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方法論記事

慢性リンパ性白血病の新規 NFAT2 ターゲット遺伝子を識別するクロマチン免疫沈降法

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DOI:

10.3791/58270

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2018年12月4日

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1Dept. of Hematology, Oncology and Immunology, University of Tübingen, 2Dept. of Endocrinology, Diabetology, Clinical Pathology and Metabolism, University of Tübingen

この記事について

サマリー

慢性リンパ性白血病 (CLL) は西部の世界で最も一般的な白血病です。NFAT 転写因子は、開発と様々 な細胞タイプにおける活性化の重要なレギュレータです。NFAT2 の新規標的遺伝子を識別するために CLL 細胞のクロマチン免疫沈降 (チップ) の使用のためのプロトコルを紹介します。

要約

慢性リンパ性白血病 (CLL) と悪性 B 細胞のクローンの拡張によって特徴付けられる欧米で最も一般的な白血病を表します。CLL の患者の大半は病気の怠惰なコースだけでなく、白血病細胞アネルギーの表現型を表示し、B 細胞受容体の外部刺激に応答を参照します。我々 は最近、CLL のアネルギーの重要な調節因子である転写因子 NFAT2 を示しています。さまざまな病気における転写因子の役割の解析における主要な課題は、その特定のターゲット遺伝子の id です。これは発病メカニズムと潜在的な治療上の介在の解明にとって重要なのです。クロマチン免疫沈降 (チップ) 蛋白質 DNA の相互作用を示すための古典的な手法は、したがって、哺乳類細胞における転写因子の標的遺伝子を識別するために使用できる、.ここでは、チップは、CLL 細胞における NFAT2 の直接の標的遺伝子としてLCKを識別するために使用されました。DNA と関連するタンパク質架橋ホルムアルデヒドを使用して、その後約 200-500 塩基対 (bp) の DNA 断片に超音波処理によるせん断。NFAT2 に関連付けられた架橋の DNA のフラグメントが、選択的に αNFAT2 抗体を用いた細胞の残骸から沈澱。浄化後関連付けられている DNA のフラグメントは量的なリアルタイム PCR (qRT PCR) によって検出されます。明らか濃縮 DNA シーケンスは、生体内でNFAT2 がターゲットにしているゲノムの領域を表しています。DNA と必要な抗体の選択の適切な剪断がこのメソッドの成功のアプリケーションのため特に重要です。このプロトコルは NFAT2 の標的遺伝子との直接相互作用のデモに最適です。その主要な制限は、そのまま生物における複数の転写因子のターゲット遺伝子を分析大規模な試金でチップを採用するが困難です。

概要

CD5、CD23、CD19 の明確な蓄積を展示表現成熟 B 細胞1、慢性リンパ性白血病 (CLL) は、欧米の成人の最も一般的な白血病を表します。ほとんどの患者は、長年にわたり特定の治療を必要としない怠惰病コースを展示します。対照的に、何人かの患者は、免疫化学療法または他の目標とされた療法2,3で即時の治療的介入を必要とする急速な進行を示します。活性化 T 細胞 (NFAT) の核因子は様々 な発達を制御する転写因子と多数のセル型4,5,6活性化プロセスの家族です。我々 は最近怠惰病7患者の過剰発現と CLL 細胞における NFAT2 の憲法活性化を示した。ここでは、それはアネルギー7と呼ばれる B 細胞受容体刺激に応答していない状態を調節します。NFAT2 リンパ球特定の蛋白質のチロシンのキナーゼ (LCK) プロモーターに結合しを CLL 細胞特定のクロマチン免疫沈降分析におけるLCKの発現を調節することを示す (チップ) を開発、採用します。

チップは8遺伝子発現における転写因子の役割を調査するいくつかのテクニックのひとつです。遺伝子発現はしっかりと演出した非常に複雑な方法でいくつかの規制当局がこのプロセス9,10、11,12かけがえのない参加転写因子。多数種 (例えばの開発と分化)13,14,15、時空のコンテキストにおける遺伝子発現を調節する転写因子が同定されています。 16,17,18。転写因子が関与する複雑な制御機構でのエラーは、がん19,20を含む病理学的プロセスの様々 な可能性があります。したがって、転写因子とそのそれぞれのターゲットの同定は、新しい治療の道21,22を提供しています。チップ、ゲルシフトアッセイ (EMSA)、様々 な DNA プルダウン ・ アッセイ、レポーターの試金8,11,12,のようないくつかの方法がありますこの興味をそそられる分野を調査するには23,24。

特定の転写因子がゲノムの特定の地域と対話することを実証するには、生体内で、チップは理想的な手法25です。このため、DNA と細胞内タンパク質関連は紫外線照射またはホルムアルデヒド (架橋チップ、XChIP) を使用して架橋します。良い DNA とタンパク質の回収いわゆるネイティブ チップ (NChIP)26を取得するこの手順は省略されます。DNA 蛋白質の複合体はその後 200-500 の塩基対 (bp) および興味の転写調節因子に対する特異抗体を用いた細胞の残骸から沈澱の断片に sonication によって毛を刈る。関連付けられている DNA のフラグメントは精製し、PCR、分子クローニングおよび順序によって特徴付けられます。代替技術は、沈澱の DNA を分析するのに (チップ ・ オン ・ チップ) のマイクロ アレイや次世代シーケンス (チップ Seq) を使用します。

チップ ギルモア初と UV を使用時 1984 年に Lis クロスリンク DNA 共有結合する光し体内蛋白質をバインド細菌27。セル換散、細菌 RNA ポリメラーゼの免疫沈降の時に知られていた遺伝子の特定のプローブは体内分布と RNA ポリメラーゼの密度をマップする使用されました。メソッドは、熱ショック蛋白質遺伝子ショウジョウバエ28の真核生物の RNA ポリメラーゼ II の分布を分析する同じ捜査官によってその後使用されました。XChIP アッセイは、・ バーシャフ スキーと最初熱ショック蛋白質遺伝子29,30とヒストン H4 の関連を研究する架橋ホルムアルデヒドを使用した同僚によってさらに洗練されました。NChIP のアプローチは、自然そのままのエピトープによるより良い DNA および蛋白質の回復の利点を運ぶと、したがってより抗体の特異性は、最初 Hebbes と 1988年31同僚によって記述されていた。

DNA 蛋白質の相互作用を分析する他の技術と比較してチップの利点は、実際には、転写因子の実際の相互作用は調査生体内でないプローブすることができます、バッファーまたはゲルによって作成された人工の条件8、11,12を採用しました。次世代シーケンサーとチップを組み合わせて、複数のターゲットを同時に識別できます。

この技術の主要な制限は、そのまま生物25大規模の試金への限られた適用性です。差動遺伝子発現パターンの解析は、低レベルでのみまたは狭い時間帯にそれぞれの蛋白質を表現する場合、チップの技術を使用してやりがいのあることができます。別の可能性のある要因は、チップ11適して適切な抗体の可用性です。

定量的リアルタイム PCR (qRT PCR) による転写因子の標的遺伝子を生体内で識別するためここで示したチップ プロトコルを使用できます。具体的には、目標は、CLL の NFAT2 の新規標的遺伝子を識別するためにだった。チップは、直接細胞 CLL 患者の自然な条件の下で別のターゲット遺伝子のプロモーター領域の NFAT2 結合を示す潜在性のために選ばれました。

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プロトコル

ひと由来の材料とすべての実験は、テュービンゲン大学の倫理委員会によって承認され、本研究のサンプルを貢献したすべての患者から文書によるインフォームド コンセントを得た。

1. 分離および刺激の Jurkat 細胞

注: プロトコルを最適化して、NFAT2 の高レベル表現に知られている Jurkat 細胞ラインを使用します。すべての手順は、層流フードの下で実行されます。

  1. 37 の ° C の水浴中に温暖化によって 10 %fcs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを RPMI 1640 の 50 mL を準備します。
  2. 10 %fcs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン約 2 × 10 の密度に6セル/mL 添加 RPMI 1640 20 mL に CO2を 37 ° C、5% で細胞培養用フラスコ 1 2 d の Jurkat 細胞の培養 (細胞はトリパン ブルーとカウント ブルー染色とノイバウアーは顕微鏡下で商工会議所) 200 x gで 5 分間遠心分離によってそれらを収穫。
  3. ピペットで上澄みを除去し、10 mL の 10% の FCS と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン RPMI 1640 に細胞を再懸濁します。その後、従来トリパン ブルー染色と顕微鏡下でノイバウアー室セルをカウントします。
  4. 手順 1.3 200 x gで 5 分間から細胞を遠心し、吸引により、上清を除去します。その後、ピペッティングにより 10 %fcs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンと転送新しい従来の 5 mL の管に 1 mL を添加した RPMI 1640 年に 2 × 107細胞/ml の密度で細胞を再懸濁します。
  5. 32.4 nM ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) およびイオノマイシン 1 μ M を追加することで、細胞を刺激します。オープン チューブのふた付きの 37 ° C および 5% の CO2で 16 時間細胞をインキュベーションして (汚染を避けるためには、空気を透過する封止フィルムが使用することができます)。

2. 分離と人間の患者からプライマリ CLL 細胞の刺激

注: 患者サンプルに買収され前述7として刺激します。すべての手順は、層流フードの下で実行されます。

  1. 患者から採血し、密度勾配分離を実行して必要な機器を準備: 21 G 針、止血帯、NH4-ヘパリン-血のコレクション注射器 (例えば、S-monovettes)、PBS、密度勾配の中小 x 1 (密度 1.077 g/mL).
  2. 、採血時に注射器に CLL 患者 (約 40 mL の血液患者あたり) からの血を引きます。50 mL の円錐管に血液を転送します。10 mL の PBS でシリンジを洗浄し、プールを (血の容積にチューブの数を調整) 50 mL チューブに血液 PBS サスペンション。
  3. 新鮮な 50 mL の円錐管に密度勾配媒体の 15 mL を準備します。その後、レイヤー密度勾配媒体に慎重に血 PBS サスペンションの 35 mL。この目的のため平らな角度で管を保持し、ゆっくりピペット 50 mL の円錐管の下の壁に血 PBS サスペンション。50 mL の円錐管に血液 PBS 懸濁液のより多くが蓄積、直角まで管の角度を増加します。血液 PBS 懸濁液の量に応じてこの手順を繰り返します。
  4. (ブレーキ)、なし 20 分 560 × gで遠心分離を実行し、末梢血単核球 (PBMCs) を含んだ単核細胞の段階を抽出します。5 mL の血清ピペットと密度勾配分離の白の相間を収集し、新しい 50 mL の円錐管にそれを転送します。
  5. PBS と 360 x gで 5 分間遠心分離 50 mL に細胞懸濁液を入力します。吸引により上清を削除します。275 × gで 5 分間遠心分離でこの手順を繰り返します。その後、50 mL の円錐管に 5-10 mL の PBS で一人の患者の細胞をプールします。
  6. 1.3 で説明したようのセルをカウントします。
    注: 割合 CLL 細胞分離の PBMCs は、セルは、このプロシージャで直接使用する場合は B 細胞の分離が行われるが、例えば、磁気細胞分離 (MAC) 経由で異なります。B 細胞の分離はお勧めですが、CLL の細胞の割合 (フローサイトメトリーによって決まります) リンパ球の合計の 95% を超えている場合は省略できます。血の CLL 患者を固定して、製造元の指示に従って分離します。製造元の指示に従い CD19 FITC と PE CD5 抗体で染色し、細胞をフローサイトメトリーで分析します。1 つの模範的な患者は、図 1CLL の細胞の割合は 89.03% に表示されます。したがって、この患者で実行される B 細胞分離がいます。生理学的な B 細胞の割合はごくわずか (例では 3.72%) です。
  7. 10 %fcs、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、100 mM 非本質的なアミノ酸、1 mM ピルビン酸ナトリウム 50 mM β-メルカプトエタノール 200 x gで 5 分間と予め温めておいた (37 ° C) 添加 RPMI 1640 10 mL で細胞を洗浄し、吸引により、上清を除去します。
  8. 2 x 107セル/ml 10 %fcs、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、100 mM 非本質的なアミノ酸、1 mM ナトリウム ピルビン酸と 50 mM β-メルカプトエタノール (37 ° C) 塗りつぶし細胞懸濁液の 1 mL と 5 mL チューブに RPMI 1640 にセルを調整します。
    注: β-メルカプトエタノールは酸化ストレスに対抗するため用いられます。
  9. 32.4 nM PMA と 1 μ M イオノマイシンを追加することにより細胞を刺激します。オープン チューブのふた付きの 37 ° C および 5% の CO2で 16 時間細胞をインキュベーションして (汚染を避けるためには、空気を透過する封止フィルムが使用することができます)。
    注: ストレスのレベルを減らすために細胞は刺激の 16 時間前にインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% で 1 時間休んだことができます。

3. 固定、セル換散およびクロマチンせん断

注: 患者サンプルと Jurkat 細胞固定は、市販のチップ キット変更7を前述のように製造元の指示に従ってと分離します。固定は、層流フードの下で実行されます。

  1. セルの固定のための 37% ホルムアルデヒド、1.25 M のグリシンの 1 mL と 1.5 mL チューブ、4 ml の 1x PBS の 5 mL チューブ、アイス ボックスの 1 mL と 1.5 mL チューブを準備します。
  2. 1.5 または 2.9 の手順でそれぞれの培養時間の細胞の刺激後スピン 5 分 200 x gで 5 mL チューブ、5 mL チューブで 500 μ L の PBS で細胞を再懸濁します。
  3. 340 μ M ホルムアルデヒド (37% ホルムアルデヒドの 13.5 μ L) をセルに追加します。慎重に上下にピペッティングによる簡単な混合後懸濁液 2.5 分 (Jurkat 細胞) または室温で 5 分 (患者サンプル) を孵化させなさい。
    注: 最適なせん断を保証する初代培養細胞用長期固定時間が必要です。
  4. 固定を停止し、その後すぐに氷と 500 x gで 4 ° C で 5 分間遠心する細胞を入れて別の 5 分間インキュベートする 125 mM グリシン (1.25 M のグリシンの 57 μ L) を追加します。吸引により上清を削除します。
  5. 1 mL の 4 ° C で 5 分間 200 x gで氷冷 PBS で 2 回細胞を洗浄し、吸引により毎回清を除去します。
    注: 固定後、プロトコルを一時停止することができます。固定セルは-80 ° C で保存する必要があります。テストして固定を介して次のプロトコルで使用する意図した抗体のエピトープはマスクされない場合、SDS ページのゲルの電気泳動、ウエスタンブロット解析の追加のサンプルを使用できます。これらの手順は、製造元の指示に従って蛋白質の 100 μ g で実行されます。すべての αNFAT2 抗体が 1: 1000、1:10000 の希釈で GAPDH 抗体の希釈に使用されます。適切と不適切な抗体 Jurkat 細胞から固定サンプルの模範的なイメージを図 2に示します。
  6. 上下にピペットで 5 mL の市販の換散バッファー 1 で細胞ペレットを再懸濁します。シェーカーに氷の上、サンプルを配置し、揺れながら 10 分間インキュベートします。
    注: 換散、前にセルすることができますが崩壊した 10 液体窒素で s。これは Jurkat 細胞のため便利ですが、プライマリ患者サンプルで避けるべきであります。崩壊、5 の 5 mL の管の場所特定のコンテナーに液体窒素の 5-10 mL の s。保護メガネ ・適切な安全手袋を着用します。
  7. その後、4 ° C で 5 分間 500 x gでチューブを遠心分離、ピペットで上澄みを慎重に削除します。
  8. 上下にピペットで 5 mL の市販の換散バッファー 2 のセルを均質化し、振りながら氷で 10 分間インキュベートします。4 ° C で 5 分間 500 x gでチューブを遠心し、ピペットで上澄みを慎重に削除します。
  9. 500 μ L (Jurkat 細胞) の細胞ペレットを再懸濁しますまたはせん断の 140 μ L (患者サンプル) バッファー 1 プロテアーゼ阻害剤を含む 1 (5 μ L または 1.4 μ L、それぞれ) と氷で 10 分間混合物を孵化させなさい。
  10. クロマチンはシャーリング、超音波発生装置のチューブ (空気の泡と繰り返しこの手順に応じてサンプル ボリュームのための生産を避けるため) にステップ 3.9 から細胞懸濁液の 140 μ L を転送します。超音波発生装置 200 500 bp の DNA のフラグメントを取得する 9.375 W の平均入射電力で 7 ° C とせん断 (セル線) 10 分または 7.5 分 (患者サンプル) の温度で焦点を当てた超にチューブを置きます。
  11. 最後に、15700 x g小型遠心分離機で 4 ° C で 10 分間遠心し、新しい 1.5 mL チューブに上清を収集します。
  12. 適切なフラグメントのサイズをテストするため、1.5% TBE agarose のゲルの電気泳動のゲルを介してせん断クロマチンの 20 μ L を分析します。良いと悪い品質の Jurkat 細胞からせん断クロマチンの模範的なイメージを図 3に示します。この時点で、プロトコルは潜在的休止できます。せん断クロマチンは-80 ° C で保存する必要があります。

4. クロマチン免疫沈降

注: 変更7製造元の指示に従って市販チップ キットをクロマチン免疫沈降を行った。

  1. Immunoprecipitations (70 μ L (Jurkat 細胞) またはせん断クロマチン プラス 1 つの抗体の 15 μ L (患者サンプル)) の数を計算し、タンパク質 A コーティング ビーズ 1.5 mL チューブの沈殿物ごとの 20 μ L を準備します。上下にピペッティングによる沈殿物ごとのバッファー内蔵の 1 × 1 の 40 μ L でビーズを洗う、ビーズ 1 分のマグネッ トラックの残りの部分し、ピペットで上澄みを除去できます。合計で 4 回のこの手順を実行します。最終的には、元のボリュームで 1 x チップ バッファー 1 でビーズを再懸濁します。
  2. 自体免疫沈降にバインドされているターゲット シーケンス NFAT2 をキャプチャするのに αNFAT2 抗体 (7A6) 10 μ g を使用します。IgG コントロールとしてウサギ IgG 抗体 (DA1E) の 2.5 μ g を使用します。表 1に示されているように、新鮮な 1.5 mL チューブに反応を準備します。
    注: このプロトコルの固定中にそのエピトープはマスクされません高親和性モノクローナル抗体を使用することが重要です。ポリクローナル抗体は、受信した結果を適切に解釈する著しく難しくバリエーションの追加レベルをご紹介します。
  3. 6 rpm で回転ホイール上の 4 ° C で一晩手順 4.2 からの混合物を孵化させなさい。
  4. 次の日スピン チューブ 5、小型遠心分離機で 7,000 x gで s 1 分の磁気ラックにそれらをインキュベートし、清を吸引により除去します。1、2、3、4 種類の洗浄バッファーの各 1 回、ビーズを連続して洗ってください。
  5. 350 μ L の洗浄バッファーのビードを再停止しなさいし、それら 6 rpm で回転ホイールに 4 ° C で 5 分間インキュベートします。
  6. その後、スピン 5 チューブ小型遠心分離機で 7000 x gで s。磁気ラックで 1 分間置いて、上澄みを除去し、次の洗浄バッファーを追加します。
  7. 最後の洗浄工程後ピペットで上澄みを除去、溶出バッファー 1 の 100 μ L のビーズを取るし、6 rpm で回転ホイール上で 30 分間インキュベートします。
  8. チューブをすぐスピン (5 小型遠心分離機で 7000 x gで s) と 1 分の磁気ラックに置いて。
  9. 上清を新しい 1.5 mL チューブに分注して転送し、溶出バッファー 2 の 4 μ L を追加します。
  10. 99 μ L の溶出バッファー 2 溶出バッファー 1 と 4 μ L の入力コントロールを作成するミックスせん断クロマチンの 1 μ L (この設定では、患者 1 人あたりの 3 つの管: 1 つの入力コントロール、1 つの IgG コントロールおよび 1 つの αNFAT2 サンプル)。
  11. 1.5 mL チューブ シェーカーで 1300 rpm 65 ° C で 4 時間のサンプルをインキュベートします。100% イソプロパノール、渦とスピンの 100 μ L を追加 5 サンプル小型遠心分離機で 7000 x gで s。
  12. 徹底的にボルテックスによって利用可能な磁気ビーズを再懸濁します各サンプルにビーズの 10 μ L を追加し、6 rpm で回転ホイールに室温で 1 時間インキュベートします。
  13. 、孵化後スピン 5 チューブ s 小 7000 x gで遠心し、磁気ラックで 1 分間置いて。吸引により上清を削除します。
  14. 洗浄バッファー 1 の 100 μ L でビーズを再懸濁します。ミックス 6 rpm で回転ホイールに室温で 5 分間インキュベートしてチューブを反転します。
  15. スピン 5 チューブ小型遠心分離機で 7000 x gで s 磁気ラックで 1 分間置いて、ピペットで上澄みを除去。洗浄バッファー 2 と 4.13 4.14 手順を繰り返します。
  16. その後、吸引洗浄バッファーを削除 55 μ L の溶出バッファーのビードを再停止しなさい、沈殿させた DNA を溶出する 6 rpm で回転している車輪に室温で 15 分間インキュベートします。最後に、スピン 5 チューブ小型遠心分離機で 7000 x gで s 磁気ラックで 1 分間配置し、新しい 1.5 mL チューブに上清を移します。
    注: ここでプロトコル可能性があります一時停止できます。溶離された DNA、-20 ° C で保存します。

5. NFAT CLL 細胞標的遺伝子を検出します。

  1. 表 2に示されているようにすべてのサンプルの重複で qRT PCR 反応を行います。
    注: ターゲット遺伝子の検出のため量的なリアルタイム PCR (qRT PCR) が行われる市販 qRT PCR ミックスを用いたリアルタイム PCR 装置。
  2. 反応と RT-PCR の器に白 96 ウェル プレートを使用します。サイクリングの条件は次のとおりです: 95 ° C、30 s、[95 ° C、5 s、30 ° C、60 s] x 40 サイクル。
    メモ: (原液または希釈 1:10、1: 100、1: 1000 ヌクレアーゼ フリー水で) 入力のシリアル希薄化は相対的な強化の計算に使用されます。Jurkat 細胞におけるIL-2は肯定的な制御32として使用されました。CD40L、B 細胞の NFAT2 の既知のターゲットは、CLL33,34NFAT2 の新規標的遺伝子の例として CLL 細胞の研究者が LCK肯定的な制御として使用されました。CD40L、 IL-2 、 LCKのプロモーター領域のためのプライマーは、特定の試薬や機器の表に示します。

6. ノーマライゼーションとデータ分析

注: (IL-2、 CD40LやLCK) プロモーター領域の相対的な強化は、正規化の IgG コントロールを使用して計算されます。

  1. まず、入力シリアル希釈、 IL-2、 CD40L qRT PCR のデータから評価版ソフトウェアを介してLCKプロモーター領域の Ct (しきい値サイクル) 値を決定します。
  2. 入力のシリアル希釈によって濃度の標準曲線を定義します。この標準曲線とIL-2、CD40Lの濃度とすべてのサンプルの重複は、それぞれの研究者が LCKプロモーター領域を計算します。
  3. 次に、重複の平均値を計算します。次に、参照として IgG 免疫沈降サンプルを設定します。1.0 としてこのサンプルの相対的な強化を定義し、この参照 (NFAT2 法) から他のサンプルと比較します。
  4. 最後に、IgG 参照濃度によるサンプルの濃度で割って相対濃縮を計算します。

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結果

図 1は、CD19 FITC と PE CD5 抗体で染色後実行 CLL 患者の模範的な流れフローサイトメトリー解析を示しています。図 1a CLL の患者の血液中の細胞の大半を表す、リンパ球のゲートを示しています。図 1 bは、CD19 の割合を示しています+/CD5+ CLL 細胞は、この例ではリンパ球の 89.03% を表します。CD19 の割合+/CD5- B 細胞はそれぞれ患者の 3.72%。

図 2では、期間ごとに SDS のページおよび西部のしみにより評価した固定 Jurkat 細胞抗体パフォーマンスの例を示します。...

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ディスカッション

成功したチップ試金の実行の重要なステップは、適切な抗体の選択とプロセス25をせん断クロマチンの最適化です。ΑNFAT2 抗体の選択は、このプロトコルの開発時に特に難しいことがわかった。市販のいくつかの αNFAT2 抗体と西部にしみが付くことの罰金これらの作品や他のアプリケーションの大半が、クローン 7A6 だったチップ7正常に使用できる唯一の抗体です。でもおそらく異なった製造業者からの同一 7A6 抗体チップでのパフォーマンスに関して有意差を出展しました。主要な挑戦は XChIP プロトコル25で使用される固定のプロセスによってターゲット蛋白質エピトープの潜在的な混乱です。

プロシージャをせん断クロマチンも XChIP で適切な結果を取得するため重要です。Agarose のゲルの電気泳動によって評価 200 500 bp のフラグメントのサイズは、この NFAT2 チップ議定書7に最適なこと...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、DFG によって支えられた MU 3340/1-1 およびドイツ Krebshilfe 付与 111134 (M.R.M. に授与の両方) を付与します。ありがとうエルケ Malenke 優れたテクニカル サポート)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 X PBSSigma AldrichD8537
1.5 mL チューブシェーカー Themomixer comfortEppendorf5355 000.011同様の機器で代用可能
10X Bolt サンプル還元剤Thermo ScientificB0009
20X Bolt MES SDS Running BufferThermo ScientificB0002
37 % Formaldehyde p.a., ACSRoth4979.1
4X ボルト LDS サンプル緩衝液Thermo ScientificB0007
抗 NFAT2 抗体アレクシス1008505クローン 7A6
抗 NFAT2 抗体細胞シグナル伝達8032Sクローン D15F1
抗 NFAT2 抗体 ChIP グレードAbcamab2796クローン 7A6
大型遠心分離機エッペンドルフ5804R同様の機器で代用可能
CD19-FITCマウス 抗ヒトBDバイオサイエンス 555412クローン HIB19
CD5-PEマウス アンチヒトCD5BDバイオサイエンス555353クローン UCHT2
密度勾配培地 バイオコール(密度1,077 g / ml)メルクL 6115
DNA LoBindチューブ1.5 mLエッペンドルフ22431021
FBSスーペリアMerckS0615
Flow CytometerBD BiosciencesFACSCalibur類似の装置で代用可能
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)Thermo Scientific78440
iBlot 2 Gel Transfer DeviceThermo ScientificIB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular sizeThermo Scientific
IB23001 iDeal ChIp-seq キット HistonesDiagenodeC01010059
Ionomycin カルシウム塩Sigma AldrichI3909
IRDye 680LT ロバ抗ウサギ IgG (H + L)、0.5 mgLI-COR Biosciences926-68023
IRDye 800CW ヤギ抗マウス IgG (H + L)、0.1 mgLI-COR Biosciences925-32210
LI-COR オデッセイ 赤外線イメージングシステムLI-COR BiosciencesB446
LightCycler 480 マルチウェルプレート 96、ホワイトロシュ4729692001異なるリアルタイムPCR装置で他のプレートと交換可能
Lysing Solution OptiLyse BBeckman CoulterIM1400
M220 AFAグレードの水Covaris520101
M220集束超音波装置Covaris500295
磁気ラック、DynaMag-15 マグネットThermo Scientific12301D同様の機器で代用可能
MEM 非必須アミノ酸溶液 100XThermo Scientific11140050
顕微鏡 Axiovert 25Zeiss451200同様の機器
で代用可能microTUBE AFA ファイバー プリスリット スナップキャップ 6x16mmコバリス520045
ノイバウアー改良型計数室Karl Hecht GmbH &           Co KG40442012同様の機器で代用可能
NH4 ヘパリンモノベットSarstedt02.1064
ヌクレアーゼフリー水PromegaP1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-wellThermo ScientificNP0323BOX
Odyssey®ブロッキングバッファー (TBS) 500 mLLI-COR Biosciences927-50000
ペニシリン/ストレプトマイシン 100XメルクA2213
PerfeCTa SYBR グリーン FastMixクォンタム バイオ95072-012
PMAシグマ アルドリッチP1585
プライマー CD40L プロモーター領域フォワードシグマ アルドリッチ5'-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3'
プライマー CD40L プロモーター領域逆シグマ アルドリッチ5'-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3'
プライマー IL-2 プロモーター領域フォワードシグマ アルドリッチ5'-TCCAAAGAGTCATCAGAAGG-3'
プライマー IL-2 プロモーター領域逆シグマ アルドリッチ5'-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3'
プライマー LCK プロモーター領域フォワードシグマ アルドリッチ5'-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3'
プライマー LCK プロモーター領域逆シグマ アルドリッチ5'-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3'
ウサギ mAb IgG XP アイソタイプコントロール細胞シグナル伝達# 3900Sクローン DA1E
リアルタイムPCR装置RocheLightCycler 480同様の機器で代用可能
ローラーミキサーフェニックス機器RS-TR 5
RPMI 1640 ミディアム、グルタMAX サプリメントサーモサイエンティフィック61870010
セーフティ-マルチフライニードル 21GSarstedt851638235
SeeBlue Plus2 染色済みタンパク質標準液Thermo ScientificLC5925
Shaker Duomax 1030Heidolph Instruments543-32205-00類似の機器で代用可能
小型 遠心分離機Thermo ScientificHeraeus Fresco 17類似の機器で代用可能
Pyruvate ナトリウムThermoScientific11360070
ß-メルカプトエタノールThermo Scientific21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X)Cell Signaling#12498
Trypan Blue solutionSigma Aldrich93595-50ML

参考文献

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