ここで、Mod5、酵母 RNA 修飾酵素の生化学的解析のためのプロトコルを記述し、このプロトコル可能性があります他の RNA 修飾酵素に適用する方法について説明。
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方法論記事
TRNA イソペンテニル トランスフェラーゼ活性を検出する体外の試金
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
N6- isopentenyladenosine RNA 変更、機能的多様性と原核生物と真核生物の間で非常に節約されました。最も非常に節約された N6- isopentenyladenosine 変更の 1 つは、Trna のサブセットの A37 位置に発生します。この変更は、tRNA のリボソームの親和性を高めることによって翻訳の効率と忠実度を向上します。真核生物でこの変更に関わる酵素の突然変異は、ミトコンドリア機能障害やがんなどいくつかの病気の状態に関連付けられます。したがって、基質特異性とこれらの酵素の生化学的活性について常態と病態の真核生物の生物学の理解のために重要です。方法の多様な配列は、私6A の変更の特性評価に採用されています。ここは Mod5 によって isopentenylation の検出のための直接的なアプローチを説明します。このメソッドは、組換えイソペンテニル トランスフェラーゼ、続いて RNase T1 消化と私に6A の変更を検出する 1 二次元のゲルの電気泳動分析と Rna の孵化を利用しています。さらに、他の RNA 修飾酵素を特徴付けるこのプロトコルの潜在的な適応性を説明します。
概要
Rna に、コンテキストに依存する多様な機能、直接 RNA の構造に影響を与える、他の RNA の相互作用に影響を与えるこれらの変更で少なくとも 163 異なる転写後の RNA の修正も確認されています。分子1,2。番号とさまざまな RNA 編集のための感謝が増えると、RNA 修飾とそれらを触媒する酵素の両方を問い合わせること確実に試金の開発が急務です。
識別される最初の RNA 修飾の一つは、基本 37 Trna、3' 側3,4反のコドンに隣接してに発生します。イソペンテニル グループ dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) からアデノシン 37 の N6 位置に転送されます (私6A37) 3,5細胞質とミトコンドリア Trna のサブセット。私6A37 翻訳忠実度を向上させるし、6リボソーム4,6と私の tRNA....
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プロトコル
注: プロトコルは、Ref. 24から適応されました。
1. 関心の酵素と RNA を取得します。
- 使用の in vitro転写 Rna 内部で32P でラベルしてエシェリヒア属大腸菌、前述した24から精製組換え His6 Mod5 で表現。
- 紹介の in vitro転写 Rna (セクション 3) ラベル ATP、UTP、CTP、GTP、10 µCi ゲル精製、エタノール沈殿 α ATP の存在下で T7 RNA ポリメラーゼを用いた 1 x テ (10 mM トリス塩酸 pH 7.5、0.1 ミリメートルの EDTA) で再停止され、 -80 ° C で保存24。
- また、市販の蛍光に分類された Rna の関心を取得します。任意の最寄り式システムに関心の液を生成します。
注意: 酵素による RNA の構造と認識は RNA の蛍光タグの内部には変更できます。
2. ゲルを変性剤濃度 20% ポリアクリルアミドゲルを準備します。
注: RNA のフラグメント....
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結果
Mod5 は、チロシンと培養された tRNA またはセリン DMAPP の有無で tRNA。以下の改質反応製品であった RNase T1 消化 3' グアノシン monophosphates (GMP)24 (図 1) を残してすべての guanosines の 3' 末端を切断します。Rna の完全消化は、ゲルの変化 20% ポリアクリルアミドゲルに解決されます radiolabeled フラグメント (図 2A) の予測可能なパターンを生成します。DMAPP から RNA へイソペンテニル グループの転送変更された残渣 (図 1) を含むフラグメントの移動性シフトが発生します。
このプロトコ.......
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ディスカッション
RNA 修飾は、細胞・個体機能のこれまで以上に重要かつ多様な役割を果たすことに表示し続けます。など、RNA 修飾酵素を尋問するアッセイの開発は生物学の基本的な側面を理解するより良い中心です。このプロトコルでは、高解像度の in vitroアッセイで Mod5 の tRNA の修正活動の特性について説明します。
このプロトコルには、isopentenylation の直接と簡単に解釈できる読み出しを提供する明確な利点があります。説明されたプロトコルはイソペンテニル トランスフェラーゼの堅牢な生化学的解析のためことができます。さらに、このシステムは酵素のバリエーションに使用することができます。 または修飾 RNA 基板上、変更、特定の残基またはドメイン ロールの直接定量を可能にします。でもより高い解像度を得るためには、このプロトコルは RNase P1 や RNase A などの他の RNases とすべての 4 つのヌクレオチド、C, U, をそれぞれ切断する並列の消化力を含むように合わせることが容易にできます。
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謝辞
我々 は彼の指導と有用なコメントがこの原稿のため博士デイヴィッド Engelke を感謝したいです。PJS - ボール州立大学研究所スタートアップ資金;軽打 - 1R15AI130950-01 を付与します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | キットの一部として |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | キットの一部として |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | キットの一部として |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | キットの一部として |
| 過硫酸アンモニウム(APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-テトラメチルエチレンジアミン(TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| トリスベース | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| ホウ酸 | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| エタノール | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| 酢酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| グリセロール | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| キシレンシアノール | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short ガラスプレート (20-40cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL 使い捨てシリンジ | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| ステンレス製バインダークリップ | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| ラップ | (地元の食料品店) |
参考文献
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).
- Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guid....
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再版と許可
