ショウジョウバエのゲノム編集による組織固有のバイナリ転写システムを生成するための効率的な戦略

サマリー

ショウジョウバエの遺伝子の最初のコーディングのエクソンを転写ドライバーと置き換えることにより組織特異的転写、バイナリ システムを生成する方法を紹介します。CRISPR/Cas9 ベースのメソッド交換遺伝子の内因性の規制の下での転写活性化シーケンスを配置、その結果遺伝子特定の時空間パターンを排他的に transctivator 式が容易になります。

要約

バイナリ転写システムは、広く可視化して細胞の特定のグループの細胞運命と遺伝子発現やモデル生物の組織を操作するための強力な遺伝的ツールです。これらのシステムは、個別の遺伝子組換え行に 2 つのコンポーネントを含まれています。ドライバーのラインはターゲット遺伝子は転写活性化因子の結合部位に下流に置かれたレポーター/エフェクター ライン港湾組織固有のプロモーター/エンハンサーは、の管理下の転写活性化因子を表しています。両方のコンポーネントをかくまっている動物は、ターゲット遺伝子発現の組織特異を転写活性化を誘導します。対象となる組織の遺伝子発現の正確な時空間は、細胞・遺伝子活動の公平な解釈にとって重要です。したがって、排他的な細胞/組織固有のドライバーの行を生成するための手法の開発が不可欠です。ここで採用することにより高い組織特異的標的発現システムを生成する手法を提案、「定期的にクラスター化 Interspaced 短い回文繰り返し/CRISPR 関連」(CRISPR/Cas)-ゲノム編集技術をベース。このメソッドでは、Cas9 は、2 つのキメラを狙われてエンドヌクレアーゼ (DSB) の二重鎖切断を作成するショウジョウバエのゲノムの遺伝子の最初のコーディングのエクソンの特定のサイトに Rna (gRNA) をガイドします。転写活性化シーケンスを含む外因性ドナー プラスミドを使用すると、その後、セル自律修復機械正確な削除と、トランスと、エクソンの交換の結果、DSB のホモロジー監督修復 (HDR) が可能にします。シーケンス。ノックでトランスは細胞でのみ発現するcis-置き換えられた遺伝子の調節配列が機能。ショウジョウバエ fgfで表されるバイナリ転写ドライバーを生成するここで説明した詳細なステップバイ ステップ プロトコル/無店舗-任意遺伝子の組織特異的発現に採用されることができます/神経上皮細胞を作り出します。

概要

ターゲット遺伝子発現の遺伝のツールボックスをショウジョウバエ、それにさまざまな細胞プロセスにかかわる遺伝子の機能を調べるための最高のモデル システムの 1 つでも開発しました。ショウジョウバエの遺伝学的モデル¹ (図 1) で組織固有のエンハンサー トラップと遺伝子ヒトのGal4/UA (上流活性化配列)、酵母などのバイナリ表現システム初採用。このシステムは、多数の遺伝子の過剰発現、ヒト、セルもセル アブレーション、セル マーキング、細胞と分子のライブ トレースの選択されたグループでノックアウトの時空間的制御などの技術の開発を促進開発中にモザイク解析トレースする血統と組織胚プロセス。LexA細菌のようなバイナリの転写システムの数/LexA_opシステム (図 1) およびアカパンカビQ システム、強力な遺伝学的ツールに加えて、ショウジョウバエ、広く使われるようになりました目標とされた遺伝子発現^1,2,3元の Gal4/UAS システム。

ゲノム編集技術を採用することにより信頼性の高い組織固有のバイナリ表現システムを生成する方法を紹介します。CRISPR/Cas9 ゲノム編集技術の最近の進歩は、有機体の広い範囲で指示されたゲノムを変更する前例のない機会を許可しています。その他の利用可能なゲノム編集技術と比較して、CRISPR/Cas9 システムは安価で効率的、かつ信頼性の高いです。この技術は細菌の適応免疫系の構成要素を利用:化膿連鎖球菌二重鎖切断 (DSB) を作成して特定のゲノムのサイト、Cas9 をガイドするキメラ ガイド RNA (gRNA) の Cas9 エンドヌクレアーゼターゲットを絞った DSB⁴。セルには、異なる経路を用いて DSB の修復する機械が含まれて。非相同末端結合 (NHEJ) は、ホモロジー監督修理 (HDR) がテンプレートとして外因性の HDR ドナーを使用して、定義された監督/望ましいゲノム ノック-/ノック アウトを紹介しながら遺伝子機能を混乱させる小さな挿入または削除に します。HDR ベース交換戦略は、伝統的なエンハンサー トラップ法のすべての制限を克服することができます信頼性の高い組織固有のバイナリ表現システムを生成する効率的に利用できます。ショウジョウバエの内因性転写と転写後調節の制御の下で表されるバイナリ転写ドライバー行を生成する HDR の CRISPR/Cas9 ベース修理の利用手順について述べる遺伝子。このプロトコル ドライバーのラインのために特定の世代を示す無店舗気管の気道上皮⁵の分岐の形態形成を調節する FGF ファミリー蛋白質 (bnl) 遺伝子。この例では、 bnl遺伝子の最初のコーディング エクソンが細菌LexA転写活性化シーケンスのシーケンスによって、内因性のcisを変更することがなく置き換えられました- bnl遺伝子の制御配列。戦略が時空bnl -排他的にLexAoperator (LexAopまたはシャワー) の下流に配置されますレポーター遺伝子の発現を制御するbnl LexAドライバー行を生成することを示す上皮・間葉系/神経細胞を表現します。

プロトコル

1. 設計と gRNA 発現ベクターの構築

1. エクソンの長い定義された領域を正確に置き換える、デュアル gRNA アプローチ⁶、各 gRNA することができます具体的には選択した関心領域の両端をターゲットを使用します。ドライバーの正確な遺伝子特定の時空間表現を得るためには、遺伝子の最初のコーディング エクソン内の 2 つの gRNA ターゲット サイトを選択します。
2. ショウジョウバエ、flyCRISPR 最適なターゲットのファインダー ツール (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/) を使用して、gRNA ターゲット ・ サイトを選択します。CRISPR 設計の最適化ツール (http://crispr.mit.edu)、FlyCas9 を含む、同様に他 CRISPR のデザイン ツールを使用ことができます (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9)、および E-ぱりっとした (www.e-crisp.org/E-CRISP)。
   注: gRNA デザインおよびクローン作成の次のプロトコル方法前述^6,7から採用されました。
   1. オンライン ツールで提供されるボックスに実際のシーケンスをコピーします。「選択のゲノム」のドロップ ダウン メニューで最も最近リリースされたショウジョウバエキイロショウジョウバエ ゲノムの注釈版、"r_6、"を選択します。フィールド「選択ガイド長 (nt)」で「20」を入力「すべて CRISPR 目標」見つけるし、「CRISPR ターゲットの検索」をクリックするを選択します。
   2. "PAM"「厳密」と「NGG のみ」の「最大値」を設定することによってすべての候補 gRNA ターゲットを評価します。任意の潜在的なオフ-ターゲットまたはターゲットを離れて可能な限りの最小番号を付けず gRNA サイトを選択してください。Web ツールを使用しては、潜在的な「良い」アクティビティ スコアと gRNAs を選択する 2014年⁸ Doenchらで説明します。
   3. 同時に、親のフライラインに注入 (例えば、nos Cas9 BL # 54591 X 染色体で) のために選択のゲノムでの gRNA ターゲットの一塩基多型がないことを確認します。グラッツら2015⁷親フライラインからゲノム DNA を抽出するために記載されているプロトコルに従ってください。PCR 増幅、フランクの関心と忠実度の高い DNA ポリメラーゼ; シーケンス プライマーを使用して 500-1,000 nt 地域約、PCR によって増幅される製品のシーケンスを確認します。
3. タンデム gRNA 発現ベクターを生成するには、2 つの protospacer シーケンス pCFD4 RNA 発現ベクターに導入する結紮独立クローニング プロトコル⁶に従ってください。両方の sgRNAs は、強い U6:3 プロモーター⁹ (https://www.crisprflydesign.org) から表現されますが、改善されたマルチ gRNA 発現ベクター (pCFD5) は利用可能な今ことに注意。PCFD4 ベクトルに、gRNAs を複製するのに DNA アセンブリ メソッドを使用します。
   1. 設計し、発注 RNA 発現ベクター pCFD4 に 2 つの protospacer シーケンスを導入するための前方および逆のプライマー (表 1 a)。前述の⁶、前方のプライマーには U6 1 プロモーターと pCFD4; gRNA コアに対応する領域が並ぶ最初の protospacer シーケンスが含まれています逆のプライマーには、gRNA コアと pCDF4 で 3 U6 プロモーターに対応する領域が並ぶ 2 番目 protospacer 逆の補数シーケンスが含まれています。
   2. DNase、RNase フリーの二重蒸留水 (ddH₂O) を 100 μ M にプライマーを再懸濁します。10 μ M の作業濃度のプライマーを作る。PCFD4 プラスミッドのテンプレートとして使用し、忠実度の高いポリメラーゼを用いた PCR 反応⁶の設定をお勧めします PCR 反応を設定します。
   3. PCFD4 に増幅産物のクローンを作成、次の反応を設定して BbsI 酵素 pCFD4 プラスミドをダイジェスト: 2-5 μ g の pCFD4 プラスミド、消化バッファー x 10 の 5 μ、1 μ L BbsI 酵素と ddH₂O 50 μ L の最終巻をさせるの。やさしく簡単なスピンによって管の壁から下にすべての散乱の滴を収集管をタップして反応内容をミックスします。2 h の 37 ° C で反応混合物を孵化させなさい。
   4. ステップ 2 やステップ 3 から消化の製品から 1% の agarose のゲルの PCR の製品を実行します。DNA のバンドを完全に分離する十分な時間のための電気泳動を行います。正しいカットは製造元の指示、次ゲル溶出列を使用して予想される製品を浄化する前に UV のトランス照明下での DNA バンドをサイズ (材料の表を参照してください)。PCR の製品は 600 をする必要があります、bp と一直線に並べられた pCFD4 プラスミド ~6.4 kb ⁶をする必要があります。
   5. 製造元の命令ごとの PCR チューブに DNA アセンブリ反応を設定 (材料の表を参照してください)。
   6. アセンブリ製品の 2 μ L を (DH5α または ΔrecA1、ΔendA1と似たような系統) 有能な細菌に変換、アンピシリンのプレート (100 μ g/mL) LB (ポンド/Amp) 寒天を含む、37 ° C で一晩インキュベートします。DNA アセンブリ ミックス可能性があります特定の細菌の系統に有毒であるが、毒性を減少させることができるアセンブリのミックスを希釈することに注意してください。
   7. 一晩培養プレートから 3-4 アンピシリン抵抗性コロニーをピックアップ、3 mL の 100 μ g/mL アンピシリンを含む LB にコロニーを接種して 37 ° C シェーカー内のバクテリアの一晩を接種。製造元の指示に従ってプラスミド ミニ準備キットを使用して一晩培養細菌プラスミドを抽出 (材料の表を参照してください)。
   8. タンデム gRNA 挿入を含む正しいクローン画面に T3 普遍的なプライマーでプラスミドをシーケンスします。細菌、シーケンス確認 pCFD4-gRNA で 20% のグリセロールおよび将来使用するため-80 ° C のフリーザーのストアと変換のグリセロール ストックを確立します。

2. 設計と HDR ドナーを構築

1. 遺伝子ノックアウトのGal4とLexAシーケンスの HDR の二本鎖ドナー相同両腕に挟まれた転写活性化シーケンスを含む設計します。
   1. 使用 > 1.5 kb を離れ、サイト右側相同腕 gRNA ターゲット側面します。拡張ホモロジー腕は、修復プロセス¹⁰中に HDR の効率を高めます。
   2. PCR 増幅注入用に選択された親フライラインから抽出したゲノム DNA (gDNA) から相同性の腕 ((X 染色体) の例えば、nos Cas9 BL # 54591)。校正ホット スタート Taq DNA ポリメラーゼ酵素長い PCR の拡張機能の適切な使用 (材料の表を参照してください)。シーケンスを確認します。
2. エンジニア リングの軌跡に gRNA の再ターゲットを避けるため、gRNA の認識部位が導入された外因性シーケンスによって破壊され、このような方法で代替ドナーをデザインします。
   注: 推定のシス調節配列を変更することを避けるために、常に、コーディングのエクソン領域内 gRNA 認識サイトを選択します。
3. 交換用カセットを生成する、一緒に 4 つのセグメントを結合する DNA の集合戦略を計画する: 5' と 3' の相同性腕、中間外因性転写活性化 dna 塩基配列と一直線に並べられたクローニング ベクター バックボーン (例えばpUC19 またはその他よく使用されるクローニング ベクトル)。DNA アセンブリの製造元のガイドラインに従う (材料の表を参照)、PCR の拡大や各セグメントの組立に適したプライマーを設計します。DdH₂o. を 10 μ M 作業濃度プライマー 100 μ M にプライマーを再懸濁します。すべての PCR 反応に忠実度の高いポリメラーゼを使用します。次のプロトコルに従います。
   1. PCR 増幅Gal4またはLexA式カセット使用可能なベクトルから (例えば、nls-LexA:p65; 理想的なGal4/LexA/QF2発現プラスミドを検出して Addgene など一般的なリソースから取得できる) を使用して、プライマーは、表 1 bに記載されています。
      1. 編集ゲノム遺伝子キメラ mRNA を表現し、このような方法でカセットをデザイン転写活性化 DNA シーケンスの表現に置き換えられるエクソンのオリジナル転写と転写後の規制がすべてを保持するための遺伝子の転写活性化.任意の選択的スプライシングの信号を保持するターゲットのエクソンの 5' と 3' 端を保持します。
      2. 5' をエキソンとキメラ蛋白質への翻訳を防止する転写活性化シーケンスを符号化残留間 T2A 割自己ペプチッド シーケンスを組み込みます。外因性転写活性化シーケンス (図 5) 後翻訳終止コドンを追加します。
   2. PCR 増幅注入用に選択された親フライラインから抽出したゲノム DNA (gDNA) から相同性の腕 ((X 染色体) の例えば、nos Cas9 BL # 54591)、プライマーを使用して表 1 bに記載されています。忠実度の高いポリメラーゼを使用して、システムを次のように使用してすべての PCR の反作用のため: 5 μ L 反応バッファー、10 mM の dNTPs の 0.5 μ、10 μ M の 1.25 の μ L x 5 の前方のプライマー、10 μ M の 1.25 の μ L 逆プライマー、0.25 μ L の忠実度の高い DNA ポリメラーゼ DNA テンプレートの 0.5 μ L、16.25 μ ddH₂o.
   3. PUC19 などクローニング ベクトルを線形補間を使用します。ドナー ベクトルの数が今あります。次のウェブサイト http://flycrispr.molbio.wisc.edu での包括的なリストを参照してください。
   4. 1% アガロースゲルで PCR の製品を実行します。望ましくない無指定バンド (もしあれば) から目的のバンドの明確な分離を確保するのに十分な時間のための電気泳動を行います。予想される DNA 断片をゲル浄化します。分光光度計を使用して各浄化された DNA のフラグメントの濃度を測定します。
   5. 製造元の指示に従って DNA アセンブリ反応を設定します。ステップ 3 から線形補間クローニング ベクトルとターゲット フラグメントをミックスし、ステップ次の反応で 4: 線形の 1 μ L は ddH の 20 μ L に最終的な反作用ボリュームをもたらすクローニング ベクトル (50 ng/μ L)、各ターゲット フラグメントの 2-3 倍の過剰、DNA アセンブリのマスターの組合せ、× 2 の 10 μ L 2o. 加温 50 ° C で 1 時間反応混合物
   6. 100 μ g/mL アンピシリンを含む LB/アンプ ・寒天プレート上にプレートを有能な細菌にアセンブリ製品の 2 μ L に変換します。また、青/白のスクリーニング用プレートに X ギャル + IPTG を追加します。
   7. 一晩培養プレートから 3-4 白コロニーをピックアップ、3 mL の 100 μ g/mL アンピシリンを含む LB にコロニーを接種してシェーカーで一晩 37 ° C で成長します。次の製造元プラスミド ミニ準備キットを使用して一晩培養細菌から抽出プラスミドのマニュアル (材料の表を参照してください)。
   8. 画面 PCR または制限の消化力の肯定的なコロニー。
   9. シーケンスでは、最終的なプラスミッドの HDR ドナー領域を確認します。今後接種-80 ° C で 20% のグリセロールの正しいクローンを変換する細菌の在庫を保存します。

3. 胚の注入、ハエの遺伝学およびゲノム編集のためのスクリーニング

1. 準備高純度エンドトキシン フリー gRNA 発現ベクターとプラスミド maxiprep を使用して HDR ドナー プラスミド キット (材料の表を参照してください)。
2. 共同⁶番 Cas9胚の生殖細胞に gRNA 発現プラスミド (100 ng/μ L) と代替ドナー (500 ng/μ L) を注入します。注: 注入の業者が、同様の研究室でこの手順を実行することができます。
3. 遺伝学とスクリーニング (図 2および図 3) を飛ぶ。
   1. 大人に注入された胚を開発、各単一の G クロス₀はバランサーはえへ飛ぶ。対象となる対立遺伝子を含む染色体の適切なバランサーを選択します。
   2. 麻酔 F1 各 G0 から子孫 CO₂パッドの上を渡るし、顕微鏡下で 10-20 男性をランダムに選択します。個別に渡ったバランサー女性図 3に示すように。
   3. 各クロスから単一の F1 父を拾うに F2 幼虫ハッチと、単一フライ ゲノム DNA の準備のプロトコルを使用して gDNA を抽出します。
      1. GDNA 抽出バッファーを準備: 10 mM Tris Cl pH 8.2、1 mM EDTA、25 mM の NaCl、常温で保存します。プロティナーゼ K 原液 20 mg/mL を準備し、冷凍庫で保存します。
      2. 各フライを 1.5 mL のマイクロ遠心チューブに入れ、チューブにラベルを付けます。-80 ° C のフリーザーで腐ってしまう。
      3. プロティナーゼ K の 200 μ G/ml の最終濃度 gDNA 抽出バッファーの新鮮な作業量を準備します。
         注: この手順には、古いバッファーを使わない。
      4. 液体を塗布することがなくバッファーをつぶしの 50 μ L を含むピペット チップで 10-15 s の各フライをスキッシュします。チューブに残りのバッファーを省略し、よく混ぜます。37 ° c 20-30 分間インキュベートします。
      5. プロテイナーゼ K を不活性化に 1-2 分間、95 ° C の熱ブロックのチューブを入れてください。
      6. 10,000 x gで 5 分間回しなさい。さらに PCR 分析のための 4 ° C で準備を格納します。
4. ネガティブ コントロールとして機能するために、 nos Cas9フライから gDNA を準備するのに同じ方法を使用します。正しい「端を」HDR (図 2図 5) を使用して識別するために 3 ステップ PCR によって基づくスクリーンを実行テンプレート⁵として各 F1 男性の gDNA。次の PCR 反応系における DNA の準備の 1 μ L を使用: 染付、各のプライマー (10 μ M)、DNA テンプレートの 1 μ L と ddH₂o. 7 μ の 1 μ L の PCR マスター ミックス × 2 の 10 μ L
5. 図 5 aに示すように、挿入または交換の存在をプライマー fwd1 と画面に rev1 を使用して PCR を実行します。挿入や交換が 3' 領域を確認する fwd2、rev2 のプライマーを用いた PCR を実行します。「終了の」HDR (表 1) を確認する M13F と rev3 のプライマーを用いて PCR を行います。
6. 確認終了アウト HDR とフライラインを維持し、F2 世代からバランスの取れた株式を確立します。他の染色体に変異を認めない意図を削除するもう一度バランサー ハエ outcross します。
7. 長い PCR の増幅するため確立された株から高品質 gDNA を準備 (> 800-1,000 nt) 忠実度の高い Taq ポリメラーゼと完全にシーケンスを増幅を確認設計されたゲノム領域から得た amplicons。また、原油 gDNA エキス説明使用以前短い増幅する (< 800 nt)、編集されたゲノムをシーケンス検証する PCR の製品を重複します。次のプロトコルを使用して良質ショウジョウバエのゲノム DNA を準備します。
   1. 1.5 mL 遠心チューブに 25 大人のハエについて入れ、少なくとも 1 時間は-80 ° C または-20 ° C のフリーザーで凍結します。
   2. 溶液の 250 μ L を追加 (pH 9.0 トリス塩酸 0.1 M、0.1 M、EDTA SDS 1%)。
   3. マイクロ遠心チューブ用の均質化の乳棒を使用してハエを均質化し、氷のチューブを置きます。
   4. 70 の ° c で 30 分間インキュベートします。
   5. 35 μ L KOAc (5 M) の手ふれとよく混ぜて、追加が、ボルテックスにかけないでください。
   6. 氷上で 30 分間インキュベートします。
   7. 12,000 × gで 15 分で回転します。
   8. 1 mL ピペットで慎重に戻って任意の沈殿物を残して、新しい管に明確な上澄みだけを転送または中間期します。
   9. 上清にイソプロパノールの 150 μ L を追加します。逆解析による優しく混ぜます。
   10. 10,000 x gで 5 分で回転します。
   11. 慎重に上澄みを除去し、管にペレットを残します。
   12. ペレットを 1 mL 70 %etoh。
   13. 12,000 × gで 5 分で回転します。
   14. 上澄みを除去します。空気は、15 〜 20 分のペレットを乾燥させます。以上、ペレットを乾燥しないでください。
   15. DdH₂o. の 100 μ L でペレットを溶解します。
   16. ハイファイ長い増幅に適した DNA ポリメラーゼを使用 (> 800 bp) 完全な編集領域を増幅します。理想的には、ゲノム領域を増幅する挿入されたカセットの外側 2 つのプライマーを取る。ゲルは、PCR の製品を浄化してシーケンスが複数重複するプライマーと製品を確認、前述したようです。
8. 設計されたフライラインの解剖組織/胚から正しい時空間の表現パターンを検証します。
   1. ハイブリッド mRNA 製品 (表 1) の発現を確認する総 RNA からの RT-PCR 法を実行します。
   2. 式を検証する幼虫組織/胚の関心の mRNA 製品の場で交配を実行します。
   3. スクリーンは、シーケンス確認終了アウト線の間で正確な組織特異的時空間発現パターン クロスの編集済みの行がそれぞれにシャワーGFP とシャワー- RFP (のバイナリ式ドライバーの取得LexAドライバー) 線 (ブルーミントンのストック センターから利用可能)、 LexAまたはGal4蛍光顕微鏡下で胚、幼生及び成体組織におけるレポーター遺伝子発現を駆動を観察。

結果

このプロトコルは、ターゲット バイナリ式レポーター システム特定のbnlセル⁵を表現するための生成に使用された正常に。Cis-複雑な時空間bnl式を制御する規制要素 (クレス) が特徴付けされていません。したがって、内因性bnl規制シーケンスの制御の下での時空間表現を成し遂げるためには、 bnlのだけ最初のコーディング エクソンは細菌LexAトランスのシーケンスに置き換えられますように設計されました。ショウジョウバエの最適な表現を提供するために知られている改良されたnls LexA::p65カセットが選ばれました。

交換戦略目的、キメラを生成するnls-LexA:p65-bnl mRNA 転写と転写後の内因性制御の下で。このキメラ mRNA にそ...

ディスカッション

伝統的に、ショウジョウバエエンハンサー トラップは、2 つの異なるメソッドによって生成されました。いずれかのドライバーのランダム挿入が含まれています (例えば。、 Gal4) 転位によってゲノムのシーケンス (e.g。、P 要素の転位)¹ 。また、ゲノム^3,11の異所性サイトに統合される、プラスミドの構成体で推定エンハンサー/プロモーター領域の転写制御の下でドライバーのシーケンスを配置できます。これらのメソッドはショウジョウバエのGal4とLexAエンハンサー トラップの大きなプールを生成、いくつかの制限がある.ゲノムの P 要素仲介されたランダムな挿入が重要なcisの規制活動を妨害・規制シーケンス。ゲノムのランダムの転位によるトランス式は複数の隣接遺伝子のパターンを報告ことがあります。その一方で、遺伝子のシス調節配列の知識はエンハンサー トラップ ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
X-Gal/IPTG	Gentrox (Genesee Scientific)	18-218	クローニング
LB-寒天	BD Difco	BD 244520	クローニング
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	分子生物学
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	分子生物学
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	分子生物学
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molecular Biology
10% SDS	Sigma Aldrich	71736	分子生物学
KOAc	フィッシャー・サイエンティフィック	P1190	分子生物学
EtOH	フィッシャー・サイエンティフィック	04-355-451	分子生物学
GeneJET Miniprep	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	K0503	Miniprep
PureLink HiPure プラスミド マキシペップ・キット	サーモフィッシャー・サイエンティフィ	K210006	マキシプレップ
BbsI	NEB	R0539S	制限酵素
プライマー	IDT-DNA		PCR
pCFD4	Kornberg Lab		gRNA
KAPA HiFi ホットスタート用DNAテンプレートおよびベクター (Kapa Biosystems)	Kapa biosystems	KK2601	PCR
Q5-high fidelity Taq		NEB NEB #M0491	PCR
Gibson Assembly Master Mix	NEB	NEB #E2611	DNAアセンブリ
pBPnlsLexA:p65Uw	LexA増幅用Addgene		DNAテンプレート
プロテイナーゼK	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
Gel elution kit	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-300	Molecular Biology
TRI reagent	Sigma-Aldrich		Molecular Biology
Direct-zol RNA purification kits	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-330	Molecular Biology
OneTaq One-Step RT-PCR Kit	NEB	E5315S	Molecular Biology
lexO-CherryCAAX	Kornberg Lab		Fly line
UAS-CD8:GFP	Kornberg lab		フライライン
btl-Gal4	Kornberg lab		Fly line MKRS
/TB6B	Kornberg lab		Fly line
Confocal Microscope SP5X	Leica		Imaging expression pattern
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
実体顕微鏡	Olympus	SZ-61	fly pushing
マイクロチューブ均質化乳棒	Fisher-Scientific	03-421-217	ゲノムDNA単離
NanoDrop 分光光度計	ThermoFisher Scientific	ND-1000	DNA定量