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方法論記事

Luminophore 金の結合によるウシ血清アルブミンの様々 な立体構造の形成

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DOI:

10.3791/58141

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2018年8月31日

 , 
1Department of Physics and Optical Science, Center for Biomedical Engineering & Science, University of North Carolina

この記事について

サマリー

金陽イオン (Au(III)) ウシ血清アルブミン (BSA) としてコンフォメーション依存のユニークな BSA Au 蛍光を特徴付けるのためのと同様、提示の様々 なコンフォメーションにバインディングを勉強のためのプロトコル。

要約

示されたプロトコルの目的は BSA、構造変更によって誘発される赤い蛍光を降伏への金 (iii) バインドのプロセスを研究する (λem = 640 nm) BSA-Au(III) 複合体の。メソッドは、赤い蛍光性の出現は、BSA のコンホメーションの pH による平衡遷移と相関していることを表示するために pH を調整します。赤蛍光 BSA-Au(III) 複合体は、BSA の「A フォーム」の構造に対応する pH 9.7、以上の調整でのみ形成できます。Au のモル比に BSA を調整して錯結合のプロセスの経過を監視するためのプロトコルを説明するとします。BSA、赤色の蛍光を出すあたり金 (iii) の最小数は、7 時より小さいです。BSA に複数の金 (iii) 結合部位の存在を説明するための手順でプロトコルについて述べる。まず、銅を追加することによって (Cu(II)) またはニッケル (Ni(II)) 陽イオン錯に続いて、この方法については明らかに結合部位錯赤の蛍光体ではないです。第二に、チオール保護剤によって BSA を変更して、別の nonfluorophore 形成錯結合部位が明らかにされます。第三に、BSA の構造を変更するには、切断とキャッピングの二硫化物結束の可能な錯結合サイトを示します。BSA のコンホメーションと錯バインディングを制御する、説明されたプロトコルは、他のタンパク質と金属イオンとの相互作用を研究に一般に適用できます。

概要

Uv (紫外線) を出展 BSA Au 化合物-顕著なと興奮の赤蛍光ストークス シフト、もともと謝らによって合成されています。1一意かつ安定した赤い蛍光センシング2,3,4の5,6、7、やナノメディシン8 のイメージングなどの分野でさまざまなアプリケーションを検索できます。 ,9,10、11,12,13。この化合物は、近年14,,1516ナノサイエンスの分野で多くの研究者によって広く研究されています。BSA Au 化合物は、Au25ナノクラ スターとして解釈されています。本手法の目標して詳細にこの化合物を調べ、赤い蛍光性の起源を理解することです。提示されたアプローチで、複数の Au 結合部位の存在と蛍光、Au25ナノクラ スターの単一サイトの核に代わるものの起源を示すことができます。その他タンパク質17,18,19金 (iii) との複合体の本質的な蛍光特性を変更する方法を勉強する、同じアプローチを使用できます。

赤蛍光 BSA Au 化合物の合成には、Au (BSA:Au) の蛍光強度と励起発光マップ (EEM)20のピークの場所を最大限に BSA のモル比の狭いコントロールが必要です。それ示すことができる、バインドする錯の複数の結合部位が存在するアスパラギン フラグメント (または Asp フラグメント、BSA の N 末端の最初の 4 つのアミノ酸残基) を含む21,22。金 (iii) を調整して赤 fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III))20の機構に関与する、BSA (システイン-34) の 34番目のアミノ酸も表示されます。すべてのシステイン Cys ジスルフィド結合を切断、すべてチオール、赤い蛍光をキャッピングは作り出された ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III))。これは赤色の蛍光を生成する錯結合部位としてシステイン Cys 二硫化物結束の必要性を示します。

タンパク質化学の技術は、ナノ科学コミュニティの BSA-Au(III) 錯体の研究に広く使用していないされています。ただし、これらの複合体、同様 BSA 錯結合部位の詳細な理解を得るための特定の側面を理解するこれらの技術を採用する価値のあること。この資料は、これらの技術のいくつかを示すものです。

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プロトコル

1. BSA-Au(III) 複合体の合成

  1. 高速液体クロマトグラフィー (HPLC) グレード水 5 mL 反応瓶で 1 mL に BSA の 25 mg を溶解します。
    注: ソリューションが明確に表示されます。
  2. 金 (III) 塩化物三水和物 (塩化金酸) を 5 mM HPLC グレードの水の濃度に溶解します。
    注: ソリューションは黄色で表示されます。この濃度で塩化金酸溶液は Au 比 1:13、BSA になります。
    1. また、どこの濃度と塩化金酸の溶液を調製 0.38 ミリメートルの間 (BSA:Au = 1:1) 20 mm (BSA:Au = 1:50) hplc グレードの水。
      注: 異なるギア比の BSA のゴールドは励起発光マップの大幅に異なる赤蛍光パターンになります。
  3. 37 ° C の水浴の BSA の反応バイアルを置き、精力的に磁性攪拌器を使用して 750 rpm で攪拌します。
  4. 攪拌を開始した後すぐに 1 mL の塩化金酸をソリューションに追加します。ソリューションの色は、黄色にクリアから変換する必要があります。
  5. 磁性攪拌器を使用して 750 rpm、37 ° C で 2 分の混合物をかき混ぜなさい。
  6. 反応バイアルに 1 M NaOH の 100 μ L を 12 の pH をもたらすにソリューションに追加します。
    注: 水酸化ナトリウムを追加すると、直後にソリューションする必要があります黄色茶色に少し暗くなるし、黄色に再度オンします。
  7. 2 h 750 rpm、37 ° C で攪拌し続けるソリューションは黄色から濃い黄色/茶色色にゆっくりと変更ください。この色の変化は、複雑な赤の蛍光 BSA-Au(III) の形成を示します。
  8. 2 日間室温で放置し、サンプルを許可するソリューションは引き続き黄色茶色に暗くし、蛍光強度が増加します。
    1. また、ソリューションの色が黄色茶色に進化するにつれてより多くの h を 12 の 37 ° C で攪拌し続けるサンプルをしましょう。

2. BSA-Cu(II)-Au(III) の合成

  1. HPLC グレードの水 1 mL に BSA の 25 mg を溶解します。ソリューションが明確に表示されます。
  2. 5 mM の濃度に HPLC グレードの水で銅の (II) 塩化物水和物を溶解します。ソリューションは、光を表示する必要があります青。
  3. 5 mL の反応バイアルに BSA 溶液の 1 mL を追加し、37 ° C の水浴の配置750 rpm で混合物をかき混ぜます。
  4. すぐに反応バイアルに銅の (II) 塩化物水和物溶液 0.5 mL を加え、2 分混ぜます。ソリューションは引き続きライト ブルー。
  5. 12 の pH をもたらすし、2 h のミックスすることができます 1 M NaOH の 75 μ L を追加します。ソリューションは、紫色になります。
  6. 5 mM の濃度に HPLC グレードの水で塩化金酸を溶解します。
  7. 反応バイアルに水溶液中の塩化金酸 0.5 mL を追加し、1 M NaOH を使用して 12 に pH を調整します。
  8. 2 h の反応混合物をかき混ぜなさい。
    注: ソリューションは、茶色の色に進化すべき。

3. BSA-Ni(II)-Au(III) の合成

  1. HPLC グレードの水 1 mL に BSA の 25 mg を溶解します。ソリューションが明確に表示されます。
  2. 5 mM の濃度に HPLC グレードの水のニッケル (II) 塩化物水和物を溶解します。ソリューションは、光を表示する必要がありますグリーン。
  3. 5 mL 反応バイアルに BSA 溶液の 1 mL を追加し、水浴に 37 oC. 炒め 750 rpm で混合物を置きます。
  4. すぐに反応バイアルおよび 2 分のミックスにニッケル (II) 塩化物水和物溶液 0.5 mL を追加します。
    注: ソリューションのままライト グリーン。
  5. 12 の pH をもたらすし、2 h のミックスすることができます 1 M NaOH の 75 μ L を追加します。
    注: ソリューションは、濃い黄色になります。
  6. 5 mM の濃度に HPLC グレードの水で塩化金酸を溶解します。
  7. 反応バイアルに水溶液中の塩化金酸 0.5 mL を追加し、12 に pH を調整します。
  8. 2 h の反応混合物をかき混ぜなさい。
    注: ソリューションは、茶色の色に進化すべき。

4. [Cys34-capped-BSA]-Au(III) の合成

  1. N-エチルマレイミド (NEM) 2 mg をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.4) 1 mL に溶かしてください。
  2. PBS NEM 溶液 1 mL に BSA の 2 mg を溶解します。
  3. 5 mL の反応バイアルに溶液を移し、1 時間 500 rpm で 20 ° C でかき混ぜます。
  4. 500 mL の PBS、未反応 NEM を削除する一晩マグネチックスターラーで攪拌 50 回転で 12 kDa の透析チューブを使用して、ソリューションを dialyze します。
  5. 0.4 mM の濃度に PBS で塩化金酸を溶解します。
    注: ソリューションは、淡い黄色になります。
  6. 反応バイアルを 37 ° C の水浴に転送します。750 rpm で攪拌します。
  7. すぐに反応バイアルに塩化金酸溶液の 1 mL を追加し、2 分のミックスすることができます。
  8. 12 の pH をもたらすし、2 h のミックスすることができます反応バイアルに 1 M 水酸化ナトリウムの 75 μ L を追加します。

5. [all-thiol-capped-BSA]-Au(III) の合成

  1. 2 M 尿素と 50 mM 重炭酸アンモニウム (NH4HCO3、pH 8.0) HPLC グレードの水のソリューションを準備します。
  2. 上記のソリューションと 5 mL の反応バイアルへの転送の 1 mL に BSA の 3.3 mg を溶解します。
  3. 0.25 M の原液を作る tris(2-carboxyethyl) HPLC 水 1 mL で TCEP 62.5 mg を溶解してホスフィン (TCEP)。
  4. TCEP の最終濃度が 8 mM になるまで反応バイアルに TCEP の原液を追加します。
  5. 50 ° C で 1 時間湯せんでソリューションを孵化させなさい磁性攪拌器を使用して 500 rpm で攪拌します。
  6. 完全に部屋の温度に冷却ソリューションを許可します。
  7. HPLC グレードの水の 1 mL の NEM の 12.5 mg を溶解することにより 100 mM NEM の原液を準備します。
  8. NEM の最終濃度が 16 mM まで反応バイアルに NEM の原液を追加します。
  9. 20 ° C で 2 時間を結合するソリューションを許可します。500 rpm で攪拌します。
  10. 過剰な TCEP、満場一致、尿素を削除する 50 mM NH4HCO3の 500 mL で一晩マグネチックスターラーで 50 rpm で液を攪拌 12 kDa の透析の管を使用して、ソリューションを dialyze します。
  11. 反応バイアルを 37 ° C で水のお風呂に移動し、750 rpm で攪拌します。
  12. 0.66 mM の濃度に HPLC グレードの水で塩化金酸を溶解します。
  13. すぐに反応バイアルに塩化金酸溶液の 1 mL を追加し、2 分のミックスすることができます。
  14. 解決の pH は 12 まで 1 M NaOH を追加し、2 h ミックスし続けるソリューションします。

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結果

BSA-Au(III) 複合体の蛍光からそれが観測されています BSA の本質的な青色蛍光の変換 (λem = 400 nm) 赤い蛍光 (λem = 640 nm) pH 9.7 平衡については、遷移 (図 1)。BSA-Au(III) EEM Au モル比異なる BSA では図 2に示すように、このデータは、どのように異なる励起波長で同じ発光波長が得られますモル比を変更することを示しています。金 (iii)、ni (ii), 銅 (ii) は、競争力のある BSA (図 3) で知られているサイト (Asp フラグメント) にバインドします。Cys34 キャップ BSA 錯結合 EEM ピーク パターンの変更を示しています、これらの結果を示す蛍光パターンを変更する特定の結合部位の変更方法。すべてチオール頂いた B...

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ディスカッション

PH 12 で作製した BSA-Au(III) 化合物展示発光波長λemで赤い蛍光性 = 640 nm の紫外線 (UV) 光 λexで興奮すると = 365 nm (図 1 a)。赤い蛍光性の出現は遅いプロセスであり、最大の強度を高めるため室温で数日をかかります。赤の蛍光を高速生成する高温を利用できますが、37 ° C で反応を実行する最適な結果なります。2345 ° C 以上の温度で蛋白質の不可逆的な劣化が起こります。調整 pH の BSA は、その高齢者 (pH > 10) に変換、立体配座21 (「A フォーム」) は赤い蛍光性のための重要なpH は中性から出現する赤い蛍光性 (図 1 bC) のしきい値を決定する基本的な細かく調整されます。最大の赤色蛍光強度、pH は 11 の上調整してください。赤い蛍光性が基本 (pH...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

東南は、シャーロットからデューク特別なイニシアチブ基金、ウェルズ ファーゴ基金 PhRMA 財団、スタートアップ資金、ノースカロライナの大学からの支援を認めています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ウシ血清アルブミン(BSA)、96%Sigma-AldrichA5611
塩化金(III)三水和物、99.9%Sigma-Aldrich520918
銅(II)塩化二水和物、99.999%Sigma-Aldrich459097
ニッケル(II)塩化六水和物、99.9%Sigma-Aldrich654507
N-エチルマレイミド(NEM)、>99.0%Sigma-Aldrich4259
トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩 (TCEP)、>98.0%Sigma-AldrichC4706
水酸化ナトリウム、>98.0%Sigma-AldrichS8045
尿素、99.5%Chem-Implex Int'l30142
ホスケート緩衝生理食塩水 (PBS)CorningMT21040CV
重曹アンモニウム、99.5%シグマ-アルドリッチ9830

参考文献

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