ひと低密度好中球 (LDN) 術後の腹腔洗浄液から回収が大規模な好中球細胞外トラップ (網) を生成し、その後成長無料腫瘍細胞を効率的にトラップの方法を紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
好中球リリース好中球細胞外トラップ (網) を取り込んで微生物を破壊することができますをアクティブ化します。最近の研究では、ネットがさまざまな病気プロセス、自己免疫疾患、血栓症、腫瘍の転移などに関与していることを示唆しています。ここで、網に付着後成長無料腫瘍細胞の捕捉中にネット活動を検出する詳細な培養技術を紹介します。第 1 に、開腹症例から術後腹腔洗浄液から低密度好中球 (LDN) を集めました。LDN の短期養殖緑蛍光核と染色体の対比染色に視覚化された大規模なネット形成で起因しました。ひと胃癌細胞株ネットと NUGC 4、OCUM 1、MKN45 の共同培養後多くの腫瘍細胞は網によって閉じ込められました。その後、添付ファイルは、DNase I. 低速度撮影ビデオは網によって閉じ込められている腫瘍細胞が死んでいなかったこと明らかに取り付けた網の劣化によって完全に廃止されたが、代わりに連続培養における旺盛します。これらのメソッドは、ネットとセルと材料の様々 なタイプの接着剤の相互作用の検出に適用可能性があります。
概要
循環血液における多形核好中球は通常単核細胞から密度グラデーション製法によって区切られます。ただし、CD11b(+)、CD15(+)、CD16(+)、および CD14(-) の表現型を持つ低密度好中球 (LDN) として知られているいくつかの好中球、単核細胞と共同浄化されました。LDN の相対数は、大幅自己免疫疾患1、2敗血症3がん4,5など様々 な病態で増加します。以前の研究では、LDN が好中球6の表現型と機能別のクラスであることを示しています。循環血液で LDN は通常の密度好中球2,7より好中球細胞外トラップ (網) を生成する可能性が高いことに注意してください。ネットは核酸、ヒストンやプロテアーゼ、粉粒体、ゾル性細胞質蛋白質から成る web のような構造であり、彼らは効率的にわなに掛けることができる病原体8を破壊して。
最近では、ネットをキャプチャだけでなく、微生物も血小板、血栓....
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プロトコル
LDN は本研究で登録された患者から得られたし、制度的レビュー ボードの自治医科大学によって承認されました。
1. 腹腔内洗浄と純の検出から LDN の分離
- サンプルの収集
- 消化管の悪性腫瘍による腹部手術を受けた患者の創傷閉鎖する前に腹腔内に直接通常の滅菌生理食塩水 1000 mL を吹き込みます。
注: サンプルは、年齢や性別に基づくバイアスのない胃切除術、結腸切除術、または食道切除術を受けた患者から得られました。生理食塩水は、コンテナーに転送され、注がれる腹部全体 1 分以内。これは日常的に患者に重大な影響なし術後腹腔洗浄として実行されます。 - 少なくとも 1 分間広く腹腔洗浄液。
注: サンプルが均一なので、外科医の手でゆっくりと、注入液攪拌はそれをお勧めします。 - 4 50 mL 注射器洗浄液 200 mL を回復します。
注: 時々 ゴム コネクタが流体を取るされます。
- 消化管の悪性腫瘍による腹部手術を受けた患者の創傷閉鎖する前に腹腔内に直接通常の滅菌生理食塩水 1000 mL を吹き込みます。
- 顆粒球特定 mAb、CD66b16を使用して腹膜の LDN の浄化を実行します。
注: 密度勾配遠心後の中間層には、多くの単核細胞が含まれています、CD66b モノクローナル抗体を用いた多形体好中球の正の選択を行った。- 腹腔洗浄液を 50 mL のチューブに転送します。
注: この手順で....
- 腹腔洗浄液を 50 mL のチューブに転送します。
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結果
2 時間の文化で腹膜灌流液の示した文字列の構造から派生した CD66b(+) LDN の緑色蛍光色素で染色核と染色体 (図 1 b) CD66b(-) 単核細胞がいない中 (図 1)。ただし、前処理は LDN 文化 100 U/mL DNase 私は、特徴的な構造は破壊 (図 1)、彼らが好中球から追放された細胞外 DNA で構成されていたことを示します。LDN はコーティングに浮かぶ多くの NET クラスターなしプラスチック プレートで培養したとき (図 1E) の下にいくつかネット メディアは観察されました。
次に、ネットに腫瘍細胞の接着性を調べる MKN45 セルの赤色蛍光色素で標識された網に追加し、5 分イン.......
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ディスカッション
以前の研究は、10、生体内で純基板11循環腫瘍細胞をトラップできることを報告しています。転移性乳癌細胞は、好中球を刺激しターゲット器官17の腫瘍細胞の成長を支援するネットの形成を誘導する示されています。さらに、術後の洗浄液から LDN の短期的な文化が効率的にさらに刺激15せず腫瘍細胞をわなに掛けることができる大規模な網を生産がわかった。これらの観察は、転移のプロセスでネットの機械的介入のための可能な役割をお勧めします。ただし、ネットと腫瘍細胞の接着剤の相互作用を仲介する詳細な分子メカニズムはまだ明らかではありません。最近の研究は、接着基板12,13として活性化好中球から分離されたネットの在庫を使用してこのプロセスでインテグリンの関与関与しています。ただし、精製と濃縮のネット コンポーネントは.......
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開示事項
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
謝辞
技術と事務作業、さん j. 篠原と I. Nieda に感謝します。また、松本史朗夫妻、秀典春田、倉科健太郎、高橋一也は、手術室でのサンプルの収集への協力を感謝いたします。この仕事は、学術振興 (17 K 10606) 教育省、科学、スポーツ、日本文化と日本社会科学研究費補助金によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | GEヘルスケア、スウェーデン | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™全血CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、ドイツ | 130-104-913 | |
| fc block | Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、ドイツ | 130-059-901 | |
| MACS リンス溶液 | Miltenyi Biotec、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ | 130-091-222 | |
| MACS BSA ストック ソリューション | Miltenyi Biotec、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO,米国 | P9691 | |
| 希釈剤C | シグマ-アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州、米国 | CGLDIL | |
| ミディアム | シグマ-アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州 | 、米国R8758 | |
| ダルベッコ's モディファイド イーグル ミディアム ハイ グルコース (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco' | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA溶液(pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyofriized powder, ≥96% (アガロースゲル電気泳動) | Sigma-Aldrich, StLouis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | 岩城, 日本 | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | 岩城市 | 4820-040 | |
| フルオレセイン実体顕微鏡 | BX8000, キーエンス, 大阪市 | BZ-X710 | |
| 全景細胞観察システム | ニコン, 神奈川県, 日本 | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 ヒト胃がん細胞株 | 理化学研究所, 筑波大学 | N/A | |
| NUGC-4 ヒト胃がん細胞株 | 理化学研究所, 筑波大学 | N/A | |
| OCUM-1 ヒト胃がん細胞株 | 大阪市立大学, 日本 | N/A | Gift from Dr. Yashiro |
参考文献
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al.
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再版と許可
