マウス骨髄由来の樹状細胞とマクロファージの蛍光融合タンパク質の発現

サマリー

この記事では骨髄での蛍光融合蛋白質の表現のための詳しいプロトコル由来樹状細胞とマクロファージを提供します。手法は骨髄の伝達レトロ ウイルス構造続いてマクロファージへの分化と樹状に前駆細胞の in vitro細胞します。

要約

樹状細胞やマクロファージは、病原体に対する防御の最初の行を形成する重要な細胞です。彼らはまた、適応免疫応答の開始に重要な役割を果たします。これらの細胞と実験的な作品はかなり困難です。彼らの豊富な臓器や組織には比較的低いです。その結果、彼らは大量に分離することはできません。また、cDNA の構造と transfect に困難です。マウス モデルにおけるこれらの問題は、M-CSF のマクロファージや樹状細胞に GM-CSF 存在下で骨髄前駆細胞から生体外で分化によって部分的に解決できます。この方法で非常に少数の動物から多量のこれらのセルを取得することが可能です。また、骨髄前駆細胞は、骨髄由来の樹状細胞とマクロファージに分化させ前に栽培の初期段階中に cDNA の構造を運ぶレトロ ウイルスのベクトルを使用導入できます。したがって、これらのセルのさまざまな cDNA の構造を表現するための in vitro分化続くレトロ ウイルスの伝達を使用できます。実質的に異所性の蛋白質を表現する能力は、蛍光タンパク質、タンデム精製インタラクトーム解析、構造機能解析のための生きているセルイメージ投射を含むこれらのセルに対して実行できる実験の範囲を拡張します。バイオ センサーおよび他の多くの細胞の機能を監視します。この記事では蛍光付けられた蛋白質のためのコーディングのベクトルとマウス骨髄由来の樹状細胞とマクロファージのレトロ ウイルスの伝達のための詳しいプロトコルについて説明します。OPAL1 と PSTPIP2、2 つのアダプター蛋白質の例には、フローサイトメトリーと顕微鏡でその実用的なアプリケーションを示します。利点とこのアプローチの限界についても述べる。

概要

骨髄系細胞は、病原体に対する私達の防衛メカニズムの不可欠な部分を表します。彼らは急速に死細胞と同様に、微生物を除去することができます。さらに、彼らは組織開発・修理調整や恒常性^1,2,3を維持に関与しています。すべての骨髄細胞は骨髄で一般的な骨髄前駆細胞から区別します。多くの機能的および形態学的に明瞭なサブセットに分化させサイトカインとのさまざまな組み合わせの⁴によって制御される大規模な程度です。好中球の顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、最も集中的に調査の骨髄細胞のサブセットが含まれます。これらの集団のいずれかの欠陥は、潜在的に生命にかかわる結果とヒトとマウス^1,2,3,5,の免疫システムの機能不全を深刻な原因につながる⁶。

異なり、好中球の顆粒は、樹状細胞やマクロファージ、組織細胞と免疫器官における生息が比較的低い。その結果、分離・精製主樹状細胞と多数のこれらのセルを必要とする実験のためマクロファージは高価で、多くの場合不可能です。この問題を解決するために大量の同種のマクロファージや樹状細胞の培養を取得するプロトコルが開発されています。これらのアプローチは、サイトカインの存在下での骨髄細胞の分化に基づいています: マクロファージ コロニー刺激因子 (M-CSF) マクロファージや顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF) の Flt3 リガンドの樹状細胞^{7,8,9,10、11,12}。このメソッドによって生成された細胞は、骨髄由来マクロファージ (BMDMs) と骨髄由来樹状細胞 (黒谷) は、文献のとおり一般的です。彼らはプライマリ マクロファージまたは対応する細胞より樹状細胞と共通の生理学的プロパティがあります。もう一つの主要な利点は、遺伝子これらの細胞の形態を得る可能性変更マウス¹³です。野生型細胞間比較研究し、遺伝子改変マウス由来の細胞は、遺伝子の発見の新しい機能または興味の蛋白質のために重大。

生きている細胞の蛋白質の細胞内局在性の解析には、体内の興味の蛋白質に蛍光ラベルの結合が必要です。蛍光蛋白質に (多くの場合短いリンカー) を介して結合解析タンパク質から成る遺伝的コード化の融合構造を表現することにより、最も一般的これ (e.g、緑の蛍光蛋白質 (GFP))^14,15 。^,16. 樹状細胞やマクロファージの蛍光付けられた蛋白質の表現は難しい。これらの細胞は一般的に transfect に困難で標準的なトランスフェクション プロシージャによって、効率は非常に低い傾向にあります。また、遺伝子導入は一時的なもの、細胞ストレスを生成する、蛍光の強度を実現した顕微鏡¹⁷のためできない可能性があります。十分な骨髄前駆細胞にレトロ ウイルスの感染、遺伝子発現レベルでこれらの細胞の合理的な割合を得るためにベクトルと BMDMs や黒谷にそれに続く分化が非常に効率的ななっています。アプローチ。それは彼らのネイティブ セルラ環境、定常状態または貪食能、免疫シナプス形成や移行など免疫反応にとって重要な工程で骨髄由来のタンパク質の解析ができました。ここでは、マウス骨髄由来マクロファージと樹状細胞に関心の蛍光タグ付きタンパク質を安定に発現を可能にするプロトコルについて述べる。

プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、チェコ共和国の科学アカデミー、分子遺伝学の研究所の実験動物福祉の専門家委員会によって承認されています。

1. 試薬の準備

1. アンモニウム塩化カリウム (ACK) バッファーを準備します。DdH₂O の 500 mL を加える NH₄Cl の 4.145 g 及び 0.5 g KHCO₃の 0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を 100 μ l 添加し、フィルター滅菌します。
2. ポリエチレンイミン (PEI) ソリューションを準備します。DdH₂O. 90 mL に PEI の 0.1 g を追加します。を攪拌しながら pH が 2.0 未満になるまで 1 M 塩酸を滴下し追加します。3 時間までペイを溶解するまで撹拌、7.2 1 M NaOH で pH を調整します。フィルター滅菌し、ddH₂O と 100 mL にボリュームを調整します。1-2 ml をし、-20 ° C で保存
   メモ: 解凍後、プリンスエド ワード島が 4 ° C で 2 週間まで保存できるが、再固定されません。
3. M-CSF や GM-CSF を含む細胞培養上清を準備します。これらの培養上清を前もって作っておくと-80 ° C で保存することができます。これらの培養上清をするためには、合流点に 10 cm シャーレ ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) でのサイトカイン産生細胞 (GM-CSF ¹⁸ J558 細胞) や M-CSF ¹⁹CMG 14-12 細胞を成長します。T150 培養フラスコや文化のメディアの 200 ml 5% CO₂でさらに 4 日間のすべてのセルを転送 37 ° C0.2 μ m フィルターで清とフィルターを収集します。因数を行いこれら-80 ° C で保存
4. 細胞培養液を 100 mL を準備: 10 %dmem 熱不活化 FBS と GM-CSF (腎不全分化) 用または M-CSF (BMDM 分化) の分泌細胞から培養上清を携帯します。
   注: これらの培養上清中のサイトカインの量は変わることができます、使用濃度は、経験的に決定します。通常、GM-CSF (推奨される開始濃度は 2%) または CMG から上澄みを 5-10 %14-12 細胞 M-CSF (推奨される開始濃度は 10%) の生産を作り出す細胞からの 2-3% 上清を使用します。また、商業的精製 10 ng/mL で利用可能な M CSF と GM-CSF 20 ng/ml で使用できるサイトカインを含む上清、すなわち実質的に同一の結果、分化、感染効率の速度には影響なし。EGFP タグ構造体の細胞内の局在化。ペニシリンなどの抗生物質、特に明記しない限り、細胞培養プロトコルのすべてのステップでは G (100 IU/mL)、(100 μ g/mL)、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン (40 μ G/ml) を使用できます。

2. レトロ ウイルスの生産

注意: retroviral ベクトルはウイルスのベクトルの他のタイプと比較されたとき比較的安全、彼らまだ安全を脅かす潜在的です。したがって、細心の注意と適切な保護具を使用して、すべての安全規制やウイルス粒子を操作するための法的要件に準拠するために重要です。

1. 10 cm シャーレでプラチナ エコ (ぷらっと-E) 包装細胞の単一細胞懸濁液をプレートし、15 ml の 10% を含む DMEM の育成政府短期証券の 50-60% 合流 (24 h) まで。細胞が単層成長する必要があり、文化の塊を形成してはいけません。
2. レトロ ウイルスのコンストラクトのピペット 20 μ g (e.g。、pMSCV ベクターへの関心の蛍光タグ蛋白を発現する構造) および DMEM (せずに血清および抗生物質) 1 mL に²⁰をベクトルと優しく混ぜる pCL エコ包装の 10 μ g。
3. 2 番目の管に DMEM (血清と抗生物質) なし 1 mL に PEI の 75 μ L を追加します。室温 (RT) で 5 分間インキュベートし、両方の管の内容を一緒に混合し、室温でさらに 10 分間インキュベート
   注: pCL-エコの追加はオプションです。それはマウス白血病ウイルスエンベ ウイルス受容体のコーディングしておりウイルス力価を高める可能性があります。
4. 8 ml の 2% と新鮮な DMEMsupplemented のぷらっと-E 細胞の中に慎重に取り付けます FBS。事前使用前に 37 ° C の中を温めます。抗生物質は、トランスフェクション効率を減らすことができるので、トランスフェクション、時に抗生物質を使用しないでください。
5. 慎重にステップ 2.3 Plat E 細胞で作製した混合物を (低下) 追加し、37 ° C で 4 時間インキュベート
6. Plat-E 細胞 10% を含む予め温めておいた DMEM の 10 mL の培地を交換、孵化後 FBS、37 ° C で 24 時間細胞を養うとこの潜伏中にぷらっと-E 細胞メディアにウイルスが生成されます。
7. 24 h 後 5 mL ピペットを使用してプラチナ エコ セルからレトロ ウイルス粒子を含む媒体を収集し、(「上清 1「マウス白血病ウイルスエンベ レトロ ウイルス粒子を含む =) 15 mL 遠心管それを転送します。
8. ウイルス上清中にぷらっと-E 細胞による汚染を避けるためには、4 ° C で 5 分間 1250 × g で収集されたウイルスをスピンします。最良の結果ウイルスは感染症のためすぐに使用する必要があります。
   注: ウイルスの因数は、後で使用できる-80 ° C で保存もできます。しかし、それは伝達効率で特定の削減になります。それはウイルスの劣化につながるので、ウイルスの凍結/融解を繰り返しを避けてください。
9. 10% FBS Plat-E に細胞、37 ° C で 24 時間のもう一つの育成とに予め温めておいた DMEM の 10 mL を追加します。
10. 2.7 の手順を繰り返します。2.8。「清 2"を取得します。

3. 骨髄細胞の分離

1. 頚部転位またはその他の承認された方法を使用してマウスを犠牲に。70% のエタノールとマウスをスプレーします。
2. ピンセットとはさみを使って、後ろ足から肌だけでなく、筋肉の一部を削除します。大腿骨を壊すことがなく、股関節から寛骨臼を慎重に外します。足関節の足をカットします。70% のエタノールの骨 (大腿骨は脛骨に接続されている) をスプレーし、ペーパー タオルを使用して筋肉の残りの部分を削除します。
3. 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2% を含む 5 cm シャーレに骨を置く FBS (PBS-FBS)。 より多くの骨の準備している場合、維持処理まで氷の上シャーレ。
4. 栽培無菌性の確保、ティッシュ文化フードのすべての次の手順を実行します。
5. 大腿骨脛骨骨端 (曲げ膝関節とハサミで慎重にカット) を壊すことがなく分離します。
6. 骨の 1 つずつを処理します。ピンセットで骨を押しながら骨 (約 1-2 mm) の非常に小さい部分をハサミでカットします。
7. 30 G の針と 2 を使用して、または 5 mL シリンジ充填 PBS-FBS 15 mL 遠心管に骨の両端から骨髄細胞をフラッシュします。すべてのセルを削除するためにフラッシュの間に骨の中に針を移動します。針が詰まって取得する場合、は、それを変更します。
   注: 骨をフラッシュ中に白に赤から回す必要があります。これは細胞の大半が骨から削除されたことを示します。骨ごと PBS FBS の約 2-3 mL を使用します。
8. 4 ° C で 5 分間 500 x g で細胞を遠心分離します。
9. 上澄みを廃棄し、室温で 2-3 分の ACK バッファーの 2.5 mL にペレットを再で赤の血液細胞を溶解させます。溶解中に 15 mL の新鮮な centrifug チューブに 100 μ m 携帯こし器を通って骨髄細胞をフィルターします。PBS FBS の 12 mL を追加することによって、緊張を復元します。
   注: は、細胞死を回避する ACK バッファーと低張性換散の 5 分を超えないようにします。
10. すぐに 4 ° C で 5 分間 500 × g で遠心します。

4. 骨髄細胞分化骨髄由来マクロファージ

1. 10 %fbs と抗生物質 DMEM で骨髄細胞のペレットを再懸濁します (手順 1.4 後のメモを参照してください。 抗生物質濃度) のセルをカウントすると。BM への分化は、マクロファージを派生、プレート 5-10 × 10⁶骨髄細胞で、10 cm 非組織培養の手順 1.4 から血清と M-CSF と事前に用意された DMEM メディアの 10 ml (細菌) のペトリ皿を扱われます。
   注: 骨髄細胞の収量は約 4 x 10⁷ 6-8 週-古い c57bl/6 j マウス。
2. 5% CO₂、37 ° C で 3 日間インキュベート細胞文化のインキュベーター内のセル
   注: 最初の 2 日間非常に重要な見ていない細胞アポトーシス細胞数が多いは存在 (細胞骨髄系細胞に最終分化段階の細胞を区別することができません)。
3. 3 日後に、骨髄細胞培養が重要に見えてくる、細胞分裂のクラスターが形成されます。最初の付着性のセルが既に見られます。この時点で、新鮮なサイトカイン メディアで細胞を補います。
4. 各 10 cm シャーレに mL の血清と M-CSF (手順 1.4) から予め温めておいた DMEM 培地 10 を追加し、携帯文化のインキュベーターで返します。このステップの中に古いメディアを削除する必要はありません。
   注: 骨髄マクロファージは、5-7 日間の培養後完全に区別されます。収穫に最適な時間は、6-8 細胞の大半が付着し、ペトリ皿は完全に覆われている日です。
5. 5 日目、携帯文化フードにペトリ皿を取るし、メディアはほとんど料理の端に到達するまで皿を傾斜します。慎重に端面からメディアの 15 mL を取り出し、セルは、皿の真ん中にとどまる傾向があります。M-CSF に予め温めておいた媒体の同じボリュームを追加し、インキュベーターに皿を置きます。
   注: メディアは、ゆっくりと慎重に吸気は、セルがほぼ失われません。しかし、それも吸気メディアを遠心し、細胞を確認なしの非付着性文化に追加する可能です (すなわち。 不完全差別化) 細胞が失われる。
6. 実験では, 付着細胞 (マクロファージ) のみが使用されます。6 または 7 の日に細胞を収穫するには、すべてのメディアおよび浮遊細胞を削除します。血清なしに予め温めておいた PBS の一度皿を洗ってください。
7. Pbs は、0.02 %edta の 5 mL を追加し、組織文化のインキュベーターで 37 ° C で 3-5 分間インキュベートします。
8. 5 mL のピペットを使用して、皿で、ストリームの PBS-EDTA からセルを削除し、PBS の 25 mL と 50 mL の遠心管に配置します。必要な場合より多くの料理を一緒に分かち合います。
9. すぐに 4 ° C で 5 分間 500 × g で遠心します。
10. DMEM メディアで大食細胞ペレットを再懸濁し、セルをカウントします。(CD11b と F4/80) マクロファージ表面分化マーカーの発現をフローサイトメトリーによってを確認します。
11. 例えば懸濁液中に細胞を必要とする実験のため。、フローサイトメトリー実験、qPCR または西部のしみの分析の流れ、マクロファージを直接使用します。付着性マクロファージ実験、実験のセットアップに従って組織培養プレートの細胞をプレートします。
12. セルはすでに完全に区別されます。目的の実験用に最適のメディアまたは M CSF に元の増殖・分化のメディアでそれらを保ちます。
    注: 付着性マクロファージでの作業は、新しいそれらを転送の新規のサーフェスに完全な付着を許可するには (理想的には一晩) を使用する前に、少なくとも 6 時間をプレートします。浮遊細胞のごく一部は、実験の前に削除できます。

5. 骨髄細胞分化骨髄由来樹状細胞

1. 次の手順 5.2-5.4 で説明黒谷特定調整と BMDMs のプロトコルに従ってください。
2. 10 %fbs と抗生物質 DMEMsupplemented の骨髄細胞の得られたペレットを再懸濁します、(によってマクロファージ プロトコルの次のステップの 4.1) のセルをカウントします。樹状細胞への分化、プレート 1-1.5⁷骨髄細胞の 10 倍で、10 cm 非組織培養では、mL の血清と GM-CSF 事前に用意された DMEM 培地 10 での (細菌) ペトリ皿を処理 (手順 1.4.) から。
3. BMDM プロトコルのように同じ栽培手順を実行 (手順 4.3-4.5。 マクロファージ プロトコルの)。血清と M-CSF の代わりに GM-CSF DMEM メディアを使用します。黒谷の栽培時間が長いので (通常 10-12 日) 1-2 追加授乳 3 日間隔で (上清を除去し、追加手順 4.5 の説明に従って新しい栽培メディアを追加します。)。
4. プロトコルのこの部分は実質的にマクロファージ プロトコルの対応する部分と同じ (ステップ 4.6-4.12。 マクロファージ プロトコル)。実験のため付着性のセルだけを使用します。10-12, EDTA を使用して細胞を収集日にカウントし、新しい面板のそれら。樹状細胞の表面分化マーカーの発現を確認 (CD11c + CD11b + F4/80-) フローサイトメトリーによる。

6. BMDMs の興味の蛋白質をタグ付きの EGFP を表現する黒谷生産

1. ステップ 3.10 骨髄細胞のペレットを再懸濁します。10 %fbs と抗生物質添加 DMEM にしセルをカウントします。感染症 2-5 10 x を使用して、⁶ /6 ウェル培養ウェル BM 細胞の治療プレート。
2. 準備された DMEM メディアごとの 1 mL の細胞も、補完 BMDMs への分化の M-CSF もしくは GM-CSF 黒谷の差別化のためプレートが 37 ° C で 5% CO₂と組織文化のインキュベーターで 4-6 時間細胞を保つ
3. Polybrene (12 μ G/ml、添加後のセルに最終濃度 8 μ g/mL) を添加した新鮮な収集したウイルス (「上清 1」) の 2 mL を追加します。
   注: ウイルスを含む上清の冷凍の因数を使用もことができます、しかし、有効性は低くなります。
4. (徐々 に加速と減速) 30 ° C で 90 分間 1,250 x g でプレートを遠心します。その後、37 ° C で 5% CO₂で 4 時間インキュベートします。
5. オプション: 新鮮なの媒体含んでいるそれぞれサイトカイン (M CSF や GM-CSF) と 5% CO₂ 37 ° C で培養培地 2 mL を置き換える2 日目、培地 2 mL を削除し、2 ml の新鮮な収集したウイルス (「清 2」) 全体の感染手順 (ステップ 6.3-6.4) を繰り返します。
   注: この手順では、感染性が増加します。改善後 2 番目の感染症はセル型とターゲット蛋白質に私達の経験に依存して異なります 30% の増加効率の改善をまったくします。
6. 収集非付着性のセルは 15 mL 遠心管に移し、5 分間 (4 ° C) 500 x g でスピンします。上清を捨てます。
7. M-CSF や GM-CSF と培地 10 mL に細胞ペレットを再懸濁します、10 cm の組織培養処理ペトリ皿にセルを置き、37 ° c、5% CO₂文化します。10 cm の皿のためのセルの最適な数は 5-10 × 10⁶骨髄由来マクロファージおよび 10 x 10-15⁶ BM 由来樹状細胞。
   注: より小さい料理やプレート使用できますが、細胞の数をそれに応じて調整する必要があります。
8. マクロファージをに従って、樹状細胞の培養と分化のプロトコルは 4 と 5 の手順で説明します。

結果

シグナリングのアダプタータンパク質は通常小さい蛋白質の酵素の活動がないです。彼らは様々 な相互作用ドメインを所有している、または²¹チロシンのキナーゼ、ホスファターゼ、ユビキチンリ ガーゼを含むシグナル伝達に関与するモチーフ、他の蛋白質に結合の調停。このプロトコルの機能のデモンストレーションについては、骨髄球系細胞アダプター PSTPIP2 と OPAL1 が選ばれました。PSTPIP2 はよく特徴付けられてタンパク質²²炎症反応の調節に関与です。その F bar ドメインを介して細胞膜に募集するもことができる細胞質タンパク質です。第 2 蛋白質、膜貫通アダプター OPAL1、細胞膜に関連する予想です。生理機能はまだ不明です。ただし、急性リンパ性白血病で OPAL1 の発現はより良い予後²³に関連付けられます。

ディスカッション

標的細胞の興味の蛋白質の表現は、多くの種類の生物学的研究の重要なステップです。分化したマクロファージや樹状細胞が標準のトランスフェクションとレトロ ウイルス伝達技術によって transfect に困難です。これらの異所性 Cdna の発現を許可する重要なステップは、骨髄前駆細胞、分化に続いて彼らは既に目的の構造を運ぶときのレトロ ウイルス伝達のこれらの分化した細胞のトランスフェクションをバイパスします。細胞の種類。このメソッドの使用の成功の例は、私たちの最近の文書²⁵で見つけることが。ここでは、骨髄由来の樹状細胞とマクロファージがこのアプローチを使用して選択の構造を安定に発現を実現するコスト効率の高いプロトコルを提供します。提案する手順は、比較的安価な簡単なまだ非常に良い結果を提供することです。このプロトコルで使用する試薬も比較的厳しい予算の下で日常的な使用を可能にします。ぷらっと-E の transfection のためのプロトコルは、トランスフェクション試薬として PEI を採用しています。その他化学トランスフェクション エージェントと比較して、プリンスエド ワード島は非常に低コストの...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15028
Fetal usvine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270	メディア供給用
KHCO3	Lachema, Brno, Czech Republic	N/A
NH4Cl	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	A9434
ペニシリン	BBファーマAS、プラハ、チェコ共和国	N / A	PENICILIN G 1,0 DRASELNÁSOL' BIOTIKA
Streptomycin	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	S9137	Streptomycin sulfate salt powder
Gentamicin	Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové、チェコ共和国	N / A
ポリエチレン、線形、MW 25,000	Polyscience、ウォリントン、ペンシルバニア州、米国	23966
Polybrene	Sigma-Aldrich(メルク、ケニルワース、ニュージャージー州、米国)	H9268
EDTA	Sigma-Aldrich(メルク、ケニルワース、ニュージャージー州、米国)	E5134
PBS	、IMG ASCR、プラハ、チェコ共和国のメディア施設によって社内で作成	N/A
APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70	BioLegend (San Diego, CA, USA)	101212	フローサイトメトリー解析
PE 抗マウス F4/80 抗体, clone BM8	BioLegend (San Diego, CA, USA)	123110	フローサイトメトリー解析
APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418	BioLegend (San Diego, CA, USA)	117310	フローサイトメトリー解析
M-CSF	PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)	315-02
GM-CSF	PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)	315-03
Hoechst 33258	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	H1398	フローサイトメトリー分析 1-2 µグラム/mL