ラット腎臓からそのまま糸球体を分離する効率的なふるい分け法

糸球体は毛細血管の血漿の循環ろ過を担当の専門性の高い房です。それは、腎臓の基本的な機能単位であるネフロンの初めを形作る。一意に有窓血管内皮、足、スリット横隔膜介在の基底膜、糸球体の機能が定義されます。これらのレイヤーは、濾液に物質の選択的排泄を許可する半透バリアを形成します。他の小さな分子やイオン、水一般に通過、プラズマでより大きい分子は保持しながら。足が特殊な上皮細胞基底膜に広がって足プロセスとして知られている細胞質突起を有する毛細血管を囲みます。足はされ隣接する足を処理し、ネフリン、podocin、P 型カドヘリン、ZO 1¹などのタンパク質から成るスリット ダイヤフラムで交差しています。断面図でこれらの足が均等に配置プロセス基底膜上。病気にかかった糸球体足プロセスなる肉眼的異常または「消去」濾液にプラズマの内容の異常な漏れに 。など、糸球体障害は一般的にタンパク質 (蛋白尿など) および/または尿中の赤血球 (血尿など) の異常に大きな量の存在によって特徴付けられます。さらに、負傷した足は、そのレギュレータ ウィルムス腫瘍 1 (WT1) 分化^2,3の保守を担当するタンパク質と同様、ネフリンの発現を失います。糸球体は、糖尿病性腎症における損傷の主なターゲットと微小変化群、膜性腎症、巣状分節性など他の glomerulonephritides です。これらの病気は、進行性の腎不全末期腎疾患の開発、透析または腎移植に依存して生存の条件の主要な原因です。したがって、慢性腎臓病 (CKD) の病理を理解する糸球体を研究することが重要です。

細胞培養系は糸球体生物学を勉強するため重要です。スリット ダイヤフラム蛋白質の突然変異のため特定の漏出症の存在と同様、スリット絞りを生成する際に中心的な役割のために多くの研究は当然のことながら単独でポドサイトを利用します。これは体外で利用するプライマリ ポドサイト細胞ラインの生成をもたらした。これらの細胞はさまざまな条件下で培養することができも透磁率⁴を評価するために透過性のサポートに育てることができます。しかし、しばしば増殖細胞の単離は、そのポドサイト マーカーのいくつかを失っている脱分化型のセルを選択します。これは、SV40 大きい T 遺伝子 (例えばimmortomouse)、文化で育つことができるがまたの温度感受性変異を運ぶトランスジェニック マウスの系統から派生した条件付き不滅にされた足の世代につながっています。ポドサイト マーカー⁵の完全な配列を表現する区別されます。初代培養のこれらの方法は、理解ポドサイト生物学^4,6,7で極めて重要なされています。

それにもかかわらず、1 つのセル型を含む文化不足発生する体内の接続と同様の支援体制やマトリックス、細胞間の関係とこれらの細胞の膜は必ずしも立体化ではない要約糸球体のアーキテクチャです。面倒で文化⁸、どちらかの immortomouse の所有を必要とする挑戦的な不死の足することができますかからの細胞の開始因数確立捜査を開始します。さらに、糸球体だけでなく足が、また毛細血管内皮細胞、基底膜とメサンギウム細胞構造のためのサポートを提供する構成されます。したがって、アプローチを開発する前のヴィヴォ利用通常糸球体を構成するすべての細胞と同様、彼らのネイティブ アーキテクチャを保持するそのままの糸球体の調査のためすべての捜査に有用です。

1958 年、クックとピカリングはウサギ腎糸球体の最初の分離を説明します。脂肪塞栓糸球体の提出になったことの観察の後彼らは、同じ大きさの粒子を使用してこれらの構造を具体的に特定できると仮定しました。確かに、腎臓の糸球体にこれらの粒子の捕捉につながったに酸化鉄粒子の注入。そのまま、純度の磁気分離⁹を使用して、機械的解離と腎臓のふるい分け後、糸球体は隔離されかねない。輸液は省略できます、酸化鉄とみじん切りにした人間、犬、ウサギやラットの腎臓組織¹⁰のふるい分けを実現される糸球体分離 1971 年、ミスラはことを示した。この手法は以降、調査官の目標に応じて変更されているが本質的に純化をさらに検討する可能性がまたは一次電池文化が確立された^11,12をすることになりました^{,13,14,15,16,17}。

ここで我々 はラット腎臓からそのまま実行可能な球体の隔離のためのプロトコルについて説明します。全体のプロトコルは、ほんの数時間をかかります。しか増殖しない、単に開始材料として腎臓の数を増やすことによって任意のサイズの実験計画をサポートできます。糸球体の磁気ビードの分離の公開プロトコル、ビーズの静脈注射を必要とするより高価し、ビーズ文化における腎糸球体によって保持されますいずれかまたは糸球体を必要とするので生物学を変更可能性があります」溶解"と遠心分離¹⁹による除去。マウスの糸球体に比べると、ラット糸球体 (生後 2 ヶ月のラット¹⁸ほぼ 100 μ m) の大型やすくシンプルなふるい分け法を用いた他の腎臓の構造とは異なる。

その有用性の証拠として、異なった細胞のタイプを示す糸球体を特徴付けた。生体内で糸球体を傷つけないように知られているエージェントを公開することも、これらの文化にプロタミン硫酸塩 (PS) の悪影響を示します。糸球体毛細血管壁²⁰に沿って陰性荷電部位を中和するポリカチオン PS です。この中和糸球体濾過障壁は劇的な効果があり蛋白尿と足のプロセス卑下になります。これらの球体は、ネフリンと全体的な健康を評価するために WT1 など主要蛋白質のための immunoblots を評価できます。さらに、その構造は、光、蛍光抗体法、電顕と評価できます。

全体的に、このプロトコルはほとんど捜査官 (1 つだけ動物といくつかの単純な機器へのアクセスが必要) にアクセスできます。左損傷形態学的特徴、研究者は糸球体を分析し、どのように他の重要な細胞の種類を参照してくださいすることが、糸球体に行列保存機能と疾患の進行、ポドサイト文化の欠点に影響を与えます。

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ピッツバーグ大学のによって承認されています。

1. ラット糸球体の分離

1. 滅菌 1% 分離バッファーを準備するには、600 mL のビーカーにウシ血清アルブミン (BSA) の 5 g を追加します。
   1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 500 mL をビーカーに追加、すべての BSA は解散まで磁気攪拌棒でかき混ぜます。
   2. 滅菌フィルター携帯文化フードで 1 %bsa/PBS バッファー。
      注: 滅菌 1 %bsa/PBS バッファーは、4 ° c で最大 1 週間保存できます。
2. 150 に 200 g の重量を量る 2 に 4 Sprague-dawley ラットを取得します。
   1. 1 分あたり試験室の容積の 10-30% の割合で 100% の二酸化炭素は導入されたチャンバーを用いた炭酸ガス吸入を介してラットを安楽死させます。呼吸の停止のための動物を観察し、二酸化炭素から除去する前に目の色が色あせた。
   2. 70% エタノールで前方の腹部の上に皮膚を準備し、必要な場合に、髪を削除するバリカンを利用します。外科はさみやメスを用いて皮膚で正中切開を行います。内臓を公開する筋層を介して別の正中切開を行います。安楽死の副次的な方法として横隔膜と胸骨や肋骨を上方に切開を拡張します。
   3. 分離し両方の腎臓を摘出し、ハンクス バッファー塩溶液 (HBSS) 氷の上の 30 mL と 50 mL の滅菌プラスチック円錐管に配置します。
      注: いくつかのラットは同じ部屋で安楽死できるし、同じ円錐管に腎臓のすべてを配置できます。
3. 無菌細胞文化フードに氷とトランスポートの腎臓を維持します。氷の上も HBSS、5 mL を含む滅菌シャーレに腎臓を転送し削除しハサミで腎周囲脂肪を破棄し、鉗子を鋭い。まだ存在する場合削除も、小さな表面的な切開することによって、腎臓を取り巻くカプセルを破棄し、シャープな鉗子を使用して優しく器官から引き抜きます。
   注: は常に全体氷と実践の無菌に腎臓分離を離さない。滅菌ガーゼのワンピースは、操作中に場所で腎臓を保持する織り目加工の表面としてペトリ皿に配置できます。
   1. 腎臓を半分に切って縦 (正中矢状セクション) を削除し、破棄 HBSS 5 mL で 2 番目のペトリ皿のメスと髄質 (暗い色である)。
   2. サード HBSS 5 mL をシャーレに腎皮質は主に、残りの部分を転送し、部分が 1 mm 未満のサイズになるまで、またはペーストを形成するまで滅菌かみそりの刃でミンチします。
4. 1% の 180 μ m ふるいの上下をウェット廃棄物 500 mL ビーカーに BSA/PBS。この手順は重要なタンパク質のふるいのコートし、収量を改善する糸球体の付着を軽減です。
5. ふるいの小さい端にみじん切りにした皮質を配置し、氷の上に座って鍋底にふるいを通して組織をドロドロに 10 mL の注射器の質感プランジャー フランジ (ゴム製シールの反対側) を使用します。HBSS で定期的に洗い、サンプル希釈を避けるために可能な限り少し使用します。
   注: よりここでは使用することができます 25 mL のみバッファー数 30 mL を超えないようにします。ふるいの 1 つだけ端にみじん切りにした組織を置くための理由は、全体のふるいの表面積ではなく、ふるいの一部への露出を制限することで糸球体の付着を減らすことです。
   1. そのためには、ふるいを洗うとき下のパンに収集流体を再利用します。ふるい分けが完了する、慎重に緩く付着が糸球体をキャプチャする鍋の底から 1 %bsa/PBS バッファーをもう一度ふるいの下を洗います。
   2. 20 G 針装備いくつかの 10 mL の注射器に下のパンに流体のすべてを収集し、少なくとも 2 追加回針を通してそれを渡します。最後のコレクション 90 μ m ふるいを通過する準備ができるまで注射器で糸球体を含んでいる液を維持します。
6. 流体は、注射器で格納されている、1 %bsa/PBS 廃棄物ビーカーにウェット トップと 1% の 90 μ m ふるいの下にフラッシュして鍋底を洗う BSA/PBS。氷の下のパンの上にふるいを置きます。
   1. 上記の説明と別の注射器フランジのふるいを通してふるいとドロドロの 1 つの端に注射器のサンプルを適用されます。ふるいの 1 つの端にすべてを収集するために鍋底からソリューションで洗ってください。
   2. 慎重にステップ 1.5.1 のようにふるいの下を洗い、一度ふるいが完了します。50 mL のプラスチックの円錐管の下のパンにすべての流体を収集します。
7. 1 %bsa/PBS 廃棄物ビーカーとウェット上部に上下 1% の 75 μ m ふるいの鍋底を洗う BSA/PBS。氷の下のパンの上にふるいを置きます。
   1. サンプルを篩の 1 つの端に適用されます。液体を簡単に通過する必要があります。少なくとも 20 mL の 1% でトップをすすぎ廃棄物ビーカーに BSA/PBS。同様にふるいの下に慎重に洗います。糸球体は、この 75 μ m のふるいの上に残ります。
   2. HBSS を使用して、逆さまのふるいを通して洗浄によってペトリ皿で糸球体を収集します。必要に応じてできるだけ多く HBSS をここで使用します。1 つ以上 50 mL プラスチック円錐形の尿管に氷の上を収集します。
8. 4 ° C で 5 分間 1800 × g で遠心分離、ピペットと慎重に上清を除去、冷たい HBSS の 10 mL にペレットを再懸濁します。複数の円錐管は 1.7.2 で収集された場合は、サンプルを組み合わせます。遠心分離のステップを繰り返します。
9. 次のステップに進む準備ができるまでを 5 mL HBSS の糸球体を再懸濁します。
10. 必要な場合は、総腎糸球体のカウントを取る。このため、ピペットで 10 μ L のサンプルを取る、スライド ガラスにドロップ。顕微鏡下で表示、カウント フィールドにおける腎糸球体および総収率を取得する 500 を掛けます。
    注: フィールドに見られる尿細管の数をカウントすることによって決定される純度、糸球体と尿細管の合計数で除算して構造。視覚的なフィールドに > 95% の糸球体があります。
    1. 重要な管状の汚染がある場合手順 1.6.1 以降を繰り返し、1.7.1 とき手順を完了を徹底的に洗浄することを確認します。これは、ステップ管状の汚染が最も発生しやすい。

2. 糸球体の損傷

1. ウェルあたり約 9,000 糸球体があるので合計収量に基づく HBSS の適切な量で再懸濁します 200 x g にダウン 15 mL プラスチック円錐管とスピンの球体を収集します。24 ウェル プレートの各ウェルに 450 μ L のサンプルをピペットまたは下流の試金に合った版のフォーマットが必要な。
   注: バッファーにおける腎糸球体をミックスする上下ピペッティング均一溶液を保証します。糸球体が非常に粘着性がある、重いと、お互いに固執し同様迅速かつチューブの側面にソリューションの下部に解決。
2. 6 mg/mL のプロタミン硫酸塩 (PS) ソリューションをするためには、まず PS dH2O 徹底的に 15 mL プラスチック円錐管と渦で 40 ° C に加熱の 10 mL に 1 g を溶解します。ソリューションの 30 μ L を取るし、dH2O の 470 μ L を加えます。
   注: これは 6 mg/mL の溶液を生成、井戸の中に 50 μ L を追加すると下記のとおり、最終濃度が 0.6 mg/mL。
   1. 、重複してプロタミン硫酸 50 μ L を追加 (これは、1:10 希釈) HBSS (マイナス コントロール) の別のグループ 50 μ L を供給しながら、1 つのグループのそれぞれの井戸。
3. 37 ° C で 4 時間プレートを孵化させなさい
4. スピン ・ ダウン遠心チューブ (4000 x g、4 ° C、10-15 秒) で各ウェルの内容と PBS 各 1 mL で 2 回洗浄します。
5. 最終的な洗浄を離れて吸い出しなさいし、300 μ L の PBS に再懸濁します。蛋白質の隔離、透過型電子顕微鏡 (TEM) の可視化、および蛍光抗体法 (IF) を汚すために準備する 3 つの因数に分割します。

3. 解析の糸球体を準備

1. スピン ・ ダウン 3 つの因数 (4000 g、4 ° C、10-15 秒 x) とバッファーの残りのオフ吸引の内容と TEM によるサンプル分析に進む場合、または蛋白質の隔離。
2. 透過電子顕微鏡用処理
   1. 0.01 M PBS で冷たい 2.5% グルタルアルデヒドの 150 μ L の糸球体のペレットを修正します。ペレット、ペレットを破壊することを確かめて、パスツール ピペットを使用して、PBS で洗浄から、定着剤を慎重に削除し、フェリシアン化カリウム 1% で 1% オスミウム四酸化の修正後。
   2. エタノールの傾斜シリーズを通して試料を脱水 (30、50、70、90、100、100、100%)、酸化プロピレン、エポキシ材を埋め込むことに埋め込みます。
   3. 厚切カット (300 nm)、ウルトラミクロトームにセクション。0.5% 1% ホウ酸ナトリウムのトルイジン ブルー染色および光学顕微鏡の下でそれらを調べる。
   4. 超薄切片をカット (65 nm)、酢酸ウランとレイノルドの鉛のクエン酸、それらを染色、電子顕微鏡で調べる。
3. 場合の処理
   1. PBS 溶液 12% のゼラチンの 150 μ L を追加、すぐにドライアイス ペレットを形成します。ペレットに漬 500 μ L 2% パラホルムアルデヒド/1 の 4 ° C で一晩微量遠心チューブに PBS x
   2. 基本型のペレットを置き、ドライアイスの上最適な切削温度 (OCT) 媒体を追加することによって埋め込みます。Cryotome に 5-10 μ m のセクションをカットし、蛍光抗体/免疫組織化学または標準組織学的汚れを続行します。
4. 蛋白質の隔離の
   1. プロテアーゼ阻害剤の 1.5 μ L で遠心糸球体ペレットと組織のホモジナイザーと dounce に RIPA バッファーの 150 μ L を追加します。
   2. プロテインの定量とイムノブロットや他のタンパク質の分析に進みます。

糸球体の分離に安楽死の時間からプロトコルで 2 時間ほどで完了することができます、高スループットと効率性。8 腎臓から始まるとき技術の適切な利用にあたりラット腎糸球体の収量は 6,000-10,000 腎糸球体から範囲します。最終的な懸濁液糸球体は密集で、全体的な純度 > 95%、管状のセグメントまたは他の細胞型 (図 1A, B) から最小の汚染を示します。さらに、10 月に埋め込まれた球体は形態 (図 1C) を参照してくださいにヘマトキシリンとエオシン (H & E) 汚れと汚されることがことができます。これらの球体は、処理後も全体のプロトコルを通してそれらの構造を維持します。孤立した糸球体がそのままで、実行可能な足 (図 2A)、メサンギウム細胞 (図 2B) と血管内皮細胞 (図 2C) を有していることを示す.

一度分離、糸球体が生体内で病理学をシミュレートするためによく知られている化学傷害に公開できます。この場合、プロタミン硫酸塩 (PS) は、最終的にプロセスの卑下を足につながる糸球体濾過障壁の電荷を混乱させる能力に選ばれました。PS 処理糸球体ネフリン (赤) の顕著な削減と核 WT1 (緑)経由で蛍光抗体法 (図 3A, B) の正の数があります。糸球体は、透過電子顕微鏡 (図 3C) 用も用意できます。コントロールのサンプル通常ポドサイト形態と PS を投与した糸球体がポドサイト障害のサインであり PS21を使用して体内のモデルに見られる足プロセス卑下 (図 3D) プロセスの足。これはネフリン (図 3E, F) のイムノブロットによる検出の減少にも対応しました。

生存率を決定するには、切断カスパーゼ 3 がアポトーシス マーカーとして評価されました。切断カスパーゼ 3 は蛍光抗体法を使用して、最初分離 (図 4) 後 2 h を開始いくつかのセルに表示されます。このプロテアーゼを発現する細胞数になった 24、48 h で最高水準と時間をかけてより豊かです。そのアポトーシスは文化の早い段階で比較的発生が示唆された最良の結果のための分離後すぐに下流のアプリケーションを実行することとします。

図 1.分離後のラット糸球体文化の典型的な外観。(A) 糸球体文化の明視野イメージ。我々 は、この顕微鏡写真 (矢印) で単一腎尿細管がフィールドを選んだが得られた文化は、一般的に純度 > 95% です。スケール バーは、100 μ m (B) 拡大画像の単一の糸球体を等しくなります。単一の糸球体の (C) ヘマトキシリンとエオシン染色。B および C のスケール バーは等しく 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2.孤立した糸球体における構成細胞の種類が保持されます。ネフリン (赤、足) と足細胞、メサンギウム細胞、内皮細胞特異マーカーの共焦点蛍光顕微鏡観察を行った。ネフリンと WT1 のため (A) Costain (緑、足)。(B) Costain ネフリンの試験-β (グリーン、メサンギウム細胞、矢印)。ネフリンの CD31 (C) Costain (緑、血管内皮細胞、血管断面矢印マーク)。スケール バーのすべてのパネルに 25 μ m を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3.ポドサイト傷害誘導培養ラット糸球体を使用することができます。(A) 共焦点蛍光顕微鏡ネフリンと WT1 の未処理の糸球体文化。染色 (赤) 線形ネフリンと一般的に健康的な足に見られる WT1 陽性核 (緑) の存在に注意してください。(B) 後、プロタミン硫酸塩治療、ネフリンの発現は減少し、非線型の WT1 はありません、ポドサイト障害を示します。(C) 伝送電子 microscpy (TEM) 映像足プロセス、基底膜と有窓血管内皮細胞の正常な糸球体構造の典型的です。Equals 500 nm バー。(D) プロタミン硫酸塩後足プロセスが細長いまたは (矢印) を減じ、ポドサイト障害を示します。ネフリンを示すため (E) 西部のしみは、プロタミン硫酸塩治療後ネフリンを減少しました。西部のしみの負荷制御 (F) アクチンが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4.孤立した糸球体の細胞生存率の評価します。共焦点蛍光顕微鏡を用いた切断カスパーゼ 3 (緑) を行った。ネフリン共同染色は、糸球体を容易に見つけるため行われました。糸球体の分離後 0 と 1 h で切断カスパーゼ 3 陽性でしたがない、いくつかの細胞の蛍光信号を認めた 2 h で徐々 により多くの細胞になって肯定的な長い分離した後.カスパーゼ 3 陽性細胞数の最大が 24、48 h で認められたこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

著者が明らかに何もありません。