方法論記事

小動物モデルにおける外部ビーム放射線を用いた多能性幹細胞由来の奇形の対象となる、選択的な治療

DOI：

10.3791/58115

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2019年2月17日

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1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiology, Stanford University School of Medicine, 3Medical Service, Cardiology Section, Veteran Affairs Palo Alto Health Care System, 4Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 5Department of Radiology, Molecular Imaging Program, Stanford University School of Medicine, 6Peking University Shenzhen Health Science Institute, 7Department of Radiation Oncology, Stanford University School of Medicine

この記事について

サマリー

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多能性幹細胞由来の奇形の治療戦略に関する研究は、幹細胞治療の臨床翻訳にとって重要です。ここでは、まず、マウスや、その後、選択的にターゲットに幹細胞由来の奇形を生成し、小動物照射を用いた生体内でのこれらの腫瘍を扱うのためのプロトコルについて述べる。

要約

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「幹細胞ツーリズム、」無秩序な世界、幹細胞移植の犠牲者の数の増加は、幹細胞移植の安全性について懸念を調達していますいます。奇形移植の時にまだ残留未分化幹細胞の存在から生じるまたは区別の自発の突然変異から未分化細胞は一般的な方法ではなく、移植が区別されるがセルです。幹細胞療法はしばしば解剖学的に敏感なサイトに配信される、ので小さい腫瘍が臨床的に壊滅的な失明、麻痺、認知の異常、循環不全の結果することができます。これらのサイトへの手術は、いくつかの治療オプションを持つ患者を残して、制限もあります。幹細胞の不正行為を制御する、つまり、幹細胞治療の臨床の翻訳のために重大。

外照射療法は、周囲の臓器への損傷を最小限に抑えながら奇形負担を減少する標的療法を提供する効果的な手段を提供しています。さらに、このメソッドは、遺伝子操作を回避または幹細胞のウイルスの伝達は追加臨床安全性と有効性の問題に関連付けられています。ここでは、マウスで多能性幹細胞由来の奇形を作成し、生体内で腫瘍を選択的に切除する外部ビーム放射線療法を適用するプロトコルについて述べる。

概要

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組織再生のための幹細胞療法の開発は過去数十年で効率的な臨床配置の努力を阻害する障壁の数を発生しました。これらのハードルには、配信、幹細胞の免疫原性とフォーム奇形1に腫瘍の可能性のサイトで悪いセルの保持が含まれます。腫瘍は、幹細胞移植の受信者2に悪影響特に臨床問題となります。無秩序な幹細胞注射による腫瘍形成のアカウントは、複数の臨床設定3,4,5で既に報告されています。奇形腫形成の可能性は最も頻繁多能性幹細胞 (PSC) の開発で臨床の懸念をあげている複数知名度の高い胚性幹細胞 (ESC) の延着及び取消の結果し、誘導多能性幹細胞 (iPSC)試験6,7,8,9。したがって、必要がありますこれらの医原性の腫瘍が発生する適切な治療の提供に向けた専用並進の調査のための急務があります。

日には、幹細胞の不正行為を制御するほとんどの戦略が発癌性の潜在的な2,10と Psc の数を減らすことに焦点を当てた。残念ながら、残留細胞 (例えば., 1 × 104 1 × 105セル11) の小さい数だけは検出限界値以下までには現在利用可能なアッセイ12,によって引用される奇形の形成に必要です13これらの preseparation メソッドを使用して他の制限、低効率と高い費用、新しい組織工学的アプローチ、と細胞の潜在的な障害のために適切ではないかもしれない単一細胞懸濁液への依存。生存率と生着。

いくつかの研究は、奇形腫形成、次の治療の選択肢を対処しています。おそらく最もよく研究戦略に幹細胞14,15「自殺」遺伝子の混入であります。この方法は、遺伝子操作により救助アプローチを提供する挿入された細胞は、奇形を生成する場合、薬理学的刺激これらによって活性化することができます誘導性のアポトーシス活性化遺伝子を組み込むための幹細胞を含みます。このアプローチでは、ただし、Psc、薬剤抵抗16の漸進的な開発のための潜在的な遺伝の修正のオフターゲット効果を含む重大な欠点苦しんでいます。同様のアプローチは、抗アポトーシス経路17の抑制を介して Psc の選択的細胞死を誘導する低分子を利用しています。他のグループは、psc ポドカリキシンのような蛋白質 1 (PODXL)18など、多能性表面マーカーに対する抗体を用いて細胞死をターゲットしています。小分子や抗体の配信のタイミングは、あまりにも早く配信され、配信遅すぎる場合に治療効果がない場合 Psc の治療の可能性に大きな影響を与えるに立っています。さらに、低分子化合物や抗体のこのファッションの全身の効果が検討されていません。

これらの腫瘍の治療への代替アプローチは、外部ビーム放射線療法 (照射線量) を使用に依存します。気管支腔内照射は腫瘍19の治療に現在採用されているプライマリの様相の 1 つです。気管支腔内照射、定位手術的照射、陽子ビームの開発などの技術革新は、等角気管支腔内照射を最適奇形に対処するため、正常組織への損傷を避けながら病理構造の強化されたターゲットを有効にしています。解剖学的に敏感な構造20で形成。さらに、このメソッドは、遺伝子操作またはどちらの追加の臨床安全性に満ちている幹細胞のウイルスの伝達を回避し、効果にかかわる15。最後に、マイクロ効果反射の進歩は、齧歯動物21気管支腔内照射のアプリケーションを有効にしています。

この記事では、マウスにヒトの Ips を注入することにより奇形腫形成小動物モデルを作成する方法を示します。その後、選択的にこれらの腫瘍は周囲の組織に与えるダメージを最小限で体内を根絶するために気管支腔内照射を適用する方法を示します。このアプローチでは、生体分子やペプチドの全身の配信と、Psc の遺伝的操作のオフターゲット効果を回避しながら PSC 由来の奇形の標的療法を提供します。治験の目的へと生物発光イメージング (結合) を介して腫瘍に対して放射線療法を追跡するレポーター遺伝子を幹細胞を変換するオプションの手順を提供しています。

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プロトコル

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この動物実験は承認され、制度の検討委員会とスタンフォード大学の研究所動物愛護管理パネルの下で行われます。

1. Ips の培養

  1. 基底膜マトリックス (例えば、マトリゲル、ここに至ってマトリックスと呼ばれる) をコーティングした 6 ウェル プレートにレンチ ウイルス リプログラミングによる人間の Ips を成長します。
  2. 毎日濃縮培養液中で Ips のメディアの変更 (材料の表を参照) を 37 ° C、5% CO2でインキュベートします。
  3. セルが 80-90% 合流点 (約 4 日) に達すれば、遺伝子組換え細胞解離酵素の 1 つの mL を追加 (材料表参照) あたりも、5 分の 37 ° C で孵化させなさい。
  4. 5 分後にピペッティングで井戸から細胞を分離、15 mL チューブに移して、300 × gで遠心分離機します。
  5. 、遠心分離後、上清を吸引し、濃縮培養液中に細胞ペレットを再懸濁します縮尺希釈 Y27632 阻害剤の濃縮 (材料の表を参照してください)。
  6. 解離細胞の細胞数を実行し、2 x 105 4 x 105の密度でマトリックス コート 6 ウェル プレート上のセルを replate します。

2. 二重融合レポーター遺伝子で Ips の伝達

  1. ルーチンに従って 6 ウェル プレートで Ips を通過し、濃縮培養液を追加 (参照材料表) 含む 6 μ G/ml hexadimethrine ブロマイド。
    注:理想的なコロニーのサイズは 200-400 のセル/植民地最高の伝達効率をもたらすためです。
  2. ホタル ルシフェラーゼと緑の蛍光蛋白質 (流 eGFP) 4 ° C で 2 時間 50,000 x gで SW 29 ローターと堆積物の遠心分離によって人間ユビキチン プロモーター-C によって駆動を運ぶ自己不活性のレンチ ウイルスを集中します。
  3. 10 の感染 (MOI) の多様性で 6 ウェル プレートで Ips にウイルスの集中を追加し、5% CO2で 37 ° C で一晩インキュベートします。
    注:感染症の多様性は、蛍光活性化細胞 (FACS) スキャンを選別した単量体の蛍光タンパク質の発現によって決定されました。
  4. 次の日は、300 x g 6 分間室温で iPSC 6 ウェル プレートの遠心分離によってウイルスを削除します。
  5. 濃縮培養液で毎日メディアを変更 (材料の表を参照) とプロトコルに従って通路。EGFP の近似伝達効率を決定するための蛍光顕微鏡を利用します。
  6. 30-40% の効率で FACS の並べ替えに十分です。場合は、少なくとも 30-40% の細胞表現 eGFP eGFP を表現する hiPSCs の FACS に進みます。
  7. 前のヴィヴォ流活動を確認するには、順に FACS ウェルあたり 5,000 の細胞の密度で GFP を発現している細胞をプレートします。
  8. 導入された細胞を孵化し、非導入細胞 (負の制御として役立つ) 発光レポーターのプローブ D-ルシフェリン (100 μmol/L) 6 h の測定マイクロ プレート蛍光と発光します。

3. 移植免疫不全マウスにおける奇形腫形成の背側の麓の Psc の

  1. 組換え細胞解離酵素ミックス ダブル融合レポーターの遺伝子 (流 GFP) 文化 (セクション 2 を参照) で導入した人間の Ips を含む 6 ウェル プレートごとの 1 つの mL を追加し、5 分間インキュベートします。
  2. 潜伏期間後、ピペットと表現による細胞を分散します。培地の等しいボリュームを追加し、4 分間 250 × gで遠心分離します。
  3. 遠心分離が完了したら、上澄みを吸引、行列の 30 μ L で細胞ペレットを再懸濁します、注入前にその生存率を維持するために氷の上に置きます。診断 1 x 10 の6セルの収穫を確認します。
  4. 二重融合レポーター遺伝子導入細胞を利用する場合は、マトリックスの 30 μ L の (セクション 2) からダブル ポジティブ FACS セルを中断します。
  5. 無胸腺 8-10 週間 1 L/分の酸素と 2 %isoflurance を用いたヌードマウスにおける麻酔し、酸素 1 L/min とメンテナンス 2% イソフルランを使用します。
  6. セル ・ マトリックスの混合物を注入 28.5 G 注射器を使用して合計 5 x 103 5 x 10 の6セル (注射あたり約 100 ul) の注射を目指して、麓の皮下組織に (材料の表を参照) を懸濁液。
  7. 長期間、大きな腫瘍の成長を期待してのマウスを維持するために計画する場合より尾側の注射部位を検討してください。
  8. 麻酔下の動物は外来まで加熱パッドで回復できる (通常 < 1 h) 呼吸の監視をすると爪先の色を皮膚外来まで。

4. 発光細胞生存率と奇形成長を評価するために移植細胞の (結合) をイメージング

  1. 接種後必要な縦長、マウスにレポーターのプローブ D-ルシフェリンの 375 mg/kg の腹腔内 (IP) 注入を実行します。
  2. IP 注射、イメージ、発光後 10 分は 5 分間隔で 1 分取得 windows を使用して 30 分間麻酔下の動物 (に記載されているステップ 3.5 として実行) 信号します。
    注:毎週画像取得をお勧めします。麻酔はイソフルレンを介して鼻の円錐形の吸入を提供するによって維持イメージ投射の間。
  3. データ分析のためバリ信号上に利益 (率 ROI) の領域を描画し、集録時間単位で 1 秒毎ステラジアン (/sr 光子/s/cm2) 平方センチメートルあたり最大光子の排出量を定量化するため、正常化します。

5. 奇形照射前臨床画像誘導照射 (図 1) を使用して

  1. 100 %1 L/分の流量で酸素の 2% イソフルランを使用してノックダウンのボックスにマウスを麻酔します。マウス完全に麻酔をかけられ後、は、画像誘導の前臨床照射のベッドにそれを転送 (材料の表を参照してください)。2% イソフルレンで麻酔を維持継続を介して鼻の円錐形。
  2. 400 投影像 40 kVp、2 mA x 線ビームを使用して 360 ° のセットとしてマイクロ CT 画像を取得し、0.2 mm の等方性ピクセル サイズの体積のイメージにそれらを再構築します。
  3. RT_Image ソフトウェア パッケージ (http://rtimage.sourceforge.net/) を使用してマイクロ CT 画像を用いた放射線治療を計画し、治療を行います。
    注:使用される治療計画は、2 つ 225 kVp x 線ビーム、マウスの残りの部分の表面を幅木と基になる臓器を温存しながら表面的なターゲットの奇形を通過する指向で構成されます。梁の露出時間は、ターゲット腫瘍部の線量が 6 Gy 四半期システム校正データに基づいて調整されます。
  4. ターゲット腫瘍に 18 Gy の合計を提供する 3 つの連続した日に治療のプロセスを繰り返します。
  5. 動物ケア標準後処理を維持します。

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結果

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注入されたマウスは通常 4-8 週間バリ (図 2) をイメージングによって確認された後奇形成長形成を示します。ルシフェラーゼ信号 (図 2) の重要な減少の結果セル配信後 1 ヶ月を与えられた 18 Gy の累積線量で照射したとき、腫瘍は大幅に縮小されます。重要なは、正常組織の放射線照射のサイトから 5 ミリメートルで撮影は重要な損害 (図 3) に表示されません。

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図 1: 気管支腔内照射で腫瘍の治療プロトコルの概略図。(A) 麻酔下の動物...

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ディスカッション

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前臨床データと「幹細胞ツーリズム」の犠牲者からの逸話的なケース奇形を発症するリスクが PSC 治療23に関連付けられている深刻な欠点であることを確認します。予防し、治療の幹細胞治療に関連付けられている悪性腫瘍のリスクに慎重なアプローチの開発は、したがって、再生幹細胞療法の臨床の翻訳を促進する上で重要なステップです。この記事では、マウス モデルにおける気管支腔内照射を用いた PSC 関連付けられている奇形の治療を特定する方法を説明し、バリ イメージングを用いた照射腫瘍の動的な萎縮を示した。

人間の Ips を活用、リプログラミング法レンチ ウイルスによって作成された、生体内で奇形の形成を要約するヌードマウス モデルで注入します。裸のマウスの使用は、細胞の異種間注入による初期免疫拒絶反応を回避できます。免疫欠損マウスの使用は、発癌性の可能性を増強する、間同じプロトコルはマウスの Psc を利用した免疫マウスにおける適用でした。我々 はさらに配信された細胞のシリアル生物発光イメージングを有効に二重融合レポーターの遺伝子のこのペーパーで使用さ...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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著者は国家機関の健康 R01 HL134830 (PKN)、K08 HL135343 (KS)、および 5F32HL134221 を感謝したい (JWR);ハワード ヒューズ医学研究所 (ASL);彼らのサポートのためスタンフォード大学心臓血管研究所 (ASL)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Induced Pluripotent Stem Cell Control LineStanford UniversityNguyen Labof iPSC
Corning matrigel basement membrane matrix 354234Fisher ScientificCB-40234Cell culture of iPSC
Essential 8 culturemedium ATCC-The global bioresource center30-2203Cell culture of iPSC
Tryple EGibco12605-036iPSC
Y27632阻害剤2 HCL(ROCK阻害剤)Fisher ScientificS104950MGiPSC
LentivirusCyagenP170721-1001cjn融合レポーター遺伝子によるiPS細胞の形質導入
ポリルブレン感染/トランスフェクション試薬ミリポアシグマTR-1003-GiPSCの二重融合レポーター遺伝子
による形質導入ユビキチンプロモーターによって駆動されるFluc-eGFPレポーター遺伝子スタンフォード大学Sam Gambhir研究室二重融合レポーター遺伝子によるiPS細胞の形質導入
D-ルシフェリン・パーキン・エルマー122799二重融合レポーター遺伝子とBLI
フローサイトメーター(BD FACSARIA III)nbsp;FACSAriaTransduction of iPSC with double fusion reporter gene
spectrofluorometer (Glomax Navigator System)Promega Bio Systems, Sunnyvale, CAGM2000Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Xenogen IVIS 200 パーキン・エルマー124262BLI
イソフルランSigma-AldrichCDS019936照射
X-Rad SmART 画像誘導照射器 Precision X-ray Inc.、ノースブランフォード、コネチカット州X-Rad SmART照射
RT_Imageソフトウェアパッケージスタンフォード大学(http://rtimage.sourceforge.net/)RT_Image v0.2β照射
Cell culture の細胞培養 細胞培養 二重によるiPS細胞の形質導入&

参考文献

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