューティクルを監視します。成虫のほとんどは溶存 (~ 95%) をされている、消化を停止する基底 S と 15 mL に漂白剤を希釈します。
   注: 卵の殻は、成体よりも漂白剤に抵抗力があるが、長時間露光中に解散することができます。卵解散を避けるためには、7 分以上の漂白剤溶液をワームの卵を公開しません。卵の殻が過度に破損している場合は、胚が死んでしまいます。
9. 30 秒間 1,000 x g で胚をペレットし吸引または胚のペレットを削除せず、上清をデカントします。
10. 残りの漂白剤溶液を希釈する 15 mL の最終巻に基底 S でワームを再懸濁します。
11. 4 連続洗浄の合計のための洗浄のステップ (3.9 3.10) 3 回を繰り返します。
12. 4 その後、上清を吸引し、滅菌 S 基底 15 mL の円錐管に 5 または 6 mL 追加します。目的は、〜 50 μ L 当たりワームの濃度に胚を再懸濁します。
    注: S 基底の量によって異なります; 卵ペレットのサイズなるほどのペレットより S 基礎必要です。
13. 一晩常温でテーブル トップ回転子または 15 ° C で 48 h に円錐形の管を孵化させなさい幼虫が孵化、幼虫の発育、栄養欠乏による L1 段階 (L1 休眠) で逮捕。
14. それらのほとんどが孵化、開発の L1 段階で逮捕されたことを確認する解剖顕微鏡下で胚を確認します。
15. ワームの準備の 20 μ L を取り、S 基底の 80 μ L で希釈によってワームの数を決定します。空白 NGM プレートに直接希釈ワーム液の 10 μ L をピペットします。2 回を繰り返します。
    1. 各スポットで幼虫の数し、平均数を決定します。ワームはワームの準備で μ 1 のおおよその数を取得する 2 でこの平均値を除算します。ワームの準備は、伝搬板または実験のために、使用できます。
       注: 4-5 日後飢えた幼虫が死ぬことを始めます。この時点で、準備を破棄します。
16. ひずみを反映するためピペット 3 4 10 cm NGM プレート L1 ワーム (5,000-6,000) の適切な数の斑点のある集中 OP50大腸菌- "superfood"(エシェリヒア属大腸菌OP50 が 25 倍の濃度で発見 (すなわち、 1 L の一晩 OP50LB の栽培文化収率 40 mL スーパー フード X OP50 25 の);この濃厚の細菌懸濁液 2 mL、NGM にある各 10 cm のプレートに斑点を付ける)。
17. 実験のプレートを準備をするには、(「基本的なプロトコル」使用 3.17.1 の設定、「RNAi スクリーニング設定"の使用手順 3.17.2 - に応じて 3.17.4) 次のいずれかの操作を行います。
    1. ピペット 〜 5,000 ワーム/10 cm プレート RNAi や OP50 スーパー フードを播種します。
    2. ピペット 〜 ワーム/井戸 6 ウェル プレートで 500 は RNAi でシードします。
    3. ピペット 〜 300 ワーム/ウェル 24 ウェル プレートでは、RNAi でシード。
    4. ピペット 100 〜 ワーム/ウェルの 96 ウェル プレートは、RNAi でシード。
       注: RNAi がシードだった方法について手順 2.7 2.9 RNAi 菌の準備を参照してください。
18. ワームの肥沃なひずみを使用している場合孵化させなさい 44 〜 48 使用のための 25 の ° C でワームこれらのワーム、できるだけ早く人口が適切な年齢に達した後。これは、アッセイの中にワーム内孵化卵の影響を最小限に抑えます。
19. ひずみを使用している場合は滅菌温度 (例えば、fer-15(b26);fem-1(hc17)またはglp-4(bn2))、15 ~ 16 h ° C でワームをインキュベートし、開発を完了し、胚発生を防ぐ 44 h の 25 ° C に転送。

4. 液体測定セットアップ (基本的なプロトコル) を殺す

注: これは 1 つの菌株とワームの 1 つのソースのためのプロトコルです。

1. SK プレートから膿を削除し、で再懸濁します細胞スクレーパーを使用して、~ S 基底の 5 mL。スケール アップに必要な場合。(外径 φ₆₀₀) 分光光度計を使用して細菌懸濁液の光学密度を測定します。
2. S 基底で OD₆₀₀ ≒ 0.09 (3 X 最終濃度) で膿の希薄化後の株式の 24 mL を準備します。4.6.2 好評につき、最終的なコンテンツを参照してください、それに応じて細菌希釈量を拡張します。
3. 21 mL 液体低速を殺すメディア (3 g, 塩化ナトリウム 3.5 g ペプトン/l CaCl₂と MgSO₄最終濃度 1 mM 添加) を追加します。マルチ チャンネル ピペットを使用すると、384 ウェル プレートの各ウェルに細菌やメディアの 45 μ L を転送します。
4. 50 mL の円錐管にソース (すなわち、ステップ 3.17.1) からワームを洗浄し、重力の力の下で解決するワームを許可します。5 mL に上清を吸引します。基底の 50 mL の S の合計で再懸濁します。
5. 4.4 の手順を 2 回繰り返します。
6. ワームの並べ替えアイコンを使用して、並べ替える 384 ウェル プレートの各ウェルに約 22 ワームです。
   注: セットアップは、液体の ~1.1 μ L の各ワームを削除します。22 ワーム 25 μ L、70 μ L/ウェルに総試金ボリュームをもたらすことになるだろう。
   1. 各ウェルの最終組成物から成っている 70 μ。 45 μ l このボリュームの、細菌の培地として追加されます (24 μ S 基底部、および 21 μ l SK で 0.03 外径₆₀₀細菌は CaCl₂と MgSO₄補足)。その他の 25 μ L が 22 のワームに追加されます。
   2. ソーターを使用する場合ここで (材料の表を参照) は使用できません、ワーム 1 ワーム/μ L の S の基底と戻 25 μ L/ウェルは、マルチ チャンネル ピペットを使用しての最終濃度に希釈できます。しかし、結果は高められた可変性を示すことがあります。レオンと同僚の¹⁹のとおりまた、ぜん動流路内の液体ディスペンサーを使用することが可能です。
7. 384 ウェル プレートにワームがソートされているガス透過性フィルム プレート シール、25 ° C 24-48 h でプレートを孵化させなさい。
8. 希望の時間に S 基底と 384 ウェル プレートを洗浄するのに合計 5 回マイクロ プレート ウォッシャーを使用します。
   1. 第 2 洗浄後メディアのほとんどを吸引、井戸の底から任意の破片を緩めるに、少なくとも 30 秒間マイクロ プレート vortexer を使用して板を振る残して 〜 20 μ L. 積極的に)。
9. 最終的な洗浄、吸引清 0.98 μ M 核酸の 20 μ L。 追加 50 μ まで染色 (材料表参照) 後/384 ウェル プレート、0.7 μ m の最終的な集中のための。
10. 12-16 時間室温で孵化させなさい。この染料は死んでワームを汚れるだけ。必要な潜伏期間後洗浄皿マイクロ プレート ウォッシャーを使用して任意の過剰を削除する染色 (最低 3 洗浄) です。
11. データ集録、画像の透過光と蛍光 (531 nm 励起と 593 の排出) を分光光度計や自動顕微鏡を使用します。
    1. 低倍率の目的を使用すると、キャプチャする全体の井戸の画像を許可できます。
    2. また、フローの vermimetry を使用します。この手法は、測定サイズと全体の生物 (すなわち、 c. の elegans) は cytometry 流れに強く類似しているファッションの蛍光ワーム蛍光としてラージ オブジェクト フローサイトを使用します。
12. 自動画像解析ソフトウェア (CellProfiler、MatLab http://cellprofiler.org/に基づいて無料の画像分析スタジオ) などを使用して公平なファッションによくあたり蛍光および合計のワームの面積を求めます。
    注: これらの数値の商各ウェルの分数死を表します。1 つをも持っていた場合 7 染色 20 のワーム、合計分数死 0.35 または 35% を構成し、.
    1. 初めて使用する前は、自動画像処理パイプラインは手動スコアリングによって検証される必要があります。これは、視覚的に画像を検査し、それらのそれぞれに死んでワームの分数を記録によって得られたスコアに自動化されたパイプラインからの結果を比較することによって行われます。検証プロセスは、自動画像処理のパラメーターは正確であり、データを正しく表すことを保証します。

5. スクリーニング複数線虫株またはノックダウン (RNAi 画面セットアップ) の適応

注: これは 24 ウェル プレート セットアップの説明されている RNAi スクリーニングです。

1. S 基底 24 ウェル プレートのウェルあたり 1 mL を追加 (手順 3.17.3 参照)。優しくプレートを揺することによってワームを扇動し、空、滅菌 24 ディープ ウェル プレートにワームを転送します。重力 (~ 5 分) を解決するワームを許可します。
2. 約 1 mL を残して上清を吸引します。7 mL の S の基底を各ウェルに追加します。
3. 2 回以上の手順 5.1 5.2 以上を繰り返します。最終的な洗浄の後に、約 400 μ L を残して上清を吸引します。
4. ワーム ソーターのリサンプラ関数を使用して、(24 ウェル プレート利回り 8-12 の井戸は 384 ウェル プレートの各ウェル) 384 ウェル プレートの各ウェルに 24 ウェル プレート ワーム サスペンションから 22 ワームを並べ替えます。
   1. 飢餓を避けるためには、細菌の 384 ウェル プレート (OP50 などの食品としてのみ機能するひずみまたは病原性株) に並べ替えする前にピペットします。
      注: 2.3 2.5 または 6.4 6.5 では、次の手順と食料源の細菌を希釈、膿と同じスキームを次に追加できる病原体を追加できます。
5. ワームは、384 ウェル プレートにソートされている後、は、小さな分子やその他特定の実験材料を追加します。

6。腸球菌の適応

メモ:膿アッセイからの差分のみが表現されます。

1. 腸球菌の新鮮なソースを準備する (脳心臓注入) BHI 寒天培地プレート上に凍結ストックから細菌をストリー キングし、37 ° C で 16 ~ 24 時間インキュベート
   注: は、BSL 2 生物学的安全キャビネットの無菌性を確保するための内部の腸球菌の実験を実行します。病原菌の感染や汚染の可能性を最小限に抑えるために適切な安全予防策を使用します。
2. プレートは、4 ° C で 1 週間保存できます。この期間の後、新鮮なプレートで置き換えます。
3. ワーム、並べ替え前に、の晩は 3 ~ 5 mL を接種する単一コロニーを滅菌 BHI e. フェカリス。撹拌で 37 ° C で 12-16 時間孵化させなさい。
4. 膿(S 基底、外径₆₀₀≈0.09 で 3 x 細菌) は井戸に細菌を追加します。
   注: e. フェカリス、ためよくの最終的な組成です: e. フェカリス(外径₆₀₀≈0.03)、BHI = 10 %v/v の S の基底で構成された残りのボリューム。覚えているワームを 25 μ L の S の基底が届けられます。
   注: e. フェカリスは、ぼやけた画像の原因と蛍光染色を吸収するバイオ フィルムの厚さを生成します。広範な洗浄は、このバイオ フィルム除去に十分かもしれません。この場合、ワームは、マルチ チャンネル ピペットを使用して空のプレートに転送できます。転送を容易にするには、最終濃度 0.1% (v/v) トゥイーン 20 の S の基底に S の基底には、トゥイーン 20 が追加できます。バイオからワームを除去するに役立ちます。

Results

分析パフォーマンスのための重要なパラメーター

トラブルシューティングと分析を最適化するために必要なこの試金の基礎となる生物学の正しい理解が。そのために、私たちを参照してください最初いくつか主要なペーパー,緑膿菌の発症のメカニズムを解明-リキッド^7,20で殺害を介する。上記で説明した手順に従っている (試金のプロトコルの概略は図 1を参照)、線虫の時間依存の殺害は (図 2 a) 病原体の存在下でのみ観察します。対照的に、キーの栄養補助食品 (例えばペプトン、メディアから外されますのみ S 基底が追加された場合) がない場合は、ほとんどない殺害が観察...

Discussion

この試金 (または他の病原体が膿や腸球菌の代わりに使用と同様の試金)、様々 な創の目的に役立ちます。また、特定病原因子、ホストの防衛の経路の解明と宿主-病原体相互作用に関わる規制機械を決定するなどの基本的な生物学的問題に対処するため便利です。

膿液殺害アッセイは、堅牢な失敗の可能性を最小限に抑えるための細心の注意の支払われる、いくつかのポイントがあります。まず、前述のように、細菌は LB で一晩成長にもかかわらず、病原性を失うしないように膿予防接種のため細菌ソース プレートは、新鮮ななりません。第二に、カルシウムとマグネシウムが膿の試金を殺すに追加されていることを確認するキーであります。それがなければ、病原性が著しく低下します。最後に、それは HT115 (RNAi に基づく試金) の飼育ワームはワーム飼育 OP50 以降大幅死んでしまうことは注目に値する (N. キリエンコ、パーソナル通信)。このため、RNAi ベースの研究に切り替える場合は、経験的に試金のための最高の時間ポイントを判断する...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
COPAS FP BioSorter	Union Biometrica		ラージオブジェクトフローサイトメーター/ワームソーター
Cytation 5	BioTek
EL406 ウォッシャーディスペンサー	BioTek
Multitron Pro	Infors HT
24 ディープウェル RB ブロック	サーモフィッシャーサイエンティフィック	CS15124
384ウェルプレート	GreinerBio-One	MPG-781091
線虫増殖培地(NGM)			1リットルあたりの量:18グラムの寒天、3グラムのNaCl、2.5グラムのペプトン、1 mLのCaCl<サブ>2(1 M)、1 mLのMgSO<サブ>4(1 M)、25 mLのホスペイトバッファー、および973 mLのMilli-Qウォーター
スローキリング(SK)プレート			1リットルあたりの量:18グラムの寒天、3グラムのNaCl、3.5グラムのペプトン、1 mLのCaCl<サブ>2(1 M)、1 mLのMgSO<サブ>4(1 M)、25 mLのホスペイト緩衝液、および973 mLのミリQ水
スローキリング(SK)メディア			リットルあたりの量:  3グラムのNaCl、 3.5グラムのペプトン、1 mL CaCl2 (1 M)、1 mL MgSO4 (1 M)、25 mL リン酸緩衝液、および 973 mL の milli-Q 水
Lysogeny Broth (LB)	USBiological Life Sciences	L1520
Brian Heart Infusion Broth (BHI)	Research Products International Corp	50-488-526
Worm Bleach Solution			100 mLあたりの量:10 mLの5 M NaOH溶液、20 mLの5%次亜塩素酸ナトリウム溶液、および70 mLの滅菌水
Sリットルあたりの基礎			量:5.85グラムNaCl、6グラムKH2< / sub > PO4< / sub>、1グラムK2< / sub>HPO4< / sub>、 1リットルのミリQ水
寒天	USBiological Life Sciences	A0930
NaCl	USBiological Life Sciences	S5000
Peptone	USBiological Life Sciences	P3300
CaCl2	USBiological Life Sciences
MgSO4	Fisher Scientific	M63-500
リン酸塩緩衝			液量:132 mLのK2HPO4(1M)および868 mLのKH2PO4(1M)
KH2PO4	Acros Organics	7778-77-0
K2HPO4	USBiological Life Sciences	P5100
5%次亜塩素酸ナトリウム溶液	BICCA7495.5-32
NaOH溶液	フィッシャーサイエンティフィック	SS255-1
呼吸が楽	な多様化バイオテクノロジー	BEM-1
SYTOXオレンジ核酸染色	フィッシャーサイエンティフィック	S11368
Bacterial Strains
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis(OG1RF)
大腸菌スーパーフード (OP50)
E. coli RNAi 発現細菌 (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)