炎症性腸疾患における癒着防止治療の機能分析のための動的接着アッセイ

サマリー

血管壁への免疫細胞の動的付着腸内ホーミングの前提条件です。アドレスを持つコーティング毛細血管を用いた細胞の動的な細胞接着機能の in vitroアッセイ抗インテグリン抗体、ケモカインやその他の要因の影響分析のためのプロトコルを紹介します。

要約

腸の免疫細胞のホーミングは、炎症性腸疾患 (IBD) の病因のために重要です。Addressins インテグリン依存性細胞接着はこのプロセスの重要なステップと接着を妨げる治療戦略が確立されました。Vedolizumab、反 α4β7 インテグリン抗体はクローン病 (CD) の臨床治療に使用されて、潰瘍性大腸炎 (UC) やさらに化合物に従う可能性があります。

接着手順の詳細と抗インテグリン抗体の作用機構はこの分野の機能研究の限られた利用可能な技術のための多くの点でまだ不明。

IBD のコンテキストのフロー条件の下でひと細胞接着の機能解析と抗インテグリン療法の影響の動的接着アッセイを紹介します。それはリアルタイムの微視的解析とのアドレスを持つ極薄ガラス毛細血管を通じてひと初代細胞の灌流に基づいています。アッセイは、さまざまな改良と変更のための機会を提供しています、機構の発見と医療応用のためのポテンシャルを保持します。

概要

細胞運動は堅く調整されたプロセスの開発と多細胞生物の機能に不可欠なのですが、疾患¹の多数の発症にも関与しています。最近では、末梢の組織に血流から免疫細胞のホーミング過程注目を集めて増加、以来、補給と免疫学的疾患^{2 の炎症組織における病原性細胞の拡大に貢献 ,3}。特に、ホーミングは、炎症性腸疾患 (IBD) の並進運動の関連性を持っている示されています。腸ホーミング干渉治療抗 α4β7 インテグリン抗体 vedolizumab 大規模臨床試験^4,5で効力を示したし、リアルな実習^6,7で正常に使用されています^,8します。 それ以上の化合物が^9,10をたどる可能性が高い。同様に、示す間、natalizumab、治療抗 α4 インテグリン抗体は多発性硬化症 (MS)¹¹の治療に使用されます。

しかし、一般的にホーミング過程の機能理解とそのような抗体医薬の作用機序特にはまだ限られています。それ、定着してホーミングは携帯のテザリングとトランス内皮移行^12,13続いて事務所の逮捕に至るその後の細胞接着とローリングなどを含むいくつかの手順で構成されています。上記の抗体は、血管壁の内皮細胞上の addressins との相互作用を防止する細胞表面のインテグリンを中和します。これはしっかりした細胞接着^14,15を妨げると考えられます。まだ、我々 はのみ特定インテグリンの細胞のサブセットの細胞のホーミングの差分の関連性を理解し始めています。また、別に及ぼす抗インテグリン抗体細胞サブセット、用量反応の関連付けが IBD の腸ホーミングと癒着防止療法の分野でオープンな質問の多くにつながる主に知られています。

したがって、このような質問に対処するための便利なツールは必死に必要とします。インテグリン アドレスを持つ相互作用に及ぼす抗インテグリン抗体が結合効果/結合阻害フローサイトメトリーまたは静的接着アッセイ^{16,17 までを評価することによって主に評価されたところ、18,19、20}、従って明白な簡素化と生理学的な状況からの偏差。最近、addressins にひと細胞のインテグリン依存付着とせん断応力²抗インテグリン抗体の効果を研究する動的接着アッセイを設立しました。技術の原理は以前マウス細胞^21,22で実証されています。ここでは、適応され、上記の並進の質問に対処する開発、開口部より新規道療法抗インテグリン抗体は体内のメカニズムを理解します。

プロトコル

次のセクションで説明した研究は、フリードリヒ ・ アレクサンダー大学エアランゲン-ニュルンベルグの倫理委員会の承認に従ってなされています。

1. 毛細血管の準備

1. 小さなハサミで一側のチューブを伸ばし、慎重に毛細血管 (約 0.5 cm) をチューブに挿入によって長方形の毛細血管をゴム管に接続します。毛細血管とプラスチック パラフィン フィルム チューブ間の接続をシールします。
2. コート (組換え Fc キメラ; 5 μ G/ml、例えばMAdCAM-1 (150 mM NaCl + 1 mM HEPES) コーティング バッファーのアドレスを持つ) のアドレスを持つまたは p20 ピペットを使用して適切なアイソタイプ コントロール ソリューションの 20 μ L で毛細管 (キャピラリーに流体が浸透自体が)。プラスチック パラフィン フィルム チューブに接続されていない側をシールし、37 ° C で少なくとも 1 時間インキュベートいっぱいのみコーティング バッファーまたは陰性対照として適切なアイソタイプ コントロールにキャピラリーを使用します。
3. キャピラリー先端からプラスチック パラフィン フィルムを削除、空のソリューション (5 %bsa の 1x PBS) 37 ° C でブロックの 20 μ L で少なくとも 1 時間ペーパー タオルとブロック毛細血管に毛細血管から液体ソークをさせることによってコーティングプラスチック パラフィン膜と毛細血管の開いている側をシールします。ブロッキング液の顕微鏡検査に進む前に削除しないでください。

2. セルの隔離、治療、顕微鏡検査のための準備

注: これらの手順を実行実行できます孵化の間に毛細血管の準備に必要な期間。

1. ローカルの規則に従って書かれたお客様の承諾後ボランティア活動者 (例えば、 IBD 患者や健常者) の正中皮静脈から無菌採血と高血圧症全血中の 18 mL を収集します。倫理委員会。
   注: この手順は、国・地域の規制によると訓練を受けた、経験豊富な医療スタッフによってのみ実行する必要があります。
2. 50 mL のチューブに血液を入力し、35 mL の 1x PBS でのボリュームに希釈します。その後、アンダーレイの密度勾配媒体の 10 mL と血 PBS の混合物。
3. 800 × gで 15 分と細胞を分離するブレーキなしの 24 の ° C の密度勾配遠心法を実行します。
4. 密度勾配媒体層 (明確な中間層) の右上の白い細胞層を吸引によって末梢血単核球 (PBMCs) を収集します。新鮮な 50 mL のチューブに PBMCs を転送、1x PBS と 300 x gと 10 ° C で 10 分間遠心 50 mL までを記入
5. 上澄みを廃棄、10 mL の 1x PBS で細胞ペレットを再懸濁します、その後などカウント部屋ノイバウアー細胞を使用して細胞数をカウントします。
6. オプション: 勉強するには、好中球接着次の手順を実行します。それ以外の場合、2.7、2.8 の手順に進みます。
   1. 顆粒層 (最下位層も赤血球を含む密度勾配遠心後) を収集します。40 mL の 1x PBS で細胞を再懸濁します。6% の 8 mL を追加デキストラン 1x PBS で穏やかに混合し、室温で 30 分間セル堆積物。
      注: 赤血球の顆粒球が懸濁液のまま、チューブの下にシンクされます。
   2. 30 分後、上澄みを集め、新鮮な 50 mL のチューブと 300 x gと 4 ° C で 6 分間遠心に転送上澄みを廃棄し、0.2 %5 mL を追加することによって残りの赤血球を溶解 ddH₂1 分 o. 加温で塩化ナトリウム。
   3. 1.4 %5 mL を加える ddH₂O で NaCl と別の分の間孵化させなさい。20 mL の 1x PBS の 300 x gで 6 分と 4 ° C のための遠心分離機を追加することによって低張性の溶解を停止します。
   4. 10 mL の 1x PBS で細胞ペレットを再懸濁します。次に、カウント部屋ノイバウアー セルを用いた細胞数をカウントします。
7. オプション: PBMC サブセットの接着を研究する異なる種類の細胞またはサブセットを浄化 (例えば、 CD4⁺および CD8⁺ T 細胞または CD19⁺ B 細胞) 製造元のプロトコルによると、蛍光活性化はマイクロ ビーズを使用してセル (FACS) を並べ替えします。そうでなければ、2.8 の手順を続行します。
8. 300 x gと 10 ° c. で 10 分の細胞懸濁液を遠心分離します。上澄みを廃棄し、製造元の指示に従って (例えばCFSE) 色素細胞と細胞を染色します。
9. その後、300 x gで 10 分の細胞を遠心し、上澄みを廃棄します。1x PBS に再懸濁します、細胞数と再び 300 x gで 10 分間遠心するを決定します。
10. 上澄みを廃棄し、1.5 倍の 10⁶セル/mL の懸濁液を取得する (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl₂ + 1 mM CaCl₂) 接着バッファーの適切な量で染色細胞ペレットを再懸濁します。100 mM MnCl₂最終濃度 1 mM を取得するための適切な量を追加します。
    注: これらの細胞は、顕微鏡検査のために準備が整いました。
11. オプション: サイトカイン、抗体または他の化合物を中和することで細胞を治療します。それ以外の場合、手順 3 に進みます。
    1. 2.10 のステップを省略し、ステップ 2.9 RPMI 培地から染色細胞ペレットを再懸濁します (10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン)、1.5 倍の 10⁶セル/mL の濃度です。
    2. 分析するための条件があるので 48 ウェル プレートのように多くの井戸にこの細胞懸濁液の 1 mL のピペットします。常にネガティブ コントロールとしてコーティングされていない毛細血管を介して灌流される未処理のセルと 1 つの井戸と肯定的な制御としてのアドレスを持つコーティング毛細血管を介して灌流される未処理のセルと 1 つの井戸を準備します。
    3. 抗インテグリン抗体を治療のためには、細胞懸濁液に抗体 (例えば、10 μ G/ml vedolizumab) の適切な量を追加します。37 ° C で 1 時間インキュベートします。治療サイトカイン、細胞懸濁液に組換えサイトカイン (例えば、 10 ng/mL CXCL10) の適切な量を追加します。37 ° C で 5 分間インキュベートします。
    4. インキュベーション後、数回 p1000 ピペットを使用してセルを再によってセルを収穫します。2 mL チューブに細胞を転送、1 mL の 1x PBS でもう一度良くすすぎ、2 mL チューブに追加。細胞の数を決定します。
       注: 付着性のセル人口 (例えば、単球) の孵化は追加措置を必要があります (e.g。、トリプシン処理) 板から細胞を分離します。
12. 10 ° C で 300 x gで 10 分間遠心分離細胞上澄みを廃棄し、1.5 倍の 10⁶セル/mL の懸濁液を得るために接着性バッファーの適切な量で細胞ペレットを再懸濁します。100 mM MnCl₂最終濃度 1 mM を取得するための適切な量を追加します。ケモカインと前処理時に細胞懸濁液 MnCl₂を追加しないでください。これらの細胞は、顕微鏡検査のために準備が整いました。
    注: アッセイに使用される最小のボリュームはポンプとチューブの使用に依存しています。本研究は、蠕動ポンプと材料のテーブルで指定されたチューブを使用して 400 μ L の最小ボリュームが必要でした。(セルの種類および収量) に応じて該当する目的、時間の短い期間で高い密着性を測定する懸濁液の細胞濃度が上がります。
13. 潜在的な変更: 競争力のある動的接着アッセイ
    1. 異なる細胞集団 (例えば、規制および 2.7 のステップに従って製造元の指示に従って磁気ビードの分離によるエフェクター T 細胞) 互いに比較すると上記の手順を実行します。
    2. 2.8-2.9 顕微鏡で細胞集団を区別するためにできるようにする手順の説明に従って、別の色素 (例えばCFSE と FarRed) とそれぞれの人口を染色します。
    3. 上澄みを廃棄し、1.5 倍の 10⁶セル/mL の懸濁液を取得する (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl₂ + 1 mM CaCl₂) 接着バッファーの適切な量で染色細胞ペレットを再懸濁します。
    4. 細胞懸濁液 (制御性 T 細胞など500 μ L)、エフェクター T 細胞の 500 μ L の平等なボリュームをミックス最終を取得する混合 1.5 倍の 10⁶セル/mL の濃度です。100 mM MnCl₂最終濃度 1 mM を取得するための適切な量を追加します。このような懸濁液は、同じ毛細血管を通じて異なる細胞集団を灌によって接着プロセスの競争力の分析の後使用できます。

3. 生きているセルイメージ投射の動的付着

1. 顕微鏡をオンに、適切なフィルターを選択またはレーザー追跡色素 (類) (CFSE の例えば、 488 nm レーザー)、適切な目的 (例えば40 X) および、取得モード有効にするタイムラプス イメージング細胞を刺激します。
2. キャピラリー先端からプラスチック パラフィン フィルムを外し、片側に小さなはさみでチューブを伸ばし、毛細血管 (約 0.5 cm) を慎重に挿入によって (長さ約 5 cm) をチューブの短い部分で毛細血管を接続チューブに毛細血管とプラスチック パラフィン フィルム チューブ間の接続をシールします。
3. 固定トレイ (例えば、長方形カットを毛細血管の長さよりわずかに短い 6 ウェル プレートから蓋) にキャピラリーをマウントし、毛細血管がフォーカスと準備されるように、顕微鏡のトレイ ホルダーに固定の毛細血管顕微鏡。
4. 蠕動ポンプの対応する切り込みにゴム管を挿入し、細胞懸濁液を含むに従ってサンプル チューブに毛細血管に接続されていない端を置きます。流れを収集するために 15 mL チューブに毛細血管の反対側に短いチューブを挿入します。
5. チューブの塗りつぶしように細胞懸濁液ほとんど毛細血管に到達するまでは 1 分あたり 500 μ L の流量で。100 μ L/分の流量と毛細血管の塗りつぶしができます。
   注: キャピラリーを素早く充填キャピラリー内細胞懸濁液の正規分布を保証します。
6. 毛細血管は、細胞懸濁液でいっぱいになるが、10 μ L/分の流量を調整します。
   メモ: 異なるサイズまたは別の蠕動ポンプの毛細血管が使用されるときこれらの流量が異なる場合があります。本研究では 10 μ L/分の流量ポンプと体内の血流を模倣する毛細血管の最適化を行った。
7. すべての 2、アドレスを持つコーティング内壁に沿って毛管をゆっくり移動細胞のコマ撮り画像をキャプチャ 3 分の合計のための s。
   注: 間隔および時間の合計は、セルの種類および質問に対処するによって異なります可能性があります。
8. 毛細血管を破棄する前にビデオで示した部分が代表者であることを確認するために顕微鏡の目の部分を通って全体の毛細血管を選別します。必要に応じて、2 番目の記録を作る。
9. ポンプからのチューブを無料、残り液 2 mL チューブに戻って実行して固定トレイから毛細血管とチューブを切断し、次のキャピラリーを続行します。

4. 評価とセルを数える

1. 適切なソフトウェアと時間経過のシーケンスを開き、(「初め」) の最初の 3 つの画像と ("エンド") 最後の 3 つの画像を Tiff ファイルとしてエクスポートします。
2. オープン 32 ビット ImageJ の 3 つの「開始」画像に変換 ('画像 |種類 |32 ビット ') と写真をマージ (' 画像 |カラー |チャネルを結合。赤、緑、青の色に割り当てる別の写真)。合成画像を RGB に変換 (' 画像 |Type-RGB')、Tiff ファイルとして保存します。「最後」の画像を繰り返します。
   注: さまざまな色に染まった細胞と競争力のある動的接着アッセイ、最初、異なる細胞集団の接着を別々 に分析するイメージのチャネルを分割します。
3. 「始まり」と「終わり」複合材料の目に見える白いセルをカウントし、「エンド」の白いセルから「初め」の白いセル数を減算します。
   注: 3 分間隔のセルを新しく付着数違い表します。合成画像で移動細胞は前および次のフレーム内の別の場所に彼らをローカライズするのでそれぞれのフレームに割り当てられた特定の色で表示されます。細胞の付着、白に同じスポット重複で赤、緑、および青の信号であります。
4. 良い結果を可視化、例えばImageJ を用いた時間経過シーケンスからビデオをコンパイルします。

結果

提示法細胞接着と干渉している抗体の役割この原稿で機能的にできるだけ密接に人間細胞接着内皮壁体内プロセスをシミュレートすることを目的を評価します。したがって、極薄の毛細血管は addressins でコーティング、灌流ポンプを使用して興味の蛍光に分類されたひと細胞の灌流します。生細胞イメージング、addressins にひと細胞の接着を使用しては、リアルタイム (図 1) で観察できます。

このメソッドは、特に IBD における癒着防止治療のメカニズムを明らかに適しています。図 2 aに示すように、3 つの addressins のいずれかが存在するとき、ICAM 1、VCAM 1、madcam-1 および人間の PBMCs のアイソタイプ Fc キメラでコーティングされた毛細血管の血流がマーク接着になってきます。対照...

ディスカッション

上記のプロトコルでは、内皮細胞リガンドに人間の免疫細胞の動的接着を研究する有用な手法について説明します。コーティングされた配位子、灌流セルタイプまたはサブセット、追加刺激または異なる中和抗体の孵化の変化を通じてそれがほぼ無制限の潜在的なアプリケーション。したがって、このような動的接着アッセイを開発し、接着プロセスと干渉する薬剤と臨床治療を最適化に役立つかもしれない並進のクエリと同様に、基礎的研究の両方の基本的な質問に答えるに役立つ可能性があります。

臨床抗接着療法の効果を調査するためのアッセイの有用性を実証されている最近。また、インテグリンの異なる種類と量を表現する異なる細胞集団は、アッセイ²³の妥当性を支えるそれぞれ addressins 動的接着の一貫したレベルを表示します。

全体的には、プロトコルの完了作業の約 6 時間を必要とし中間の技術的な課題を提示します。毛細血管のコーティングが開始されると、重大な問題は脱水症状を避けるためです。培養の段階で正確なシール ソリューショ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
48ウェルプレート	Sarstedt	833,923
接着緩衝液: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2
ブロッキング溶液: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA
ウシ血清アルブミン (BSA)	Applichem	A1391,0100
CaCl2	Merck	2382
キャピラリー: 長方形ボロ チューブ 0.20 mm x 2.00 mm ID、長さ 50 mm	CM Scientific	3520-050
CCL-2、ヒト	Immunotools	11343384
CD4-Microbeads、ヒト	Miltenyi Biotec	130-045-101
CellTrace™CFSE 細胞増殖キット	ThermoFischer Scientific	C34554
遠心分離機 (Rotixa 50 RS)	Hettrich
コーティングバッファー: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES
共焦点顕微鏡 (TCS SP8)	Leica
CXCL-10、ヒト	免疫ツール	11343884
Dextran 500	Roth	9219.3
EDTA KE/9 mL モノベット	Sarstedt
Falcons (50 mL)	Sarstedt	62,547,004
Fc chimera isotype control	R&D Systems	110-HG
流動動ポンプ (LabV1)	Baoding Shenchen Precision Pump Company
HEPES	VWR	J848-100ML
Human IgG Isotype Control	ThermoFischer Scientific	31154
Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera	R&D Systems	720-IC-050
LSカラム	Miltenyi Biotec	130-042-401
MgCl2	>Roth
MnCl2	Roth
マウスIgGアイソタイプコントロール	Miltenyi Biotec	130-106-545
Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera	R&D Systems	6056-MC
NaCl	Roth	3957.3
Natalizumab	Biogen
Neubauer 計数チャンバー	Roth	T729.1
Pancoll, human	PAN Biotech	P04-601000
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biochrom	L 182-10	w/o Mg and Ca
プラスチックパラフィンフィルム:パラフィルム(PM-996)	VWR	52858-000
精製された抗ヒトCD18	Biolegend	302102
RPMI媒体1640	Gibco Life Technologies	61870-010
ゴムチューブ:SC0059T 3ストップLMT-55チューブ、内径1.02 mm、長さ406.4 mm	Ismatec	SC0059
Serological Pipetts	Sarstedt	861,254,025
Trypan blue	Roth	CN76.1
Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) fc chimera	Biolegend	553706
Vedolizumab (Entyvio)	武田薬品