遺伝的変異、短期目標と交配試験場でRNA の形態学的組織コンテキストに点突然変異を可視化

サマリー

ここでは、単一細胞レベルで単一ヌクレオチド分解能で 50 ヌクレオチドとして短いシーケンスの特異的かつ高感度の検出を可能にするの in situハイブリダイゼーション アッセイについて述べる。手動でまたは自動的に実行できます、アッセイは、スプライスバリアント、短いシーケンス、および組織のコンテキスト内での突然変異の可視化を有効にできます。

要約

精密医学はバイオ マーカーの検出に依存、ので RNA バイオ マーカー測定現場で臨床検体で標準化された、堅牢なテクノロジが必要になってあります。挽くとバインドの試金のように RNAseq、定量的 RT-PCR 高感度遺伝子発現測定を有効にする、彼らはまた RNA の抽出を必要とする、形態の組織コンテキスト内で貴重な発現解析を防ぐため。ここで説明したその場で交配 (っぽい) のアッセイは、50 のヌクレオチド塩基の分解能で、単一セルのレベルの短い RNA ターゲット シーケンスを検出できます。この試金は開発済みの商業分析を補完するもの、スプライスバリアント、短いターゲット、および組織内の点突然変異の高感度および特定の in situ検出。このプロトコルでは、プローブは、EGFRvIII と METΔ14 2 つの臨床的に重要なスプライスバリアントのユニークなエキソン接合をターゲットに設計されていた。短いターゲット シーケンスの検出は、T 細胞受容体 α および Jurkat T 細胞株における β の CDR3 シーケンスの特定の検出によって示されました。また、細胞を用いた自動染色の EGFR L858R KRAS G12A 単一ヌクレオチド変化の可視化による単一ヌクレオチド分解能 (点突然変異) RNA ターゲット シーケンスの区別のためこのっぽいアッセイの有用性プラットフォーム。要約すると、プロトコルは、スプライスバリアント、短いシーケンス、および突然変異の in situ手動によるパフォーマンスと自動方向づけるの検出を可能にする特殊な RNA っぽい試金を示しています。

概要

マイクロ アレイや次世代の RNA シーケンス (RNAseq) などの高スループット トランスクリプトーム技術は指数関数的になど様々 な疾患の診断、予後、および予測の臨床的価値を持つ RNA バイオ マーカーの発見を改善しています。がん^1,2。精密医学におけるこれらのバイオ マーカーの使用を事前には、高い臨床サンプルの組織コンテキスト内で RNA バイオ マーカーを測定することができます標準で堅牢な技術の必要性。必要な組織の均質化と RNA の隔離が体内細胞型特異性の損失を意味しながら広く確立される RNAseq など定量的 RT-PCR を挽くとバインド アッセイは、高感度遺伝子発現測定を有効にすると、形態素情報³。感度と特異度の組織コンテキスト⁴内希少または低発現 RNA バイオ マーカーを確実に測定するために必要な従来の in situ RNA 検出の方法論を欠いています。

商業の in situハイブリダイゼーション (っぽい) アッセイ (e.g、RNAscope 試金) はこれらに取り組んできた 1 つの技術課題とも 300 を超える単一の RNA 分子の高感度・特定の可視化を実現。組織形態学的文脈の中でのヌクレオチド。このタイプの試金は、約 6-20 ダブル Z プローブ ペア交配ベースの高度な信号増幅⁵と組み合わせてのユニークなオリゴヌクレオチド プローブ デザインを使用しています。

本研究では、特殊な RNA っぽい試金、BaseScope、50 のヌクレオチド塩基の分解能で短い RNA ターゲット シーケンスを検出する以前にデザインされた商業技術を補完するものをについて説明します。この試金はトランスクリプトームの複雑な複雑さに対処、エキソン接合、短いターゲット シーケンス、およびわずか 1 ダブル Z プローブ ペアを使用して、組織コンテキスト (表 1) に点突然変異の正確な検出を適用されます。FFPE の単一塩基配列変異細胞ラインおよび腫瘍組織とこのレポートは完全な試金のプロトコル、スプライスバリアント、T 細胞受容体クローンの CDR3 シーケンスの検出での使用を示します。

プロトコル

本研究で使用される人間の腫瘍のサンプルは提供され、人間の研究地域の倫理ガイドラインに沿った商業ソースから取得しました。

1. サンプルは、機器、試薬等

1. FFPE サンプルの準備
   1. 組織
      1. 常温 (RT) 16-32 h の中性緩衝ホルマリン 10% (NBF) の (厚さ 3-4 mm のブロックにカット) 組織を修正、解剖の直後します。
         注: 固定時間は組織の種類とサイズによって異なります。
      2. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 サンプルを洗浄し、脱水の標準的なエタノール (エタノール) シリーズを使用して (70 %30-60 分、80% エタノール エタノール 90%、30-60 分間 30-60 分、95% のエタノール 30-60 分、3 x 100% エタノール エタノール 30-60 分) キシレンの順。
      3. 標準的な手順⁶を使用してパラフィン サンプルを埋め込むし、余分なパラフィンを削除する必要に応じて、パラフィン ブロックをトリムします。
         注: ブロック サイズ、組織サンプル サイズによって異なりますが、典型的なサイズは 0.75 0.75 インチ² x またはより小さい。
   2. セルライン
      1. 収集し、特定のセルの行の推奨方法に従って細胞のペレットします。
      2. ローテーター上 24 時間常温 10% ホルムアルデヒドのセルを修復します。
      3. Prewarmed 処理ゲルでペレットとしてセルを準備 (e.g。、Histogel)。パラフィルムの部分にゲル細胞ペレットを氷の上に配置することによって固化するペレットをでき、2-3 分サブマージ 1x PBS でゲル細胞ペレットに座らせてください。
      4. 脱水して、1.1.1 の手順で説明されているように細胞ペレットを埋め込みます。
   3. セクションの準備
      1. ミクロトームを使用して 5 ± 1 μ m のセクションに埋め込まれた組織/細胞を切り取り、静電接着ガラス スライド上のセクションをマウントおよび室温それらを一晩風乾
         注: スライドは RT で 3 ヶ月間乾燥下で格納できます。
      2. スライド ラックのスライドを置くし、分析を実行する前に 60 ° C 1 時間で循環空気オーブンでマウントされた組織スライドを焼きます。
         メモ: スライドを使用して、すぐに、1 週間の乾燥剤で常温保存します。長期の保管は RNA の劣化にあります。
2. 機器の準備
   1. ハイブリダイゼーション オーブンを 40 ° C に設定します。徹底的にウェット加湿紙と湿度コントロール トレイに、残留 dH₂O を挿入紙を削除、ハイブリダイゼーション オーブンを使用する前に、少なくとも 30 分間 prewarm トレイを挿入します。
3. 試薬の準備
   1. キシレンの 200 mL のエージェント料理をクリア 2 つを記入し、200 ml 100% の 2 つの染色料理を埋めるエタノールは、セクションの deparaffinization に使用されます。
   2. DH₂O の 180 mL を 20 mL の 10 x ターゲット検索試薬に追加することで市販の 1 x ターゲット検索試薬の 200 mL を準備します。蒸し器で 2 つのスライド ホルダーを配置します。ターゲット検索試薬 × 1 の 200 mL の 1 つスライド ホルダーを記入し、船を使用して沸騰する両方のソリューション dH₂o. 熱の 200 mL の他のスライド ホルダーを入力します。
   3. 10-20 分準備 3 L の 60 mL を希釈して 1 x 洗浄バッファーの 40 ° c の暖かい 50 x 洗浄バッファー prewarmed dH₂O. 2.94 l 50 x 洗浄バッファー
   4. 発煙のフードではギルのヘマトキシリンの 100 mL を 100 mL の dH₂o. に追加することによってソリューションを counterstaining 50% ギル ヘマトキシリンを準備します。ヒューム フードの準備ブルーイング試薬 (0.02% (w/v) アンモニア水) 28-30% 水酸化アンモニウムの 1.43 mL を 250 mL の dH₂o. に追加することによって
   5. Prewarm プローブの交配前に 10 分の 40 ° C でターゲット プローブと増幅試薬 (AMP 0-6) をもたらす RT。

2. RNA In Situハイブリダイゼーション アッセイ

1. Deparaffinization ・脱水
   1. 1.1.3.2 の手順で説明されているように焼成後 (オプションの停止ポイント 1) 撹拌 5 分のキシレンのセクションを deparaffinize。再び新鮮なキシレン 100% で 5 分 Dehydrate deparaffinize 2 分攪拌、再び新鮮な 100% の繰り返しとエタノール エタノールを 2 分間。
   2. 空気は循環空気オーブンで 60 ° C で 5 分間スライドを乾燥または RT までは完全に乾燥 (オプションの停止ポイント 2)。
2. サンプル前処理
   1. 内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチする RT で 10 分間の準備ができて使用する過酸化水素の 〜 4 滴とセクションを孵化させなさい。スライドからソリューションをデカントし、dH₂o. で 2 回洗浄し
   2. 蒸し器で 100 ° C で 15-30 分のためのターゲット検索試薬の 200 mL のセクションを孵化させなさい。
      注: インキュベーション時間は組織の種類によって異なる場合があります。このプロトコルでは腫瘍のサンプルの細胞ペレット 15 分ターゲットの検索を行った。
   3. スライドからソリューションをデカント、dH₂O 2 回すすぎ、ディップ 100% EtOH 3 分のドライ スライド循環空気オーブンで 60 ° C で、常温まで完全に乾燥します。
   4. 約 0.75 x 0.75 インチ²疎水性のペンを使ってセクション囲む疎水性の障壁を描画します。
      注: それは小さな障壁を描画するは推奨されません。大きいセクション、大きな障壁を描画する必要があります。
   5. 1 分間完全に乾燥または室温で一晩を残すバリアができます (オプションの停止ポイント 3)。
   6. スライド ホルダーにスライドを置き、湿度コントロール トレイにスライド ホルダーを配置します。各スライドにプロテアーゼ III 〜 4 滴を追加し、タンパク質消化のため交配のオーブンに 40 ° C で 15-30 分間インキュベートそれら。
      注: インキュベーション時間は組織の種類によって異なる場合があります。このプロトコルでは腫瘍サンプルの 30 分、細胞ペレットの 15 分のプロテアーゼ消化を行った。
   7. スライドからソリューションをデカントし、dH₂o. で 2 回洗浄し
3. プローブの交配
   1. セクション全体をカバーする適切なすぐに使用できるプローブ ソリューション 〜 4 滴を追加します。大きなセクションを使用して 〜 5-6 を追加しました。
   2. ハイブリダイゼーション オーブンで 40 ° C で 2 h のプローブを交配させます。スライドからソリューションをデカントし、時折撹拌で RT で 2 分間洗浄バッファー x 1 の 200 mL のスライドを洗ってください。この手順では洗濯の手順を繰り返します。
4. 信号増幅
   1. アンプ 0 30 分デカント ソリューション ハイブリダイゼーション オーブンで 40 ° C でスライドごとの ~ 4 滴とセクションをインキュベートし、時折撹拌で RT で 2 分の 1 の x 洗浄バッファーの 200 mL のスライドを洗ってください。この手順では洗濯の手順を繰り返します。
   2. アンプ 1 〜 4 滴とセクションごとに 40 ° c 15 分デカント ソリューション ハイブリダイゼーション オーブンでスライドをインキュベートし、時折撹拌で RT で 2 分間洗浄バッファー x 1 の 200 mL のスライドを洗ってください。洗浄手順を繰り返します。
   3. アンプ 2 〜 4 滴とセクションごとに 40 ° c 30 分デカント ソリューション ハイブリダイゼーション オーブンでスライドをインキュベートし、時折撹拌で RT で 2 分間洗浄バッファー x 1 の 200 mL のスライドを洗ってください。洗浄手順を繰り返します。
   4. アンプ 3 〜 4 滴をセクションごとに 40 ° c 30 分デカント ソリューション ハイブリダイゼーション オーブンでスライドをインキュベートし、時折撹拌で RT で 2 分間洗浄バッファー x 1 の 200 mL のスライドを洗ってください。洗浄手順を繰り返します。
   5. アンプ 4 〜 4 滴とセクションごとに 40 ° c 15 分デカント ソリューション ハイブリダイゼーション オーブンでスライドをインキュベートし、時折撹拌で RT で 2 分間洗浄バッファー x 1 の 200 mL のスライドを洗ってください。洗浄手順を繰り返します。
   6. アンプ 5 〜 4 滴とセクションごとに 30 分デカント ソリューションの RT でスライドをインキュベートし、時折撹拌で RT で 2 分間洗浄バッファー x 1 の 200 mL のスライドを洗ってください。洗浄手順を繰り返します。
   7. アンプ 6 〜 4 滴とセクションごとに 15 分デカント ソリューションの RT でスライドをインキュベートし、時折撹拌で RT で 2 分間洗浄バッファー x 1 の 200 mL のスライドを洗ってください。洗浄手順を繰り返します。
5. 信号検出
   1. 作業ソリューション高速赤染料を準備します。高速の 120 μ L を高速赤 B 色素の 2 μ L を追加 0.75 x 0.75 インチ²障壁を 1 つのスライド、赤のチューブによく混ぜる。
      メモ: 疎水性障壁とスライドの数のサイズに応じて高速赤作業ソリューションのボリュームが変動します。
   2. スライドから余分な液体をデカントし、スライドするソリューションを操作高速赤染料を追加します。光の露出を避けるためにカバーとトレイに RT で 10 分間のスライドを孵化させなさい。
      メモ: 高速赤作業準備の 5 分内でソリューションを使用して、直射日光や紫外線にさらされないように。
   3. 赤高速ソリューションをデカントし、水道水で 2 回スライドをすすいでください。スライド ラックにスライドを配置します。
6. Counterstaining
   1. Counterstain した洗浄で 2 分間 50% ギル ヘマトキシリン液と組織切片を水道水スライドおよびスライドが明確なセクションは紫のままになるまでこれを数回繰り返します。ブルーイングの 0.02% アンモニア水にスライドをディップ (dip 2-3 回)。水道水とアンモニア水を交換し、3 ~ 5 回スライドを洗ってください。
7. スライド マウント
   1. 乾燥循環空気オーブン 15 分の 60 ° c または完全になるまで常温でスライドを乾燥します。各セクションの上各スライドと場所 coverslips に取り付け試薬を 1-2 滴を配置します。空気の泡のすべてのトラップを避けてください。空気は、少なくとも 5 分のスライドを乾燥させます。
      注: 高速赤基板はアルコール依存です。アルコールでスライドを行うステータス退避を行いません。
8. 可視化
   1. 標準的な明視野顕微鏡スライドを観察します。

結果

その場で交配分析ワークフロー:
ワークフロー図 1に描かれている、4 つの部分で構成されています: セルまたはターゲット検索とプロテアーゼ、ソリューションのターゲット RNA プローブの交配組織の透過信号増幅、および信号の可視化。信号は、デジタル イメージング ソフトウェア システムを使用して定量化することができますまたはセルごとのドット数に基づく半定量的な方法で。図 2に記載されている手動の手順も完全に商用自動染色システムで自動化されています。

代表的な染色のエキソン接合検出 (EGFRvIII スプライスバリアント): EGFRvIII はエクソン 2 に 7 のフレームでゲノム削除から発生する上皮成長因子受容体の変異恒常活性がん化シグナル^{7 につながる}.アッセイは、EGFRvIII FFPE 膠芽腫 (GBM) 腫瘍サンプルの状態を識別するために使用されました。シングル ダブル Z プローブがいずれかの重量を検出するためにエキソン接合にまたがるように設計された突然変異体、または両方の成績証明書 (図 3 a)。WT EGFR プローブ EGFRvIII プローブ エクソン 1 と 8 (E1/E8) の接合部にまたがる、エクソン 1 と 2 (E1 ・ E2) またはエクソン 7 および 8 (E7 ・ E8) の接合部に します。エクソン 8 および 9 (E8 ・ E9) の接合部にまたがる一般的なプローブも合計 EGFR (WT、EGFRvIII 成績証明書) を検出するために使われました。すべてのプローブは、GBM FFPE サンプルの EGFR の状態を確認する使用してしました。図 3Bに示すように 2 つの代表的な例は、大規模な研究から撮影されました。独立した法、RT-PCR 法による EGFR ステータスを確認しました。両方の WT のプローブでは、両方のサンプルを示す 2 つのサンプルが (図 3 b) WT EGFR を表現で信号が検出されました。ただし、変異のプローブだけ EGFRvIII + サンプルは、このサンプルは確かに EGFRvIII バリアント (図 3 b、左パネル) の肯定的な確認の信号検出を示した。逆に、突然変異体のプローブは、EGFRvIII サンプル (図 3 b、右側のパネル) で信号を検出しませんでした。一緒に取られて、これらの結果は、エクソン結合アッセイが GBM FFPE 腫瘍サンプルの EGFRvIII ステータスを識別できることを示します。

短期目標のために汚れる代表:
CDR3、または補完決定地域 3 は、T 細胞受容体に非常に可変ドメインです。通常、CDR3 シーケンスは非常に短い;たとえば、Jurkat T セルラインから CDR3 の α と β のシーケンスは、それぞれ長さ 51 および 48 のヌクレオチド (図 4 a)。Jurkat 細胞、CDR3 のアンチセンス プローブで表される特定の CDR シーケンスを識別する α と β Jurkat T 細胞に表現される生成された、CDR3 の意味プローブに加えて α と β として負の制御プローブします。すべてのプローブは FFPE 準備 Jurkat 細胞アッセイで、調べた。堅牢な染色が観察された両方 CDR3 のアンチセンス プローブと α と β Jurkat 細胞感覚プローブに対し信号が検出された小さながありません (図 4 b)。これらの結果は、T 細胞受容体クローンの CDR シーケンスを非常に変数が、短い間に識別する短いターゲット分析の能力を発揮します。

点突然変異 EGFR L858R 染色代表:
点突然変異のプローブは、腫瘍のコンテキストで単一のヌクレオチドの変化と小さな挿入または削除 (オクターリピート) を検出するため開発されました。図 5 aは、点変異 EGFR L858Rの in situ検出能力を発揮 (2573T > G)。2 つのプローブを設計されていた: 1 つは、L858R を検出する変異 EGFR シーケンス、および別の EGFR L858 WT シーケンスを検出します。2 つの FFPE 準備セルラインで両方のプローブでテストした: H2229、EGFR L858 WT; のみを表現します。H1975、EGFR L858R 変異のヘテロ接合体であります。H2229 細胞株ではなく H1975 セルラインでのみ、L858R 変異プローブに信号が検出されました。しかし、WT プローブ両方の細胞に信号が検出されました。同様に、その場でKRAS G12A 点突然変異の検出を可視化図 5B (35 G > C)。2 つのプローブは、KRAS G12A MT と KRAS G12 WT シーケンスを検出するように設計され、HuT78 細胞株 (KRA G12 WT を表現のみ) して (G12A KRAS 変異のヘテロ接合体である) SW116 細胞ラインをテストされ。KRAS G12 WT プローブでは、両方の細胞に信号が検出された、KRA G12A プローブでは、SW116 細胞における信号のみ検出。一緒に取られて、これらのデータは、細胞・組織における一塩基多型の検出に点突然変異の試金の技術力を示しています。

染色自動その場で試金のための代表:
自動アッセイを確実に実行するサンプルの大きい数のため許可するユーザ間変動とハンズオン時間を最小限に抑え、一貫して再現可能な結果を生成します。したがって、アッセイの自動化された版は開発されました。このアッセイで自動染色を示す、スプライスバリアント METΔ14 の検出について検討しました。このバリアントは、mRNA スプライシング、構成的活性化と MET 受容体^8,9の発癌につながる時にスキップされる MET 遺伝子のエクソン 14 の結果です。METΔ14 バリアントを特に検出するため 2 つのエキソン接合プローブを設計されていた: エクソン 13 と 15 (E13/E15) METΔ14 バリアント トラン スクリプトを検出するための接合部にまたがる、もう一方はエクソン 14 および 15 (E14/E15) WT 会ったを検出するための接合部にまたがるトラン スクリプト (図 6 a)。2 の FFPE 準備セルラインでテストされ、両方のプローブ: H596 METΔ14 バリアントを表わす、A549 WT に会った遺伝子を表現します。両方のプローブは、のみ H596 細胞でのみ A549 細胞 (図 6 b ・ 6 C) 信号を検出 E14/E15 プローブ信号を検出 E13/E15 プローブと相互に排他的な発現パターンを示した。最後に、dapB 用プローブは、バック グラウンド信号 (図 6 b ・ 6 C) がないことを示す信号を示さなかった。全体的にみて、このデータは、MET バリアント METΔ14 の場で自動 BaseScope アッセイを利用した特異的検出を示しています。

図 1: 分析ワークフロー 。ワークフローは、4 つの主要なステップで構成されています: 細胞または組織、ターゲット RNA プローブの交配を permeabilize 前処理信号の増幅と明視野観察や蛍光顕微鏡下で可視化による信号検出します。個々 のドットは、デジタル画像解析プラットフォームを使用して定量化することができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 手動の試金のプロトコルのイラスト。9 回は組織の種類によって異なる場合がありますので、インキュベーション時間に関する組織前処理推奨のユーザー マニュアルの付録 A を参照してくださいお勧め前処理における全体の分析を完了ことができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: エキソン接合検出の代表的なイメージです。(A) 表示ここでは、エクソン EGFR WT、EGFRvIII コピー EGFR WT や EGFRvIII を検出するジャンクションを跨ぐダブル Z エキソン接合プローブを描いた模式図機構。(B)、エクソン結合アッセイは、ポジティブ コントロール プローブ、POLR2A、および陰性コントロール プローブ、dapB だけでなく、(A) に記載されているプローブを用いた 2 つの FFPE 膠芽腫のサンプルで実行されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 短いターゲットの代表的なイメージ シーケンス検出します。(A) 表示ここが Jurkat 細胞 CDR3 シーケンス。黒でシーケンスが並ぶ一般的なシーケンス、赤のシーケンスは CDR3α または CDR3β のいずれかに一意です。シングル ダブル Z 短いターゲット シーケンスのプローブは、これらのシーケンスに対して設計されていた。Jurkat 細胞 (a) シーケンスをターゲット反感覚または感覚のプローブを用いた FFPE 細胞ペレットとして準備 (B) 短いターゲット分析を行い dapB ネガティブ コントロールとして使用されていた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: 点突然変異検出の代表的なイメージです。(A) アッセイを行った H2229 細胞 (egfr 遺伝子 L858 のホモ接合体) と H1975 (EGFR L858R 変異 heterozygous) EGFR L858 WT シーケンスまたは EGFR L858R 対象シングル ダブル Z 点突然変異プローブを用いた FFPE 細胞ペレットとして準備変異のシーケンス。(B) 点突然変異の試金は HuT78 細胞 (KRA G12A のホモ接合体) と SW116 (G12A KRAS 変異 heterozygous) KRA G12 WT シーケンスをターゲット シングル ダブル Z 点突然変異プローブを用いた FFPE 細胞ペレットとして準備に行ったかG12A KRAS 変異シーケンスです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 6: エクソン結合アッセイの自動化された染色の代表的なイメージです。(A) 表示ここで会った WT と METΔ14 の成績証明書と会った WT や METΔ14 を検出するジャンクションを跨ぐシングル ダブル Z エキソン接合プローブを描いた模式図のためのエクソン組織であります。(B) 陰性コントロール プローブ dapB だけでなく、H596 細胞 (METΔ14) の (A) に記載されているプローブを用いた FFPE 細胞ペレットとして準備 (会った WT を発現する) A549 細胞 (C) 自動化されたエクソン結合アッセイを行った。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

エキソンジャンクション	短いシーケンス	点変異
スプライスの変形/アイソ フォーム	50 と 300 nt 間のシーケンス	点変異
円形 RNA (circRNA)	高度の相同	短い塩基
遺伝子融合	TCR クローン CDR3 シーケンス	遺伝子の編集
遺伝子ノックアウト (KO)	プレ-マイクロ Rna
	小さな核小体 RNA (snoRNA)
	遺伝子の編集

表 1: のアプリケーション、その場でアッセイ。本法の適用のための 3 つの主なカテゴリー: エキソンジャンクション、短いターゲット シーケンス、および点突然変異。各列に記載されている各カテゴリのいくつかの特定のアプリケーションの例です。

ディスカッション

このレポートで詳しく小説っぽいの試金のプロトコルとその応用を論じた。アッセイは、エキソン接合、短期目標と高い相同性シーケンス、および組織のコンテキストにおける点変異の直接可視化が可能です。アッセイは、RNAscope 技術⁵に基づいており、したがって単一分子検出が可能です。ただし、高度な増幅方式により信号を検出プローブとしてはほとんど 1 つのダブル Z のペアを含む、ちょうど 50 のヌクレオチドのターゲット テンプレートの長さできます。プローブ長さシングル ダブル Z として短いことがあるのでこれにより、エキソン接合、短期目標と高い相同性シーケンス、および点突然変異 (表 1) の検出のため。

アッセイの成功したパフォーマンスのいくつかの技術的な推奨事項があります。まず、組織は、室温 16-32 h¹⁰新鮮な 10% 中性緩衝ホルマリン (NBF) で修正されるはず。Underfixation (< 16 h) または overfixation (> 32 h) アッセイのパフォーマンスが低下し、さらなる最適化が必要な場合があります。第二が堅牢なプローブの交配および信号の増幅に必要な温度と湿度、最適にコントロールする処理システム、ハイブリダイゼーション オーブン スライドに使用するプロトコルの手順 5 に 2.3 (プロテアーゼ前処理、プローブ交配、信号増幅、および信号検出)。第三に、過剰な残留バッファーは、プロトコルを通して各ステップの前に正しくデカントし (しかしないなので、組織切片が乾く) にする必要があります。スライドが乾く場合重要な非固有の信号を開発します。第四に、組織の種類に応じて、前処理の最適化は必要かもしれません。間違ってプロテアーゼを使用してまたは時間の最適な長さの実行可能性の下で- またはオーバー-digestion と信号に悪影響を及ぼします。最後に、常にテスト プローブで正と負のコントロールを実行することが重要です。陰性コントロール プローブには、サンプルの RNA の品質はプローブのテスト結果を解釈するために最適であると、バック グラウンド信号がないポジティブ コントロール プローブは、測定が正しく行われていることを確認を確認します。信号がないポジティブ コントロール プローブと、サンプルの RNA の品質が最適ではない場合、テスト プローブを信号が表示されません。

手動測定に加えて自動方向づけるでアッセイを行う機能はまた実証 (図 6) であります。この自動っぽい試金高い信号対雑音比が得られ表 1で示すように、同様のアプリケーションに適用可能なただし、自動化されたアッセイの利点はアッセイ条件, ユーザ間の変動性と実践的な時間の最小化の標準化、信頼性の高い方法で組織サンプルの高スループット スクリーニングのための手当します。

免疫組織染色 (IHC) および qRT PCR FFPE 臨床検体におけるスプライス変異 (特に EGFRvIII) の検出を可能にする、これらのテクニック不足することは必要な特異性、スプライスの空間分解能への洞察力を提供していません。バリアント型の式は、それぞれ^11,12。このプロトコルのアッセイの主な利点はその高感度・特定の可視化スプライス接合形態の組織コンテキストを維持しながら。ここでは、EGFRvIII と METΔ14 を含むいくつかのスプライスバリアントのユニークなエキソン接合を正確にターゲットにアッセイの能力が実証 (図 3 および 6)。さらに、前立腺癌、脳で ErbB4 の複数のアイソ フォームとマウス脳^3,13,14の円形の RNA Cdr1as のノックアウトの確認のスプライスバリアント AR V7 を検出するアッセイを示されています。

Jurkat 細胞 (図 3) 由来 CDR3 シーケンスの検出によって示されているようにこの ISH 法による短いターゲット シーケンスの検出できます限り短く、長さ 50 のヌクレオチド RNA シーケンスの可視化。アッセイは、Revêchonらが示すように、他の家族のメンバーまたは種と高い相同性は遺伝子の塩基配列を検出することも。、マウス皮下白色脂肪¹⁵で表される人間の progerin を検出する短いターゲット試金を使用しました。さらに、小さな核小体 RNA (snoRNA)、CRISPR 媒介性遺伝子の編集、および前駆体マイクロ Rna 検出されたその場で短いターゲット分析をすることができます。最近では、Fu et al.は、プレ-マイクロ Rna mir125b¹⁶を表現する網膜の精密な細胞を識別するために IHC とこのっぽいアッセイを組み合わせます。

腫瘍におけるプロファイリングの突然変異は腫瘍の進行を勉強するため、目標とされた療法を開発するために重要です。変異プロファイルは、高スループット シーケンスを介して達成することができます、一方この技術は腫瘍細胞形態^17,18の不均一性やリンクの遺伝子変異を十分に対応できません。このっぽいアッセイを用いた点突然変異の検出は、単一ベース解像度、細胞 (図 5) の EGFR L858R KRAS G12A 単一のヌクレオチド変化の検出による検証として RNA ターゲット シーケンスの区別のためことができます。さらに、ベイカーらは、大腸癌¹⁸PIK3CA、KRAS, BRAF 遺伝子に複数の変異を対象とするのに点突然変異の試金を使用しました。識別し、最終的に内腫瘍の多様性に貢献する方法を示す腫瘍細胞のまれな変異サブクローンを空間的にマッピングすることができました。

要約すると、特殊な RNA っぽいアッセイを開発しました。この手法は、スプライスバリアント、短いシーケンス、およびその場で突然変異の検出のためことができます。マニュアルの方法と自動方向づけるの両方のパフォーマンスに敏感な特定、定量化、および適応です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HybEZオーブン(110または220 VAC)またはHybEZ IIオーブン(110または220V)	ACD	310010または310013(HybEZ™)、321710または321720(HybEZ™II)
HybEZ湿度制御トレイ(蓋付き)	ACD	310012
ACD EZバッチスライドラック(スライド容量20個)1ラック	310017 ACD	310017
HybEZ加湿紙	ACD	310015
ImmEdge疎水性バリアペン(必須)	ベクター研究所	H-4000
SuperFrost Plus スライド (必須)	フィッシャーサイエンティフィック	12-550-15
10%中性緩衝ホルマリン(NBF)	MLS	/	MLSは北米の主要な研究所サプライヤーです。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
パラフィンワックス	MLS	/	MLS北米の主要な研究所サプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
ミクロトーム	MLS	/	MLS北米の主要な研究所サプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
ギル's ヘマトキシリン I	アメリカン・マスター・テック・サイエンティフィック/MLS	HXGHE1LT	MLS北米の主要な研究所サプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
キシレン	フィッシャーサイエンティフィック/ MLS	X3P-1GAL	MLS北米の主要な研究所サプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
Tissue-Tek Vertical 24スライドラック	American Master Tech Scientific / MLS	LWSRA24	MLSは、北米の主要な研究所サプライヤーです。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
Tissue-Tek染色皿	American Master Tech Scientific / MLS	LWT4457EA	MLS北米の主要な研究所サプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
ティッシュテッククリアリングエージェントディッシュ、キシレン耐性	American Master Tech Scientific / MLS	LWT4456EA	MLS北米の主要研究所サプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
アルコール100%(EtOH)	American Master Tech Scientific / MLS	ALREACS	MLS 北米の主要な研究所サプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
VectaMount永久封入剤(必須)	Vector Labs	H-5000
カバーガラス、24 mm x 50 mm	フィッシャーサイエンティフィック/MLS	12-545-F	MLS北米の主要な研究所サプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
水酸化アンモニウム、28–30%	Sigma-Aldrich/MLS	320145-500mL	MLS北米の主要ラボサプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
Carboy (>3L)	MLS	/	MLS 北米の主要研究所サプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
オスタースチーマーモデル5712、ブラックアンドデッカースチーマーHS3000、またはブラウンマルチクイックFS20スチーマー	/	/
デジタル温度計	MLS	/	MLS北米の主要な研究所サプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
ウォーターバスまたはインキュベーター、40 +/– 1 >C	MLS	/	MLSは、北米の主要な研究所サプライヤーです。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
ピペッターとヒント、1–1,000 ΜL	MLS	/	MLSは、北米の主要な研究所サプライヤーです。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
蒸留水	MLS	/	MLS北米の主要な実験室サプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
チューブ(さまざまなサイズ)	MLS	/	MLS北米の主要な研究所サプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
ヒュームフード	MLS	/	MLS北米の主要な研究所サプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
メス	シリンダーMLS	/	MLS北米の主要な研究所サプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
Parafilm	MLS	/	MLSは、北米の主要な研究所サプライヤーです。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
ペーパータオルまたは吸収紙	MLS	/	MLS北米の主要な研究所サプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
微量遠心分離機	MLS	/	MLS北米の主要な研究所サプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
顕微鏡とアクセサリーMLS		/	MLS北米の主要な研究所サプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
乾燥オーブン、60 +/– 1 >C	MLS	/	MLSは、北米の主要な研究所サプライヤーです。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
ホルムアルデヒド	MLS	/	MLS北米の主要な研究所サプライヤー。その他の地域については、最寄りのラボサプライヤーにカタログ番号を確認してください。
Histogel	Fisher Scientific/MLS	22-110-678
BaseScope 試薬キット - RED	Advanced Cell Diagnostics	322900
BaseScope Hs-EGFR-E1E2	Advanced Cell Diagnostics	701701
BaseScope Hs-EGFR-E1E8	Advanced Cell Diagnostics	701711
BaseScope Hs-EGFR-E7E8	Advanced Cell Diagnostics	701721
BaseScope Hs-EGFR-E8E9	アドバンスト セル診断	701731
BaseScope Hs-MET-E14E15	アドバンスド セル診断	701811
BaseScope Hs-MET-E13E15	アドバンスド セル診断	701801
BaseScope Hs-KRAS-G12A	アドバンスド セル診断	705491
BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT	高度な細胞診断	705531
BaseScope Hs-EGFR-L858R	高度な細胞診断	705451
BaseScope Hs-EGFR-L858WT	高度な細胞診断	705461
BaseScope Control Probe Pack Human	Advanced Cell Diagnostics	322975