このプロトコルは、携帯電話のコンテキストで本質的に低活動、シングル売り上げ高プロテアーゼの活性を評価する方法を示します。具体的には、このメソッドは、PCSK9 のプロテアーゼ活性はその究極の高コレステロール血症の機能に必要な脂質代謝の主要ドライバーのプロテアーゼ活性の評価に適用されます。
この記事について
サマリー
要約
プロタンパク質転換酵素サチライシン/kexin タイプ 9 (PCSK9) は血清低密度リポタンパク質 (LDL) を調節するシングル売り上げ高プロテアーゼとその結果、心血管疾患。PCSK9 分解は完全高コレステロール血症効果に必須ですが、蛋白機能の評価は挑戦: PCSK9 自体を切断にのみ知られている、単一回転率だけを受けるし、タンパク質分解の後で、基板を保持自動-阻害剤として活性部位。ここで紹介する方法は、これらの課題を克服するアッセイをについて説明します。試金はセル ベースのコンテキストとリンク馴化培地で簡単に読み取ることができます分泌ルシフェラーゼの活動に成功した胸の谷間に分子分解について説明します。経由で突然変異誘発、トランスフェクション、ルシフェラーゼの読み出しのシーケンシャル手順アッセイは、高スループット方法で PCSK9 蛋白酵素の遺伝学的または分子の摂動の条件を調べることができます。このシステムは、臨床的に検出されたミスセンス単一ヌクレオチドの多形 (SNPs) 同様 PCSK9 タンパク質分解の小分子阻害剤のスクリーニングの両方生化学的評価に適しています。
概要
LDL コレステロール (LDL-C) を上げると動脈硬化性心臓病1,2を運転、PCSK9 は劣化の LDL 受容体 (LDL-R) を対象します。治療ターゲット PCSK9 はしっかり LDL-C を下げるし、スタチン3,4積極的脂質低下療法に追加される場合でも患者は、心血管アウトカムを改善します。ただし、現在承認された治療法抗体ベースのアプローチに限定され、費用対効果5,6の不足に苦しみます。この問題を解決するためにより少なく高価な治療選択肢、大きなメリットを得るために可能性が高い患者を識別する手段またはその両方が必要です。
小分子アプローチが細胞内 PCSK9 をターゲットの管理、改善されたルートを提供し、このエリア7で、「聖杯」を作るコストを削減します。ただし、PCSK9 は小分子による薬物に困難証明しています。、プロテアーゼとして PCSK9 の蛋白分解機能のターゲット、魅力的な戦略と自己タンパク質分解 PCSK9 成熟8の率制限ステップは、LDL R9その最大効果のため必要です。日には、ただし、この戦略は成功していない、PCSK9 のユニークな生化学による可能性が高い: PCSK9 裂くだけ10、シングル売り上げ高反応を実行する、自己-胸の谷間後、PCSK9 prodomain ままとしてアクティブ サイトでバインドされている、自動阻害剤11、任意のさらなるプロテアーゼ活性の読み出しを防止します。
高スループット方法8PCSK9 蛋白分解機能を評価する手法を提案します。サイト指示された突然変異誘発、を通じて捜査官は、PCSK9 成熟の率制限ステップ、タンパク質分解に及ぼす影響を評価するのに診療所は、SNPs を符号化の効果を調査するのにこのアッセイを使用できます。さらに、このメソッドは、LDL r PCSK9 のプレゼンテーションを妨害 (、PCSK9 の高コレステロール血症効果を調節する) 最終的に期待されている、PCSK9 のタンパク質分解の変調器を識別するために高速画面の設計に役に立つでしょう.最後に、このプロトコルは i) 特定の基板プロテアーゼのペアを見つけることができます、ため基板 ii) 適切な細胞内アンカーを確立する、本質的に低活動で、他のプロテアーゼに適応することができます。
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プロトコル
1 プロテアーゼ ベクトルのサイト指示された突然変異誘発
- 設計し、標準サイト指示された突然変異誘発のプロトコルの12の修正を使用して興味の突然変異をインストールするカスタム合成オリゴヌクレオチドを発注します。(追加精製) することがなく標準脱塩プライマーは、完全に許容されます。
注: プライマー設計に一般的なアプローチは、テーブル 1、溶融温度 (Tm) 計算機の関心のポリメラーゼに固有を使用して示されているように、部分的に重複するプライマーを作成する含まれます。 - ポリメラーゼ連鎖反応 (Pcr) に設定サイト指示された突然変異誘発氷上では、表 2に示されているように。
- 表 3に示されているように、PCRs をサイクルします。
- 1% の agarose のゲルの各 PCR の 2-5 μ L を実行し、成功の増幅を確認する製品を視覚化します。
注: 正常な PCR テンプレート (~7.8 kB) のおおよそのサイズ マーカーで単一、著名な DNA バンドが表示されます。 - DpnI の (25 μ L 反応) あたり 0.5 μ L を追加し、37 ° C 1 時間でサンプルをインキュベートします。
- 化学的に有能な腸管出血性大腸菌に反応の 2 μ L を変換します。
注: 急成長中の大腸菌の菌株培養時間は短縮されますが、任意のクローンのひずみが許容されます。 - 50-100 μ G/ml carbenicillin を含むルリア ベルターニカミラ (LB) 寒天に変換をプレートします。37 ° C で一晩版を孵化させなさい
- 小規模な文化 (50-100 μ G/ml carbenicillin と LB 培地の 2 5 mL) に成長する 2-4 植民地を選択します。濁ったまで 220 rpm で 37 ° C で文化を孵化させなさい。
- 製造元の指示に従ってプラスミド DNA 精製 (すなわち、「miniprep」) キットを使用してセルからの DNA のプラスミッドを分離します。微量分光光度計を使用して溶離された DNA の濃度を定量化します。
- プラスミド DNA (コア、商業施設など) ・ サンガー シーケンス サービスを使用して広範囲をシーケンスします。サービスの仕様によると DNA サンプルを準備します。正常に事前配列の反作用で使用されるプライマーは、表 4に記載されています。
注: 全プラスミドの PCR 増幅による PCSK9 コード領域全体のシーケンスは各変異体をお勧めします。
2. 高スループット ルシフェラーゼを用いたタンパク質アッセイ
-
セルめっき (0 日)
- 実験用低通過 HEK293T 細胞を使用し、ダルベッコの文化が 10% 牛胎児血清 (FBS) でイーグル培地 (DMEM) を変更します。実行すべてのセル ルシフェラーゼ活性を分析する準備が整うまでのティッシュ文化フードの無菌条件下で作業します。ウェルズと transfections が 3 通をテストする各条件に対して実行されることを期待して、実験に必要なプレートの数を推定します。
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結果
高スループット タンパク質アッセイは、3 つの主要な課題を克服するために依存します。まず、シングル売り上げ高 PCSK9 プロテアーゼ抑制に欠けている PCSK9 プロテアーゼの本質的に低い出力を克服するために prodomain は、シーケンスで使用、胸の谷間、prodomain の末尾に分泌された14は、ルシフェラーゼにリンクされています。第二に、プロテアーゼ折ることの必要性を満たすためにその抑制と複雑な prodomain、2 つのポリペプチドが行ったトランスで携帯電話のコンテキスト15,16、経由bicistronic ベクトル。第三に、分解されていない基板からの劈開を区別、PCSK9 プロテアーゼは小胞体 (ER) から複雑な PCSK9 の終了を防ぐことができますが、蛋白分解機能17,
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ディスカッション
上記実験の手順は、シングル売り上げ高プロテアーゼ PCSK9 の本質的に低活動を克服し、堅牢な方法でそのタンパク質の機能を評価する方法を提示します。アッセイの重要な概念は、酵素によって増幅された読み出しにシングル売り上げ高イベントを変換するのに依存します。アッセイの強みには、比較的短い時間枠と高スループット方法にそのスケーラビリティと同様、ルシフェラーゼ レポーターの使いやすさが含まれます。さらに、アッセイは、そのネイティブな携帯電話のコンテキストでのタンパク質分解を評価します。さらに、このアッセイで臨床的に識別された Snp を評価できます人間や患者組織を必要とせず PCSK9 分解に及ぼす影響興味の遺伝子型の知識だけが必要です。
アッセイのいくつかの技術的な限界が存在します。アッセイは、細胞内のタンパク質分解を評価、それもベクトルの過剰発現が必要です。アッセイは、HEK293T 細胞のトランスフェクションを必要とするので本質的な井戸からも変動する遺伝子導入効率を追加します。プロテアーゼ死者 S386A PCSK9 はタンパク質分解のネガティブ コントロールとして提供しています、...
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
著者に感謝 NHLBI/NIH (K08 HL124068 と LRP HMOT1243)、UCSF 臨床と医療科学研究所触媒プログラム (UL1 TR000004)、UCSF 学術上院ヘルマン財団を通じて NCATS/NIH から寛大な資金調達支援、ギリアド サイエンス研究学者賞、(すべてジョン s. Chorba) ファイザーが熱望する心血管賞、ハワード ヒューズ医学研究所 (に Adri 雅・ ガルバン、ケバン M. Shokat)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| PCRチューブUSA | サイエンティフィック | 1402-2900PCR | |
| 用Q5ホットスタート | ニューイングランドバイオラボ | M0493L | 高忠実度DNAポリメラーゼ |
| デオキシヌクレオチド溶液ミックス | ニューイングランドバイオラボ | N0447L | dNTPs(PCR用) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | n / a | 著者から入手可能 | |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | 著者 | n/a | 著者から入手可能 |
| アガロース LE | ゴールド バイオテクノロジー | A-201-100 | DNAゲル用 |
| E-ゲルイメージャーシステム ブルーライトベース | ThermoFisher Scientific | 4466612 | DNAゲルのイメージング用 |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | DNAゲル用 |
| トリスベース | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | DNAゲルランニングバッファー用 |
| 氷酢酸 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A38-500 | DNAゲルランニングバッファー |
| エチレンジアミン四酢酸溶液 | ミリポアシグマ | 3690 | EDTA、DNAゲルランニングバッファー |
| 用 1 kb DNAラダー | ゴールドバイオテクノロジー | D010 | DNAラダー |
| DpnI | ニューイングランドバイオラボ | R0176S | 制限酵素 |
| LB寒天プレート、100&マイクロ;g/mL カルベニシリン | テクノバ | L1010 | LB-Carb プレート |
| ワンショット Mach1 T ファージ耐性 ケミカルコンピテント E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | ケミカルコンピテントセル |
| LB ブロス、ミラー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | BP1426-2 | LB |
| カルベニシリン | ゴールド バイオテクノロジー | C-103-5 | 選択的抗生物質 |
| E.Z.N.A. プラスミド ミニキット I | オメガ BioTek | D6942-02 | DNA 精製 ミニプレップキット |
| NanoDrop 2000 分光光度計 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ND-2000C | 分光光度計 |
| 293T 細胞 | アメリカ組織培養コレクション (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T 細胞 |
| DMEM、高グルコース、ピルビン酸 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11995065 | DMEM、哺乳類細胞培地 |
| ウシ胎児 血清 | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| トリプシン-EDTA (0.05%)、フェノールレッド | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 25300062 | トリプシン、細胞解離用 |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 10010023 | PBS |
| カウントス自動セルカウンター | サーモフィッシャーサイエンティフィック | C10227 | 自動セルカウンティング |
| Countess細胞計数チャンバースライド | ThermoFisher Scientific | C10228 | 細胞計数用スライド |
| CELLSTAR 組織培養プレート、ホワイト、ホワイトボトム、蓋付き | Grenier Bio-One | 655083 | ホワイト、ホワイトボトム 96ウェルプレート |
| TempPlate ノンスカート付き96ウェルPCRプレート、ナチュラル | USA Scientific | 1402-9596 | マスタープラスミドプレート用96ウェルプレート |
| Nunc 2.0mL DeepWellプレート | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 278743 | 96ウェルディープウェルプレート |
| リポフェクタミン 3000 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | サイエンティフィック L3000008 | 脂質トランスフェクション試薬、Lf3K |
| P3000 試薬 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | L3000008 | DNA プレコンプレックス試薬、Lf3K |
| OptiMEM I 還元型血清培地 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 31985062 | 還元型血清培地トランスフェクション |
| 用(+)-L-アスコルビン酸ナトリウム | ミリポアシグマ | A4034 | アスコルビン酸ナトリウム |
| 塩化ナトリウム | ミリポアシグマ | S9888 | NaCl |
| アルブミン、ウシ血清、フラクションV、低重金属 | ミリポアシグマ | 12659 | BSA |
| メタノール (HPLC) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A4524 | MeOH |
| 塩酸 | VWR | JT9535-2 | 濃縮HCl |
| セレンテラジン | 金 | バイオテクノロジーCZ2.5 | ルシフェラーゼ基質 |
| シリンジフィルター、滅菌 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 09-720-3 | フィルター、PVDF、0.22 & マイクロ;m pore |
| Pipet-Lite マルチピペット L12-200XLS+ | レイニン | 17013810 | マルチチャンネルピペット |
| Pipet-Lite マルチピペット L12-20XLS+ | レイニン | 17013808 | マルチチャンネルピペット |
| Pipet-Lite マルチピペット L12-10XLS+ | レイニン | 17013807 | マルチチャンネルピペット |
| 試薬リザーバー | Corning | 4870 | 試薬 |
| 用トラフ遠心チューブ、15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL |
| 遠心チューブ、50 mL | Corning | 430829 | 50 mLチューブ |
| Spark マイクロプレートリーダー | Tecan | N/a | プレートリーダー |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | スプレッドシートソフトウェア |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific データ解析ソフトウェア |
参考文献
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