方法論記事

無細胞性と細胞の肺転移モデル

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DOI：

10.3791/58145

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2018年8月19日

 , 
1Department of Surgery, Houston Methodist Hospital Research Institute, 2Division of Thoracic Surgery, Department of Surgery, Weill Cornell Medical College, Houston Methodist Hospital

この記事について

サマリー

ここでは、プロトコルを提案前のヴィヴォ肺がんモデルの腫瘍の進行の手順を模倣し、原発巣を特定するのに役立ちます循環腫瘍細胞と転移巣。

要約

腫瘍の進行のさまざまな時点で腫瘍の細胞を分離することは困難です。自然な行列と腫瘍細胞との相互作用、栄養素の継続的な流れを示すことができる前のヴィヴォ肺モデルだけでなく、腫瘍細胞が通常の細胞成分と相互作用を示し、天然マトリックス モデルを作成しました。前のヴィヴォ無細胞性肺モデルは、ラット心臓肺ブロックを分離し、decellularization プロセスを使用してすべてのセルを削除することによって作成されます。右主気管支は縛し、腫瘍細胞は注射器で気管に格納されます。セルは移動し、左肺を設定します。肺は、肺動脈が、閉回路でメディアの継続的な流れを受け取るバイオリアクターに格納されます。左肺上に成長した腫瘍は、原発腫瘍です。循環のメディアに分離されている腫瘍細胞は循環腫瘍細胞と右肺に腫瘍細胞が転移巣。携帯電話前のヴィヴォ肺モデルが decellularization プロセスをスキップすることにより作成されます。各モデルは、異なる研究の質問に答えるに使用できます。

概要

がん転移はほとんど癌関連死の背後にある原因、がんと闘うための努力で究極の挑戦を提起します。このメソッドの全体的な目標は、三次元 (3 D) 細胞の増殖だけでなく、流れの次元四次元 (4 D) の細胞培養のプロトコルを設計することです。[すなわち腫瘍、循環腫瘍細胞 (CTCs) と転移巣] 転移プロセスの 3 つの異なるフェーズを表します。

過去 3 年間は、世界中の科学者は、比類のない豊富な治療法や進行自由な存続の見通しを改善した別の癌で転移性進行のメカニズムを理解するための情報を得られました。乳がんなどのいくつかの癌の臨床管理は著しく1;ただし、いくつかの癌、肺癌などまだ貧しい人々 の生存の2があります。In vitroとin vivoの動物モデルは病気の開発を支えるメカニズムに新しい洞察力を生成するのに尽力されています。ここ数年で細胞由来の異種移植片 (CDX) と患者由来の異種移植片 (PDX) もっと興味彼らは人間の腫瘍の3成長カイネティクスなど多くの関連する機能、組織学的特徴、行動を維持するとされています。特性、および療法への応答。ただし、各モデルには、CTC の形成と遠隔臓器4,5,6に転移のメカニズムを理解する限界があります。

最近では、オルガンのリエンジニア リングおよび灌流ベースの細胞培養の概念を用いた 4 D前のヴィヴォ肺の癌モデルを開発しました。がん分泌と同様人間と時間をかけて成長 perfusable 腫瘍結節を形成することによって人間の肺の癌の成長を模倣したタンパク質生産7。それは癌患者の予後を予測するとまたシスプラチン治療8,9時に腫瘍の回帰分析による治療反応を示す遺伝子発現シグネチャを表します。肺のモデルは、それは転移巣を形成することができますので、さらに変更されました。Ctc は、血管系に原発巣および intravasate から開発し、対側肺転移巣10を形成するために extravasate。遺伝子発現の研究では、転移巣、Ctc、原発腫瘍の明確な発現プロファイルと表現型10に必要な遺伝子のサブセットのアップレギュレーションを示唆しています。がんの患者さんで見られる生物学的条件の存在のためにこの転移プロセスが発生します。このモデルの利点は自然行列とアーキテクチャの存在と腫瘍結節の形成につながる栄養素の血流。さらに、それはまた時間をかけて腫瘍進行に及ぼす腫瘍微小環境や薬のさまざまなコンポーネントを勉強する機会を提供します。このモデルは、実験室のセットアップの癌細胞 (肺がん、乳がん、肉腫など) の範囲を拡大する使用できます。

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プロトコル

動物実験のためのプロトコルは、機関動物ケアとヒューストン メソジスト研究所利用委員会によって承認され、すべての規制、法律、ガイドライン、およびポリシーに基づき実施します。

1. ラット肺収穫

  1. ケタミン (100 mg/kg) とその麓のキシラジン (10 mg/kg) の腹腔内 (IP) 投与による 4-6 週齢雄 Sprague-dawley ラットを麻酔します。麻酔と後肢のつま先は、ピンセットでつままれて動きの不在を確認して、確認します。
  2. 10 分後胸部と腹部を剃るし、クロルヘキシジン綿棒で肌を拭いてください。
  3. 鉗子を拾って、使い捨てメスで切開は、皮膚を削除します。メスで切開して胸腔内を開き、左側の肋骨の前方側および横隔膜の右側をハサミで切断することによって両側開胸下を実行します。
    注: これは非生存の手術です。
  4. 胸郭をホールド アップし、27 G の針を使用して心臓の右心室にヘパリン (1,000 単位/mL) 2 mL を注入します。
    注: これは肺の血栓の形成を防ぐ。
  5. 完全にハサミで胸郭を取り出し、血が出るまでに、通気孔として左心室に 18 G 針を置きます。その後、ヘパリン リン酸緩衝生理食塩水 (12.5 単位/ml; ヘパリン PBS) 15 mL を 25 G 針を使用して右心室に注入します。
  6. 劣ると優れた下大静脈、心臓の右側にある 2 つの大きな静脈を切り取って追加 10 ml ヘパリン PBS 27 G の針を使用して右心室の肺をフラッシュします。
    注: 下大静脈は大きな船として心の底の下で視覚化される赤い血でいっぱい。同様に、心臓の上の部分で、上大静脈を視覚化して、大きな船として。
  7. 甲状腺の基地で気管をカットします。半奇静脈とアーチで大動脈の枝のレベルで下行大動脈を慎重に取り外します。
  8. 胸腔内とラットの体の残りの部分から心臓肺ブロックを取り出してください。
  9. 右と左の心室の半分を切断することによって心を実行し、肺動脈 (PA) に右心室を介してカスタム済み 18 G ステンレス鋼針カニューレを配置します。
  10. 2-0 シルク ネクタイでカニューレを固定し、慎重に右心室と心房を公開します。
  11. 左心室内女性ルアー隔壁を置き、2-0 シルク ネクタイで固定します。
  12. PA カニューレを通じてヘパリン PBS の 20 ml 心臓肺ブロックをフラッシュし、文化メディアまたはヘパリンの PBS を含む 50 の mL の管にそれを置きます。
    注: セルラー モデル 3.1 バイオリアクターを設定する手順に進みます。無細胞性モデル、decellularization の 2.1 手順に進みます。

2. 肺 Decellularization

  1. Decellularization ユニットの準備
    1. ボトル キャップで 2 つ穴ピアスと穴 (図 1 aと1 b) に女性のルアーをスナップして各 decellularization 商工会議所/ボトルを準備します。それを反対側に黒のナイロン リングで固定します。同様に、静脈内投与セットの添付ファイル (図 1) のための別のボトル キャップで 1 つの穴をドリルします。
      注:図 1 aおよび1 bの 2 つの異なる側面から同じペットボトルのキャップです。図 1は、2.1.1 の手順で上記のようの単一の穴と異なるキャップです。
    2. ボトル キャップ (図 1 aと1 b) の中から女性のルアーに (肺動脈または PA 終了) で 0.5 インチ管と 6 インチ管 (図 1 j) を添付し、両端男性ルアーロックを添付します。Decellularization 商工会議所/ボトルと 500 mL のボトルでロックを設定します。
    3. 女性ルアーのカートリッジ (図 1) によってポンプ ヘッド (図 1Eと1 階) に取り付けられているポンプ チューブ (図 1 H) のどちらかの端に 2 つの 2 フィート チューブ (これは男性ルアーロックで接続されている) の一端を接続します。ロック (図 1I)。
    4. 2 フィートからチューブの (ステップ 2.1.3) 各 decellularization 商工会議所/ボトル キャップ (図 1 L) に女性ルアー ロックの頭に他の端点を接続します。
    5. 250 ml セット ボトル キャップと decellularization c に接続されている 2 フィートのチューブを取り付け、遠位端に挿入されます (図 1) 静脈内投与セットの近位端でスタンドに倒立ボトルを掛けることによって PBS (PBS の 200 mL の) でボトルをヘパリン化先のハンバー/ボトル PA 端 (図 1 b)。廃棄ボトルにこの 2 フィートのチューブを接続します。
      注:図 1 Kで示すように、ボトルは段ボールに設定されます。点滴のチューブは肺足場の試薬を分注するハンギング ボトルから出てくる。
  2. 肺 decellularization プロセス
    1. Decellularization 商工会議所/ボトルで自由に流れるまで 30 mm Hg (図 1 K) の生理学的な灌流圧でヘパリンの PBS を実行、その後、PA カニューレを介して PA まで心臓肺ブロックを取り付けます。
    2. Decellularization 商工会議所/ボトル中余分なバッファー/ソリューションに取得しますので、ポンプを連続的に実行してください。
    3. 最初の洗浄水 (図 1 K) の 30 mm Hg の潅流圧で 15 分の PA のヘパリンの PBS を実行します。
    4. 0.1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 脱イオン水とヘパリンの PBS ボトルを交換し、decellularization の 2 h の肺を灌流します。
    5. Decellularization 後、15 分間肺足場をオートクレーブ処理した純水を灌流します。
    6. 次に、脱イオン水で 10 分間の 1% 非イオン性洗剤を灌流します。
    7. 500 ml ボトル内キャップをそのままハング肺を維持する 1 x 抗生物質 (ペニシリン-ストレプトマイシン アムホテリシン) を添加したオートクレーブの PBS の decellularization の商工会議所/ボトルを交換してください。
    8. 静脈内投与セット、decellularization 室肺動脈末に廃棄容器に接続されている 2 フィートのチューブを入れて、6 mL/分 (図 1 L) ポンプを実行を破棄します。
    9. 72 h の肺灌流し、抗生物質 12 時間間隔で PBS を変え続けます。
      注: 無細胞性肺は即時の使用の準備ができて。必要になるまで-80 ° C で保存できます。ピンク色の斑点や血栓は、肺の葉で明確に視覚化することは、肺を破棄します。ランダムに DNA や病理組織学的にテストすることが可能です。細胞や DNA の 99.9% が洗い流されるが、完全な無細胞性肺は表示されません。
      注: 細胞肺モデルを操作する場合は、decellularization をスキップします。収穫された肺 (ステップ 1) は、バイオリアクター内で直接設定できます。

3. バイオリアクター セットアップ

  1. バイオリアクター ボトルとセットアップに必要なアイテムを準備します。
    1. 等距離にある 1 つの 500 mL ボトルのキャップで 3 つの穴をドリルし、黒のナイロン リング (図 2 aおよび2 b) を使用してすべての 3 つの穴で女性ルアーを修正します。
      注: 2 つの穴で、ルアーロックでは、一方の端が瓶の内側を向く間「顔、外を終了します。
    2. バイオリアクターあたりポンプ チューブの 6、管内 2、チューブ、1.5 フィート管、2 フィート管と 10 フィートの人工チューブで 6 をカットします。
    3. ステンレス鋼、18 G の針をカットし、再度、気管カニューレの生体適合性のチューブの両端を接続します。
    4. オートクレーブ テープ (図 2) を使用して電磁ワイヤー メッシュ上の両端ルアーロック ロック コネクタを備えた人工チューブをラップします。
    5. オートクレーブ上記項目し、10 分のために軽い UV でそれらを保ちます。
  2. 適切な間隔で簡単に 500 mL のボトルに合わせてトレイの間通常のセル文化のインキュベーター (37 ° C、5% CO2) 内ポンプを設定します。
  3. ポンプ カートリッジの 70% エタノールをスプレー、ポンプに両端ルアーロック ロックのメスコネクタでポンプのチューブを接続します。
  4. ポンプ チューブとバイオリアクター内で 1.5 フィートのチューブのもう一方の端に、人工の一端 (流出) を接続して携帯文化のインキュベーター内電磁ワイヤー メッシュを包んだ肺を設定します。
  5. 無菌条件でキャビネット、バイオ セーフティにおけるバイオリアクター ボトルを設定します。
    1. PA を通して流れを制御する女性ルアーズの一つの頭に三方活栓 (黄色) を添付します。
    2. 別女性ルアー ロックの隔壁細胞 (図 2 f) 気管を通じて播種の一方向バルブ (青) に接続します。
    3. 外側にチューブの 2 を接続 (白) と、メディアを循環するボトルの内側にチューブの 6。2 フィートのチューブに男性ルアーロックを合わせて女性のルアーロック ラグ スタイル追加または何かを削除するへのアクセスを提供するために t シャツを添付してください。
    4. 3 ウェイ コネクタ (女性ルアー ラグ スタイル t シャツ) の開口部のいずれか一方向バルブを取り付けます。
    5. ルアーロックを男性と女性のルアーロックを 2 フィート管に接続します。
    6. 10 %fbs と 1% 抗生物質細胞培養培地 (セル条件によって異なります) と RPMI1640 の 200 mL を追加し、バイオリアクターをインキュベーターに転送します。2 つの開放端 (一方向バルブとティー コネクタ) に閉ループ型バイオリアクターに人工のチューブを接続します。
  6. チューブに気泡が存在しないので、あらかじめ 6 mL/分肺やチューブ、埋めるための細胞培養媒体の携帯文化のインキュベーター内でポンプを実行します。
  7. チューブが満ちている一度メディア、活栓を閉じるバイオリアクター ボトルから取り出してインキュベーター バイオリアクター ボトルの両端から、人工肺を切断してください。
  8. キャビネット、バイオ セーフティにおけるバイオリアクター ボトルを入れて、バルブ、文化メディアを渡す、男性のルアーロック コネクタを介して活栓に肺癌の足場 (無細胞性または細胞) の PA カニューレを取り付けます。
    注: ここでそれは無細胞性モデル (decellularization プロセスに続く) または新鮮な収穫心臓肺ブロックを使用することが可能 (ネイティブ ラット細胞はすなわち、細胞モデルをそのまま維持されます)。
  9. 空気を抜くと気管に絹糸によって気管カニューレを結ぶ片道活栓を通じて文化メディアを渡します。
  10. PA と気管の任意のねじれを避けるためにことを確認します。すぐ肺とバイオリアクターのボトル キャップ内部足場、再び、無菌、バイオリアクターをインキュベーターに転送し、6 mL/分の速度でポンプを起動します。
  11. すべて葉膨らまされると肺に良い形 (図 2) に見えるように 10-15 分間培地を実行します。

4. 転移モデルと細胞の播種

メモ: セルのシーディングは原発腫瘍の成長に関する上記の肺モデルに進みます。転移モデルのとおり肺足場 (無細胞性または携帯電話) を変更します。

  1. インキュベーターから肺足場とバイオリアクターを取り出して、キャビネット、バイオ セーフティにおけるそれを置きます。
  2. 気管を通じて培地 5 mL を渡すし、絞首刑とバイオリアクター キャップを開き、ルアーロック注射器を使用して肺の足場 (図 2 f)。
  3. この段階でもう一人は肺転移モデルの変更のために必要です。
  4. シルク 2-0 準備し、分岐ポイントで気管を通過する角度鉗子を使用を取得します。
  5. 分岐点で右肺に気管を結ぶ、文化メディアを渡すことにより肺気管を通じてメディアの自由な流れを確認します。
    注: 気管分岐時点で結びついている、一度気管を通じて播種された細胞、自動的に左葉にシードします。気管を通じてプッシュの培地で細胞を播種する前にテストできます。転移モデルでメディアは、のみを膨らませるが、左葉と右葉,10に移動します。
  6. 20 mL ルアーロック注射器を気管カニューレの上を設定し、RPMI1640 完全培地 (図 2 f) 50 mL に ATCC 肺癌細胞 (A549、H1299) を追加します。
  7. バイオ セーフティ キャビネットの播種細胞を実行します。注射器で細胞の 15 の mL を追加し、重力によって肺の葉を通過せてください。空気の泡が通過する前に、セルの残りの部分を追加します。
  8. 無細胞性肺癌播種、バイオリアクター瓶に滴り灌流のメディアを収集して気管を通過するもう一度 3 x みましょう。
    注: 灌流のメディアは時々 シードがん細胞にあります。したがって、効率的なシーディングのためメディア再び戻す気管内注射器を介して。
  9. 一度シード、シリンジは、15 分待つ、新鮮なメディアを追加、バイオリアクターをインキュベーターに返します。チューブ内の空気の泡を削除します。
  10. 6 mL/分でメディアを灌流するためにポンプを起動します。

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結果

ラットから採取した肺はそのまま血管と肺胞11 (図 3 aと3 b) を保持しています。Decellularization に無細胞性肺、エラスチン、フィブロネクチン、コラーゲンなどの細胞外マトリックス成分は11 (図 3、 3 D 3 e、 3 f) に保持されます。ヘマトキシリンとエオシン (H & E) によって観察することができる肺の存在のネイティブ ラット細胞の完全な除去につながる、decellularization 染色細胞、DNA 量 (の減少を示す DNA 解析11の欠落を示す図 3 Dと

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ディスカッション

前のヴィヴォ4 D 肺腫瘍の成長と転移研究室のセットアップを勉強する機会を提供します。ネイティブ肺マトリックスは、正常な組織への支援を提供し、組織形成、細胞分化、細胞マトリックス相互作用の細胞間相互作用を維持する複雑なシステムです。それは腫瘍の成長への影響や他の細胞との相互作用を研究する、腫瘍微小環境のコンポーネントを追加する機会を提供します。

肺の収穫は、前のヴィヴォ4 D 肺モデルの重要なステップです。胸部の開封後ヘパリン注射を管理するための遅延可能性があります、decellularization 中に試薬の自由な流れに影響を与えるかもしれない肺の血栓。無色の液体が口から来るまでヘパリンの PBS の適切なフラッシュは、セルラー モデルで特に重要です。PA に害を避けるために重要であるが、上大静脈の注意切削です。Decellularization プロセス中に気泡肺足場への移動を避けるために非常に重要です。空気泡の存在は、試薬の流れを止めることや不適切な decellularization に貢献遅く可能性があります。泡は 10-20 mL ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

分 p. キム第 2 ジョン ・ w ・ Kirklin 研究奨学金、ジョアン h. コーン研究賞とマイケル ・ m ・胸部手術、グラハム研究財団、ヒューストン メソジスト専門医師グループ許可のためのアメリカ連合から支援助成を受けた。アンについては、原稿の言語編集を感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Sprague Dowley ratHarlan206MMale
Chlorhexidine swabPrevantics, NY, USANDC 10819-1080-1
HeparinSagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USANDC 25021-400-10
18ゲージ針McMaster Carr, USA75165A249
2-0 silk tieEthicon, San Angelo, TX, USAA305H
Masterflex L/S ポンプCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USAEW-07554-80
Masterflex L/S ポンプヘッドCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USAEW-07519-05
Masterflex L/S ポンプカートリッジCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USAEW-07519-70
Tygon TubeCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA14171211
MasterFlex ポンプチューブCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA06598-16
メス ルアー ロック コネクタCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA45508-3475165A249
オス ルアー ロック コネクタCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA45513-04
ブラック ナイロン リングCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USAEW-45509-04
静脈内セットCareFusion41134E
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)Fisher ScientificCAS151-21-3
Triton X-100Sigma-AldrichX100-1L
AntibioticsGibco15240-062
Silicone OxygenatorCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USAABW00011Saint-GoBain-Wire
mesh1164610105LowesNew Yorkワイヤー
メスルアーラグスタイルTEEコールパーマー、イリノイ州バーノンヒルズ、米国45508-56
ルアー一体型ロックリングから200seriesバーブコールパーマー、バーノンヒルズ、イリノイ州、米国45518-08
ルアースレッドスタイルのカプラーコールパーマー、バーノンヒルズ、イリノイ、米国45508-22
クレーブコネクタICUメディカル11956
Hi-Flo & 貿易;4ウェイストップコックw /スイベルオスルアーロックスミスメディカルMX9341L
MasterFlexポンプチューブコールパーマー、バーノンヒルズ、イリノイ州、カニューレ用06598-13
男性メス州

参考文献

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