このプロトコルの目標より大きな規模での NMDA 受容器 (NMDAR) の研究と、低分子化合物の変調作用の検討と治療への応用です。
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この記事について
サマリー
要約
N メチル D アスパラギン酸 (NMDA) 受容体 (NMDAR) はグルタミン酸に分類され、学習と記憶に重要な役割を持っています。表現としてどちらかに- または下-activity の突然変異、発現、人身売買、またはローカリゼーションによる NMDAR の故障は、中枢神経系を中心に、多数の病気に貢献できます。したがって、化合物と低分子化合物の探索を促進することと同様、受容体の生物学を理解することは、神経疾患と闘うための継続的な努力で重要です。現在の受容体の勉強方法低スループット、高コスト NMDAR 仲介された毒性を防ぐためにチャネル遮断薬の必要な存在のためにその機能能力を研究することができないなどの制限があります。また、既存のアッセイ系のみグルタミン酸による刺激に敏感である、グリシン、NMDAR の他の共同のリガンドによる刺激に対する感受性を欠いています。両方共配位子、グルタミン酸や D セリン ・ グリシンへの感受性と NMDA 受容体を研究する高スループット力と最初のプレート ベースのアッセイを紹介します。このアプローチ様々 な NMDAR サブユニット組成の研究でき、受容体の機能解析グリシンやグルタミン酸に敏感なモードで。また、メソッドでは、測定中の阻害剤の存在は必要がないです。正と負のアロステリック変調器の効果は、このアッセイで検出できるし、NMDAR の既知の薬理学は、私たちのシステムにレプリケートされています。この手法は既存の方法の限界を克服、経済的であります。この手法は NMDAR を介した病態の治療の発見を加速すると考えています。
概要
医学の現在の進歩、平均寿命が大幅に増加します。しかし、加齢に伴う疾患の有病率がのであります。中枢神経系 (CNS)、他の中で、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) 統合失調症などの疾患は例外ではありません、次の十年1,で増加する予測されています。2,3N メチル D アスパラギン酸塩の受容器 (NMDAR) として知られているイオン型グルタミン酸受容体の機能不全は、アルツハイマー病、統合失調症、外傷性脳損傷、脳卒中、糖尿病、緑内障等保証のにリンクされている、。効果的な疾患修飾療法4,5,6、7の開発のための生物を勉強する必要があります。
NMDARs は、4 つのモノマーまたはサブユニット4,8,9で構成されます。NMDAR ....
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プロトコル
1. 細胞の調製
注: このプロトコルは、データの生成を含むエンコーディング NR1 と NR2A 細胞バキュロ ウイルスで導入した HEK293 細胞を使用します。
- HEK293 細胞の適切な数をシードし、適切な最終濃度 (各 1.00 μ L) で NR1 および NR2A のウイルスを追加します。384 ウェル プレート 10,000 30 μ L の最終巻で細胞/ウェルを使用します。
- また、適切な細胞数と (384 ウェル プレート使用 10,000 細胞/ウェル 30 μ L の最終巻で) のためのボリュームで HEK293 NR1 NR2A 細胞をシードします。NR2A 式を誘導する化合物の保護を追加する 2 μ G/ml の濃度でテトラサイクリンを追加 (100 μ M MDL105、519 または 5 μ M CGP07066724)。
- 注: エンコード NR1 と NR2 バキュロ ウイルス 5 x 109 - 10 x 109感染単位ミリリットル24間概算価が必要です。
2. NMDA 受容体活性の測定
- いずれかの保護化合物存在下での NR1/NR2 HEK293 NR1 ....
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結果
小分子の効果をテストする前に、1 つは NMDARs として最適なリガンド濃度の最適な発現レベルを定めなければなりません。前述、HEK293 細胞/ウェルの 384 ウェル プレートで 10,000 細胞播種 5 μ M の存在下で CGP060667、その後導入 NR1 と NR2A の変化量とウイルス。孵化翌日、リガンド誘導性カルシウム後フラックスを測定した (図 1)。これらの実験の結果では、最高の量とそれぞれのサブユニット (図 1、黄色のボックス) を使用するウイルスの比を明らかにします。
最適量および NR2A の NR1 と伝達の比率が決定されると、配位子の滴定を行った NMDARs の活性化のための最適なリガンド濃度を決定します。これを達成するために共同配位子の 1 つ追加されましたでさまざまな濃度の固定、その他の共同.......
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ディスカッション
この試金の成功は、使用される HEK 細胞の状態によって大きく異なります。細胞の急激な増加を受けて、低通過数を使用する必要があります。このアッセイ多く転送と警告を使用して、ソリューションの追加はその結果で高い精度を確保します。化合物およびその他のすべての試薬の濃度は、エラーを最小限に抑えるためにクロス チェックもする必要があります。アッセイバッファー カルシウム フラックスの試金のための携帯メディアを交換する際、セルを切断しないでください、プレートが優しく傾斜する必要があります。最後に、このプロトコルではポリ-D-リジン コーティング プレートの使用セルのプレートに添付ファイルが増加します。
NMDAR の表現の違い、ウイルスの伝達の時に通路番号と HEK293 細胞の適性に応じてサブユニット式に必要な量の可能性があります。また、バキュロは 6 ヶ月から 1 年まで短い貯蔵寿命を持ちます。したがって、ウイルスの品質は、この試金のための重要なパラメーターです。標準蛍光抗体法は、検出および表現のレベルとさらに実験24前に NMDAR のユ.......
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開示事項
著者があるない利益相反とは何を開示します。
謝辞
著者は、郵便局バカロレア学者プログラムそしてノバルティス バイオメディカル研究本研究を資金調達のための全体として感謝したいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| ヒトNMDA(NR1/NR2A)受容体細胞株 | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecularデバイス | R8192 | |
| グリシン | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| グルタミン酸 | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-セリン | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES バッファー | ボストン バイオ プロダクト | BB-103 | |
| 塩化マグネシウム溶液 | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| 塩化カルシウム | VWR | E506 | |
| HBSS | サーモフィッシャー・サイエンティフィ | 14025-092 | |
| プロベネシド・ | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX 培地 | サーモフィッシャー・サイエンティフィ | ・サイ | |
| MDL105,519 | NIBR | 社内合成 | |
| NVP-AAM077 | NIBR | CGP070667 | |
| NIBR | ハウス |
参考文献
- Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
- Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T.
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再版と許可
