Method Article

サイズ、形状、および結合のアストロ サイトのネットワークの方向性を分析

DOI:

10.3791/58116

⸱

October 4th, 2018

 ,  , 
1Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central, and Département de Neurosciences, Université de Montréal, 2Faculté de Médecine Dentaire, Université de Montréal

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでアストロ サイトのネットワークの組織を評価するためのプロトコルを提案する.この方法では、細胞数、サイズ、領域、および核内の位置などのこれらのネットワークの記述対策を提供するためにバイアスを最小限に抑えます。異方性は、ベクトル解析と評価されます。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アストロ サイトがシナプスおよび単一セルのレベルでだけでなく、ネットワーク レベルでも神経機能を調節することがますます明らかになった。アストロ サイトは、強く、ギャップ結合を介して互いに接続しているし、これらの接合点を介して結合はダイナミックで、厳しく規制されています。新興コンセプトはアストロ サイト機能を特化し、彼らが関連付けられている神経回路の機能に適応です。したがってより良いコミュニケーションを支配して、結合ルールを記述してその機能を理解するため、アストロ サイトのネットワークの様々 なパラメーターを測定する方法が必要です。

ここでは、画像解析ソフトを使用して (例えば.、ImageJFIJI)、色素結合によるアストロ サイトのネットワークの共焦点画像を分析する手法について述べる。これらのメソッドにより 1) 自動および公平な細胞の検出ラベル、2) 3) 色素ネットワーク内で拡散し、4) 対象地域内ネットワークの再配置の優先配向の計算ネットワークのサイズの計算.

この分析は、特定の領域のアストロ サイトのネットワークを特徴づける、さまざまな機能に関連するさまざまな分野のネットワークを比較または結合に対して異なる効果をさまざまな条件下で得られたネットワークを比較に使用できます。これらの観察は、重要な機能を考慮する可能性があります。例えば、どこ我々 は以前アストロ サイトのカップリングはニューロンのリズミカルな破裂1に強壮剤からの発火パターンを切り替える機能のために不可欠に、三叉神経核のアストロ サイトのネットワークを分析します。サイズ、閉じ込め、この核におけるアストロ サイトのネットワークの優先配向を測定することによってそれらを囲む機能ドメインについての仮説を構築できます。いくつかの研究は、いくつかの名前の視覚野と視床のバレル皮質、側方の優れたオリーブ、嗅糸球体、感覚核を含むいくつかの他の頭脳区域同様の分析から寄与するかもしれないことを提案します。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多くの研究は、亜細胞やシナプス レベルでニューロン ・ グリア対話がシナプス伝達と神経機能への影響を持つことができますどのように説明しています。アストロ サイトが周囲の神経細胞の活動に敏感であることは周知します。実際には、グルタミン酸、GABA、アセチルコリン、ATP (以前公開されたレビュー2,3,4参照) を含む多くの神経伝達物質の受容体があります。その見返りに、アストロ サイト処理 ensheath シナプス要素と影響神経活動の両方あると櫛谷サイトで細胞外のイオンの恒常性を調節し、いくつかの要因やグルタミン酸、D-セリン、ATP などの送信機を解放して5,6,7。

アストロ サイトのカップリングは空間的に調整され、エリアが明確な解剖学的特徴の神経細胞の分割に対応する証拠と、アストロ サイトのネットワーク レベルで神経機能を調節することがまた考えが出現しました。(感覚的表現と地域) のような区画は、アストロ サイトが他のアストロ サイトの近くにあるものだけではなく、同じ機能を提供するカップルのことを示し....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべてのプロシージャは健康の研究のカナダの協会の規則によってすみかし、モントリオール大学のアニマル ・ ケアおよび使用委員会によって承認されました。

1. ラット脳スライスの準備

  1. ショ糖ベースのソリューション (表 1) の 1 L と 1 L 標準人工脳脊髄液 (アプライド) (表 2) を準備します。
  2. バブル 95% O2と 5% CO2 (カーボゲン ・) 30 分間のミックスとショ糖・ ベースのソリューションのソリューションが寒いが、ない完全冷凍するまで約 30 分間-80 ° C でそれを配置する前に。脳のスライスに切断バッファーとしてこの冷たいショ糖を使用します。アイス冷凍庫から取除かれればそれを続けます。
  3. カーボゲン ・全体の実験を通して、アプライドをバブルします。スライス ストレージとパッチ クランプとアストロ サイトの biocytin 充填が実行されます perfusing のバッファーとしては、このソリューションを使用します。保持室カットされますすぐと脳スライスの預金をスライス回復を準備します。
    メモ: スライス回復保持チャンバー カスタムメイドできるし、底からカーボゲン ・を引き出すにチューブが挿入されるアプライドで満ちている大きいよく中断下部にメッシュの 1 つの小さな井戸か....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脳の細胞間の結合はなく静的ではなく動的に多くの要因によって規制です。説明する方法は、異なる条件の下で明らかにアストロ サイトのネットワークを分析して NVsnpr の組織を理解するために開発されました。これらの結果は、既に公開された1されています。3 つの異なる条件で NVsnpr の背の部分の単一のアストロ サイトの biocytin 充填を行った: Ca2 +(制御の条件の不在であらゆる刺激)、残りの部分で-無料の条件、および次の電気刺激プロジェクトの核に感覚繊維。図 6A-Cの左側に各条件のアストロ サイトの biocytin 充填実験の設定を示します。

Biocytin ラベル セルのネットワーク コントロール条件で観察し、, 安静時 NVsnpr アストロ サイト間結合セルの基底状.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

電気生理学的方法があり、アストロ サイト23,24間結合機能を評価することができます。ただし、これらのメソッドは、アストロ サイト ネットワークの解剖学的配置に関する情報を提供できません。研究の数はすでに「色素- またはトレーサー カップリング」、ようここで発生することのみの一部電気生理学的方法25,26,27, 示唆によって検出されたセルを結合を示している、この方法で検出された細胞の数を過小評価します。それにもかかわらず、これはまだ結合を視覚化するための最良の方法です。ギャップ接合20に浸透して 1 1.2 KDa より小さい分子トレーサーを使用する場合は、大きい色素結合が得られます。蛍光グルコース誘導体 (2-NBDG) または (Alexa 染料かルシファー黄色) のような蛍光マーカ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品はカナダ協会の健康研究、助成/賞数によって資金を供給: 14392。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
NaClッシャーケミカルS671-3
KClフィッシャーケミカルP217-500
KH2PO4ッシャーケミカルズP285-500
MgSO4>フィッシャーケミカルズM65-500
NaHCO3フィッシャーケミカルズS233-500
C6H12O6 無水デキストロースフィッシャーケミカルD16-500
CaCl2 二水和シグマC70-500
ショ糖シグマS9378
D-グルコン酸カリウム塩ΣG45001
MgCl2 anhydrousシグマM8266
HEPESシグマH3375
EGTAシグマE4378
ATPトリス塩シグマA9062
GTP<サブ>トリス塩シグマG9002
バイオシチンシグマB4261
カルベノキソロン二ナトリウム塩シグマC4790
アビジン-ビオチン複合体 : ABC キットVestor laboratoriesPK-4000
Streptavidine-alexa 594Molecular ProbesS11227
TritonFisher ChemicalsBP151-500
XyleneFisher ChemicalsX5-1
水性封入剤 1 : Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
トルエン系合成樹脂封入剤 : パーマウントフィッシャーケミカルズSP15-100
スライド乾燥ベンチフィッシャーブランド11-474-470
ビブラトームライカVT 1000S
顕微鏡カバーガラスフィッシャーブランド12-544A
顕微鏡スライドカラーフロストフィッシャーブランド12-550-413
PFAFisherchemicals04042-500
オリンパス FluoView FV 1000 共焦点顕微鏡オリンパス
40X 水浸レンズオリンパスLUMPLFLN40XW
20X 水浸レンズオリンパスXLUMPLFL20XW
4X 水浸レンズオリンパスXLFLUOR4X/340
マイクロピペットプーラーサッター機器P97
マイクロマニピュレーターサッター機器MP 225
カメラ CCDソニーCX-ST50
黒と白のモニターソニーSSM-125
Digidata分子デバイス1322A
パッチクランプアンプ軸索機器Mulitclamp 700A
電気生理学取得ソフトウェアMolecular devicespClamp 8
電気生理学解析ソフトウェアMolecular devicesClampfit 8
イメージング解析ソフトウェアImageJFIJIオープンソースソフトウェア。プラグインパッケージを含むFIJIバージョン。
ベクター画像エディタAdobeIllustrator CS4
スプレッドシートアプリケーションMicrosoft OfficeExcel 2010
フィズズフィズ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus. Glia. 66 (2), 311-326 (2018).
  2. Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. Glial calcium: homeostasis and sign....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Astrocyte Network AnalysisImageJ FIJIConfocal Image AnalysisDye Coupling DetectionNetwork Size CalculationPreferential Orientation MeasurementCell Detection AutomationROI Tracing MethodVector Normalization TechniqueTrigeminal Nucleus Study

Related Articles