Method Article

ショウジョウバエのゲノム編集による組織固有のバイナリ転写システムを生成するための効率的な戦略

DOI:

10.3791/58268

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September 19th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ショウジョウバエの遺伝子の最初のコーディングのエクソンを転写ドライバーと置き換えることにより組織特異的転写、バイナリ システムを生成する方法を紹介します。CRISPR/Cas9 ベースのメソッド交換遺伝子の内因性の規制の下での転写活性化シーケンスを配置、その結果遺伝子特定の時空間パターンを排他的に transctivator 式が容易になります。

Abstract

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バイナリ転写システムは、広く可視化して細胞の特定のグループの細胞運命と遺伝子発現やモデル生物の組織を操作するための強力な遺伝的ツールです。これらのシステムは、個別の遺伝子組換え行に 2 つのコンポーネントを含まれています。ドライバーのラインはターゲット遺伝子は転写活性化因子の結合部位に下流に置かれたレポーター/エフェクター ライン港湾組織固有のプロモーター/エンハンサーは、の管理下の転写活性化因子を表しています。両方のコンポーネントをかくまっている動物は、ターゲット遺伝子発現の組織特異を転写活性化を誘導します。対象となる組織の遺伝子発現の正確な時空間は、細胞・遺伝子活動の公平な解釈にとって重要です。したがって、排他的な細胞/組織固有のドライバーの行を生成するための手法の開発が不可欠です。ここで採用することにより高い組織特異的標的発現システムを生成する手法を提案、「定期的にクラスター化 Interspaced 短い回文繰り返し/CRISPR 関連」(CRISPR/Cas)-ゲノム編集技術をベース。このメソッドでは、Cas9 は、2 つのキメラを狙われてエンドヌクレアーゼ (DSB) の二重鎖切断を作成するショウジョウバエのゲノムの遺伝子の最初のコーディングのエクソンの特定のサイトに Rna (gRNA) をガイドします。転写活性化シーケンスを含む外因性ドナー プラスミドを使用すると、その後、セル自律修復機械正確な削除と、トランスと、エクソンの交換の結果、DSB のホモロジー監督修復 (HDR) が可能にします。シーケンス。ノックでトランスは細胞でのみ発現するcis-置き換えられた遺伝子の調節配列が機能。ショウジョウバエ fgfで表されるバイナリ転写ドライバーを生成するここで説明した詳細なステップバイ ステップ プロトコル/無店舗-任意遺伝子の組織特異的発現に採用されることができます/神経上皮細胞を作り出します。

Introduction

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ターゲット遺伝子発現の遺伝のツールボックスをショウジョウバエ、それにさまざまな細胞プロセスにかかわる遺伝子の機能を調べるための最高のモデル システムの 1 つでも開発しました。ショウジョウバエの遺伝学的モデル1 (図 1) で組織固有のエンハンサー トラップと遺伝子ヒトのGal4/UA (上流活性化配列)、酵母などのバイナリ表現システム初採用。このシステムは、多数の遺伝子の過剰発現、ヒト、セルもセル アブレーション、セル マーキング、細胞と分子のライブ トレースの選択されたグループでノックアウトの時空間的制御などの技術の開発を促進開発中にモザイク解析トレースする血統と組織胚プロセス。LexA細菌のようなバイナリの転写システムの数/LexAopシステム (図 1) およびアカパンカビQ システム、強力な遺伝学的ツールに加えて、ショウジョウバエ、広く使われるようになりました目標とされた遺伝子発現1,2,3元の Gal4/UAS システム。<....

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Protocol

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1. 設計と gRNA 発現ベクターの構築

  1. エクソンの長い定義された領域を正確に置き換える、デュアル gRNA アプローチ6、各 gRNA することができます具体的には選択した関心領域の両端をターゲットを使用します。ドライバーの正確な遺伝子特定の時空間表現を得るためには、遺伝子の最初のコーディング エクソン内の 2 つの gRNA ターゲット サイトを選択します。
  2. ショウジョウバエ、flyCRISPR 最適なターゲットのファインダー ツール (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/) を使用して、gRNA ターゲット ・ サイトを選択します。CRISPR 設計の最適化ツール (http://crispr.mit.edu)、FlyCas9 を含む、同様に他 CRISPR のデザイン ツールを使用ことができます (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9)、および E-ぱりっとした (www.e-crisp.org/E-CRISP)。
    注: gRNA デザインおよびクローン作成の次のプロトコル方法前述6,7から採用されました。
    1. オンライン ツールで提供さ....

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Results

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このプロトコルは、ターゲット バイナリ式レポーター システム特定のbnlセル5を表現するための生成に使用された正常に。Cis-複雑な時空間bnl式を制御する規制要素 (クレス) が特徴付けされていません。したがって、内因性bnl規制シーケンスの制御の下での時空間表現を成し遂げるためには、 bnlのだけ最初のコーディング エクソンは細菌LexAトランスのシーケンスに置き換えられますように設計されました。ショウジョウバエの最適な表現を提供するために知られている改良されたnls LexA::p65カセットが選ばれました。

交換戦略目的、キメラを生成するnls-LexA:p65-bnl mRNA 転写と転写後の内因性制御の下で。このキメラ mRNA にそ.......

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Discussion

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伝統的に、ショウジョウバエエンハンサー トラップは、2 つの異なるメソッドによって生成されました。いずれかのドライバーのランダム挿入が含まれています (例えば。、 Gal4) 転位によってゲノムのシーケンス (e.g。、P 要素の転位)1 。また、ゲノム3,11の異所性サイトに統合される、プラスミドの構成体で推定エンハンサー/プロモーター領域の転写制御の下でドライバーのシーケンスを配置できます。これらのメソッドはショウジョウバエのGal4とLexAエンハンサー トラップの大きなプールを生成、いくつかの制限がある.ゲノムの P 要素仲介されたランダムな挿入が重要なcisの規制活動を妨害・規制シーケンス。ゲノムのランダムの転位によるトランス式は複数の隣接遺伝子のパターンを報告ことがあります。その一方で、遺伝子のシス調節配列の知識はエンハンサー トラップ .......

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Disclosures

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著者はある利益相反を開示します。

Acknowledgements

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CRISPR 戦略に関する議論、博士・ f ・ ポート、博士・ k ・ オコナー-ジャイルズと博士 s. 風水に感謝します。博士結核コーンバーグと試薬; ブルーミントン ストック センターUMD イメージングの中核施設。NIH の資金調達: R00HL114867 と R35GM124878 の sr。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
X-Gal/IPTGGentrox (Genesee Scientific)18-218クローニング
LB-寒天BD DifcoBD 244520クローニング
Tris-HClSigma AldrichT3253分子生物学
EDTASigma AldrichE1161分子生物学
NaClSigma AldrichS7653分子生物学
UltraPure DNase/RNase-Free WaterThermoFisher Scientific10977-023Molecular Biology
10% SDSSigma Aldrich71736分子生物学
KOAcフィッシャー・サイエンティフィックP1190分子生物学
EtOHフィッシャー・サイエンティフィック04-355-451分子生物学
GeneJET Miniprepサーモフィッシャー・サイエンティフィックK0503Miniprep
PureLink HiPure プラスミド マキシペップ・キットサーモフィッシャー・サイエンティフィK210006マキシプレップ
BbsINEBR0539S制限酵素
プライマーIDT-DNAPCR
pCFD4Kornberg LabgRNA
KAPA HiFi ホットスタート用DNAテンプレートおよびベクター (Kapa Biosystems)Kapa biosystemsKK2601PCR
Q5-high fidelity TaqNEB NEB #M0491PCR
Gibson Assembly Master MixNEBNEB #E2611DNAアセンブリ
pBPnlsLexA:p65UwLexA増幅用AddgeneDNAテンプレート
プロテイナーゼKサーモフィッシャーサイエンティフィック25530049Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)SydlabMB067-EQ2RMolecular Biology
Gel elution kitZymo Research (Genesee Scientific)11-300Molecular Biology
TRI reagentSigma-AldrichMolecular Biology
Direct-zol RNA purification kitsZymo Research (Genesee Scientific)11-330Molecular Biology
OneTaq One-Step RT-PCR KitNEBE5315SMolecular Biology
lexO-CherryCAAXKornberg LabFly line
UAS-CD8:GFPKornberg labフライライン
btl-Gal4Kornberg labFly line MKRS
/TB6BKornberg labFly line
Confocal Microscope SP5XLeicaImaging expression pattern
CO2 stationGenesee Scientific59-122WCUfly pushing
実体顕微鏡OlympusSZ-61fly pushing
マイクロチューブ均質化乳棒Fisher-Scientific03-421-217ゲノムDNA単離
NanoDrop 分光光度計ThermoFisher ScientificND-1000DNA定量
ック

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Lai, S. -L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophil....

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CRISPR Cas9Binary Transcription SystemTissue specific ExpressionDrosophila Genome EditingHomology directed RepairGuide RNA DesignTransactivator Knock inExon ReplacementSpatiotemporal RegulationGAL4 LexA System

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