方法論記事

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

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DOI：

10.3791/58149

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2018年8月18日

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology and the Center for Human Immunology, University of Western Ontario, 2Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, 3Department of Respiratory Research, Aintree University Hospital NHS Foundation Trust

この記事について

サマリー

Efferocytosis、アポトーシス細胞の貪食除去は恒常性を維持するために必要な受容体と認識、キャニスター、アポトーシス細胞の内面化を可能にするシグナル伝達経路によって促進されます。ここで、efferocytosis の定量化と efferocytic シグナル伝達経路の活性の蛍光顕微鏡のプロトコルを提案する.

要約

Efferocytosis の規制を勉強してアポトーシス細胞の取り込みを正確に定量化する efferocytosis を制御するシグナル伝達と細胞プロセスをプローブすることができる方法が必要です。この数量は、アポトーシス細胞は efferocytosed、断片的、呼び出しと残留 unengulfed 細胞に対するアポトーシス ターゲットの efferocytosed 部分の間正確に記述することができます。 メソッドを実行することは困難することができます。フラグメント。記載方法は、正確にマクロファージなどの efferocytes の efferocytosis と efferocytic の容量のダイナ ミックスを定量化するためのアプローチのデュアル ラベルを利用しています。アポトーシス細胞の細胞質がアポトーシス細胞の表面ビオチン化可能ですが差別化と非内面内面の間すべてのアポトーシス細胞由来物質の監視を有効にするための細胞追跡染料にラベル付けされてアポトーシス細胞画分。Efferocytes の efferocytic 容量は、ライブまたは固定細胞の蛍光画像を撮影し、ストレプトアビジンの汚損によって差別化、内面化されたターゲット対連結の量を定量化によって決定されます。このアプローチは、フローサイトメトリー、すなわち efferocytosed アポトーシス細胞画分、生細胞顕微鏡による efferocytic のダイナミクスを測定する能力と非 efferocytosed の正確な描写などの方法と比べていくつかの利点を提供していますと、蛍光標識した遺伝子を発現する細胞の細胞内シグナル伝達の研究を実行する能力。組み合わせることで、このプロトコルで説明する方法は、正確に efferocytic 活動を定量化し、efferocytosis 中細胞のシグナル伝達経路を調査するために使用することができます柔軟な実験的アプローチのための基礎として機能します。

概要

アポトーシスまたはプログラム細胞死は、ほとんどの多細胞生物の発生、発達と恒常性1の重要な非常に調整される生理学的プロセスです。正常細胞の代謝回転と萌芽期の開発に関与している、に加えてアポトーシス組織から感染したり、損傷した細胞の除去を有効にし、感染、炎症、癌とも医療介入による応答で引き起こされることができます。放射線療法やステロイド1。アポトーシス細胞を公開"を食べる-私"専門家と非専門家の食細胞の範囲の受容体によって認識される表面に信号をまとめて"efferocytes"と呼びます。これらの受容体の関与は、efferocytosis2,3として知られているプロセスによって efferocyte によって吸収とアポトーシス細胞の劣化を誘導します。ホスファチジルセリンは最高の特徴を食べる-運転 efferocytosis シグナルします。それは通常アポトーシス細胞表面4ホスファチジルセリンを公開するので、この膜非対称を乱す脂質 scramblase をアクティブにすると、血しょう膜の内部のリーフレットに限定されます。ホスファチジルセリンは、成熟マクロファージなどのいくつかの非アポトーシス細胞の細胞表面にあるし、血小板を活性化します。しかし、これらの細胞は、その細胞表面5,6,7CD47 などの「私を食べていない」の信号の存在のために efferocytosed ではありません。露出ホスファチジルセリンは、efferocytes で表される efferocytic 受容体の配列によって認識されます。ホスファチジルセリンにこれらの受容器のバインディング、直接または、オプソニンの援助は efferosome8,と呼ばれる膜結合液胞にアポトーシス細胞の貪食を促進するシグナル伝達経路をアクティブに9,10,11,12.、efferosome は順番にエンドソームと融合し、貨物13,14細胞のリソソームは、分子機械、efferosome を酸性化して、アポトーシスを低下する必要を提供します。リサイクルのエンドソーム アポトーシス細胞由来材料劣化、一度入稿-アポトーシス細胞由来の抗原に対する免疫応答を制限して、可能性がありますによりアポトーシス細胞13から栄養素の回復プロセス 15。Efferocytosis で故障した場合、アポトーシス細胞の障害クリアランスこれらの未確認の細胞は最終的に二次壊死を受けます。壊死細胞は、感染、炎症、自己免疫疾患16,17の範囲を駆動、細胞外の環境に賛成して炎症性のゾル性細胞質の内容、病原体・自己抗原をリリースします。一緒に、アポトーシスと efferocytosis 死んで、死んだ細胞の除去を容易にするため、組織の恒常性の維持を可能にします。

Efferocytosis の基礎となる分子機構を解明、アポトーシス細胞取り込みの明確な数量を提供するメソッドが必要です。他の吸収とは異なりエンドサイトーシスと貪食18,19、efferocytosis などのメカニズムがない結果は断片的な吸収の結果そのままターゲット細胞の貪食で、この数量は複雑します。efferocyte20によるアポトーシス細胞。記載プロトコルの in vitro efferocytosis 試金を記述、内面の正確な描写を提供する個々 のアポトーシス細胞の非内面部分とさまざまな固定セルと組み合わせることができますと生細胞の顕微鏡に近づきます。伝統的な食作用の試金の抗体を追加手法として内在化している非ターゲットをラベル付けするために実験の終わりに貪食のターゲットに固有の共有リンク ビオチン21アポトーシス ターゲットのラベルによって異なります,22. ビオチン化アプローチに分類されるべき任意のタンパク質含有ターゲットを可能にし免疫染色を行った場合、二次抗体の交差反応性の潜在的な問題を回避アポトーシス細胞特異的抗体は、この試金で使用できますが、.具体的には、我々 は、アポトーシス Jurkat 細胞追跡の染料とビオチンの両方でデュアル染色されているの準備を概説します。追跡色素細胞はアポトーシス細胞由来材料 efferocytosis 中に追跡する表面ビオチン化可能の差別に対し efferocytosed アポトーシス細胞の非内面部分から内面のことができます。文化とマウスと人間の efferocytes として使用、M2 マクロファージの J774.2 と THP 1 細胞の efferocytic ターゲットとして一次電池 efferocytosis および Jurkat 細胞の例として準備について述べる。これらのメソッドは、他の細胞や細胞、脂質コーティングを介してアポトーシスをシミュレートするミクロン サイズの模倣し、標的細胞の細胞死 (アポトーシスなど壊死とネクロトーシス) の任意のフォームを受けているに簡単に適用できるか特定の関心の efferocytic 受容体にリガンドでコーティングします。

このプロトコルで説明したメソッドには、フィールド23,24でよく使用される流れ cytometry による方法に比べていくつかの利点があります。両方の合計と内在化している非アポトーシス細胞材料の明確なラベリングと組み合わせる食細胞アポトーシス細胞の相互作用を直接イメージングによる efferocytosis の定量的な対策が可能です。また、pH に依存しない fluorophores の使用は、いくつかの代替方法25を混同するライソゾームの pH で FITC と GFP の蛍光性の抑制などの交絡因子を制限します。最後に、詳細に記述されていませんが、これらのメソッド使用できる蛍光標識遺伝子を表現する efferocytes を使用してまたはポスト固定免疫染色、シグナリング分子の活動との監視の定量化を可能にするのにはefferocytosis 中細胞プロセスは。

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プロトコル

健康なボランティアから血液は健康科学研究倫理委員会のウェスタン オンタリオ大学によって承認されました。人間研究にトライ理事会方針のガイドラインに従って採血を行った。

1. 文化と THP 1 単球細胞株の作製

  1. 37 ° C + 5% CO2T25 フラスコ浮遊培養として文化 THP 1 球。細胞は、ウシ胎児血清 (FBS) ロズウェル パーク記念研究所 1640 (RPMI 1640) + 10 %5 mL で栽培する必要があります。
  2. 優しく、フラスコを振ることによって成長媒体全体に均等に各日の中断細胞は、細胞診断をすぐにカウントします。細胞密度 1 x 106セル/mL に達すると、細胞を継代する必要があります。
    1. あらかじめ暖かい RPMI 1640 + 10% FBS 37 ° C の水浴中。
    2. 5 分間室温で 500 × g で遠心分離によって 1.5 mL 遠心チューブに 15 mL の円錐管 2 x 10 の5セルとペレットのセルを転送します。
    3. 細胞ペレットを乱すことがなく上澄みを除去し、(1.5 mL 容マイクロ チューブ) 1 mL または 5 mL (15 mL コニカル チューブ) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) のペレットを再懸濁します。
    4. 5 分間遠心する常温 500 x g でチューブは、細胞ペレットを乱すことがなく、PBS を削除します。
    5. 新鮮な RPMI 1640 + 10 %1 mL にペレットを再懸濁します FBS。
    6. 新しい T25 フラスコ場所これに温めたメディアの 4 mL に 1.2.5 から再懸濁細胞を追加します。細胞継 (通常 3 日) を必要とするまで、または細胞が実験に必要な 37 ° C + 5% CO2インキュベーターで培養します。
  3. THP-1 マクロファージでの実験用フラスコから通過前に皿に必要な細胞数を削除します。
    1. 12 ウェル プレートのウェルに 18 ミリメートル円形ガラス coverslips (#1.5 厚) の必要な数を配置-条件および/または timepoint あたり通常 1 coverslip。それぞれに分注 5 × 104 THP 1 球をよきます。セルの数は、必要に応じて各井戸を変更ことができますを追加しました。
    2. それぞれの総容積をもたらす RPMI + 10 %1 mL によくセル含む FBS 37 ° C に温めて
    3. 各ウェルに 100 nM ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) を追加し、THP 1 単球のマクロファージ様細胞への分化を誘導するために 3 日間の文化します。

2. 文化と J774.2 マクロファージ細胞株の作製

  1. 37 ° C + 5% CO2T25 フラスコで培養 J774.2 細胞。セルはダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) + 10 %5 mL で育つべきである FBS 文化が 80-90% の confluency に達すれば継代と。通路のセル。
    1. フラスコと 5 mL の PBS で 1 回上昇からすべてのメディアを削除します。
    2. フラスコから PBS を削除し、新鮮な DMEM + 10 %5 mL に置き換える FBS。
    3. 細胞スクレーパーを使用して、メディアのセルを中断するフラスコの底を擦る。積極的に任意のセルの集計を分割するセル数回のピペットします。
    4. セル 1:5 を希釈すると、細胞懸濁液 4 mL をフラスコから取り外して 4 ml の新鮮なメディアの交換します。残りの細胞懸濁液は、破棄、新鮮な T25 フラスコで新しい細胞培養を開始するために使用または実験に使用できます。
  2. J774.2 細胞を用いた efferocytosis の試金のためのセットアップ。
    1. 1 日、実験の開始前に、手順 2.1.1–2.1.3 に従って、新鮮なメディアの 5 mL に J774.2 細胞を中断します。診断を使用してセルをカウントし、5 × 104セル/mL の濃度で細胞に必要な量を準備します。
    2. 12 ウェル プレートのウェルに 18 ミリメートル円形ガラス coverslips (#1.5 厚) の必要な数を配置します。それぞれに 5 × 104セル/mL 細胞懸濁液の分注 1 mL をよきます。
    3. 文化は一晩、coverslip に準拠し、継から回復する細胞を許可します。

3. 主な人間 M2 マクロファージの文化

  1. 必要な M2 マクロファージのすべて 12 ウェル プレートのヘパリンの血中の 10 mL を収集します。
  2. 15 mL 遠心管 5 mL 5 mL に予め温めておいた Lympholyte ポリ細胞分離培地の上に人間の血の層します。処理している場合、複数の管を準備 > 大きいボリュームのチューブを使用してよりもむしろ血の 5 mL。
  3. 媒体の加速と中断することがなく使用して、35 分間 300 × g で遠心分離機します。
  4. プラスチック pipettor と 50 mL の遠心管に転送を使用して上の単核細胞豊富なバンドを慎重に取り外します。3.2 の手順で複数のチューブを作製、バンドが単一の 50 mL チューブにプールできます。チューブのボリュームをもたらす PBS で 50 mL まで。
  5. 8 分間 300 × g で遠心し、上清を削除します。このステップの間に、12 ウェル プレートの各ウェルにオートクレーブ 18 mm 径円形 coverslips (#1.5 厚) を配置します。
  6. 井の数で目的の無血清 RPMI 1640 の 300 μ L で細胞ペレットを再懸濁します例えば、 10 mL の血液が完全 12 ウェル プレートを準備する処理された場合メディアの 3.6 mL の細胞ペレットを中断します。
  7. 各 coverslip を含む 12 ウェル プレートでよくに細胞懸濁液の 300 μ L を追加します。37 ° C + 5% CO2で 1 時間インキュベートします。
  8. 水洗いして coverslip 3 x と任意の非付着性細胞を除去する温めの PBS の 1 mL。



      3. figure-protocol-1



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結果

Jurkat 細胞のアポトーシスに 1 μ M スタウロスポリン結果の文化を一晩 > アネキシン V (図 1) を染色で確認することができます細胞の 95%。スタウロスポリンの濃度とスタウロスポリン処置の持続期間は各セル行の最適化が必要であるが、これらの実験のため他の細胞型を使用できます。信頼性の高い検知及び efferocytosis、定量化の > 細胞の 80% は、efferocytes にそれらを追加する前にアポトーシスをする必要があります。他誘導アポトーシス (例えば熱ショック、エトポシド、紫外線光) も使用できます、しかし、私たちの経験ではこれらはより異種誘導アポトーシスとアポトーシス、二次壊死を含む混合細胞数の結果を生成し、非アポトーシス ターゲット セルです。

インサイド アウト染色固定細胞イメージングのために密接にタンブレロ efferocyt...

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ディスカッション

このプロトコルで説明する方法では、イメージング、固定細胞と生細胞の両方の方法を使用して、動的な efferocytic プロセスの定量化を有効にします。これらのアプローチは、一般的に使用される流れ cytometry 法23,24上のいくつかの利点を提供しています。インサイド アウト染色固定サンプルの使用率のより堅牢で正確な定量化と efferocytosis の範囲を提供しています-確かに、多く流れの cytometry ベースのメソッドは単にアポトーシス細胞とマクロファージ、異なった fluorophores が付いているラベル、内面化されたアポトーシス物質細胞とマクロファージのアポトーシス細胞のマーカーは、こうして区別する能力が欠けて染色の一部としてスコア efferocytosis がバインドされています。PHrodo アポトーシス細胞24のラベルを使用して代替フロー フローサイトメトリーのアプローチがあります。pHrodo は、酸性 pH で明るさが増加する pH...

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開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、健康研究 (機構) 営業許可モップ-123419、自然科学と工学研究会のカナダ発見グラント 418194 とオンタリオ州省の研究、BH に初期研究賞のカナダの協会によって賄われていた。DGW はいくつかの画像を提示、プロトコルの最適化と; 原稿の執筆に貢献してください。彼はリヴァプールの大学からエコカー補助金で賄われていた。CY はヴァニエ大学院奨学金とされて MD/思い立ったによって資金を供給します。資金提供機関は、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備で役割をなかった。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RPMI 1640 メディアWisent3500-000-EL
DMEM メディアWisent319-005-CL
ウシ胎児血清 (FBS)Wisent080-150
PBSWisent311-010-CL
18 mm 円形ガラス カバースリップ #1.5 厚さ電子顕微鏡科学72290-08カバースリップのサイズと形状は重要ではありませんが、18 mmは標準的な12ウェルプレートのウェルに収まり、細胞培養が簡単になります
スタウロスポリンケイマンケミカル81590DMSOに1 mMで溶解します(1,000倍ストック溶液)
ネキシンV-アレクサ488サーモフィッシャーR37174
EZ-Link NHS-ビオチンサーモフィッシャー20217デシケーターで保管します。原液は調製しないでください。
DMSOSigma-AldrichD2650
CellTrace FarRedThermoFisherC34572
CellTrace OrangeThermoFisherC34851
Hoescht 33342ThermoFisher62249
FITC-StreptavadinThermoFisherSA1001
Lympholyte-poly cell sepration mediumCedarlane LabsCL5071
組換えヒト M-CSFPeprotech200-04
組換えヒト IL-4Peprotech300-25
J774.2 マクロファージ細胞株Sigma-Aldrich85011428-1VL
THP-1 ヒト単球細胞株ATCCTIB-202
Jurkat T細胞株ATCCTIB-152
ア

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