蛋白質ベースのゲルを特徴付けるため力クランプ ワイヤ

サマリー

新しい力クランプ ワイヤ技術を使用して、ボイスコイル モーターと力センサーの間の連結台数の少ないタンパク質ハイドロゲル サンプルの機械的性質を調査します。アナログ比例・積分・微分 (PID) システムは、目的のプロトコルを経験の力の '固定' のことができます。

要約

ここでは、力クランプ ワイヤは、蛋白質ベースのゲルの力学的特性を特徴付ける方法をについて説明します。このメソッドでは、アナログの比例・積分・微分 (PID) システムを使用して、線形ボイスコイル モーターと力覚セン繋留円筒蛋白質ベースのゲルのサンプルの制御プロトコルを適用します。操作中には、PID システムは、測定とセット ポイントとの間の違いを最小限に抑えることによって、定義済みプロトコルに従うハイドロゲル サンプルの拡張機能を調整します。蛋白質ベースのゲルにこのユニークなアプローチは、異なるタンパク質濃度で非常に低いボリューム ハイドロゲル サンプル (< 5 μ L) のテザリング可能。 にします。力ランプ プロトコル、どこ、応力は増加し、時間とともに直線的に減少、下でシステムにより、タンパク質と標準的な弾性の測定 (国連) 折り畳みに関連する弾力性とヒステリシス動作の研究、粘弾性パラメーター。定数力、力パルスがステップのような形、弾性応答のため力の変化には、変性と巻き戻り蛋白質ドメインからなる粘弾性応答から分離されて。少量サンプルなど様々 な力学的摂動の適用の多様性により力クランプ ワイヤは一括アプローチを使用して力の下で蛋白質の力学的応答を調査に最適です。

概要

独特な物理的性質を持っていることから離れて蛋白質ベースのゲルは、従って混雑した環境で、タンパク質の研究を有効にする 1 つの '引き' でいくつかの億分子の測定を有効にすることによって力分光法を革命の約束を保持します。皮膚や他の組織に発生したものに似ています。タンパク質ドメインがパートナーとの化学的条件のバインドを強制的に、彼らの生体力学的応答の研究を許可するハイドロゲル内折れ曲がったまま。さらに、ゲル内のタンパク質ドメインの生体力学的応答分子力の分光学の技術を見られる応答に似ています。たとえば、化学変性剤と酸化剤を小さくたたんだ状態、単一のタンパク質ドメイン レベル^1,2,3と巨視的レベル^4、5の両方の安定性^,6,7します。 同様に、浸透圧物質が単一タンパク質^8,9、同じ力の条件^7,10のゲルの粘弾性応答の減少につながるの安定性を高めます。

いくつかのアプローチは蛋白質ベースのゲルを合成するいずれかによって実装されている物理的相互作用^11,12または共有結合性の架橋^4,13を使用しています。共有結合反応固定架橋位置を可能にする、これらのゲルは、機械的又は化学的摂動の除去時に初期状態を回復できます。共有結合性の架橋に成功したアプローチは、イニシエーター (図 1)¹⁴としてルテニウム (II) 塩、酸化剤として過硫酸アンモニウム (AP) を使用して公開されるチロシンのアミノ酸間の共有結合の炭素-炭素結合を形成に依存します。白色光を浴びること、集中の蛋白質の解決はハイドロゲルに変換できます。制御することによって反応開始、タンパク質-APS ミックスはどんなキャスティング フォームに注入できますポリテトラフルオロ エチレン (PFTE) など管 (図 1 bと1 C) を使用できます非常に小規模のソリューション ボリューム¹⁵。さらに、白色光架橋反応を誘発するの使用は蛍光タンパク質の限られた漂白の結果し、蛍光マーカー (図 1) と複合ゲルの定式化をできます。その他タンパク質ハイドロゲル形成方法は、SpyTag SpyCatcher 作用¹⁶、アミン架橋経由グルタルアルデヒド¹³、またはビオチン ストレプトアビジン相互作用¹⁷に基づく架橋を使用します。

動的機械分析 (DMA) は現在広く高分子ヒドロゲル^13,18を研究に使用される手法です。DMA は、生体に一定の力プロトコルを適用できますが、10 kPa と以上 200 μ L¹⁹の大規模なサンプル ボリューム上のヤング係数が必要です。これらの制限によりタンパク質ハイドロゲルは、一般的にこの手法によって調査されるには柔らかすぎます。設計されたコロナ リビング システムを生成が必要なため、ポリマーよりも合成するは難しいと、このような高ボリューム、ベスト^4,15で効率的。さらに、ほとんどの生体組織は 10 kPa より柔らかいです。いくつかのアプローチは、筋肉の弾力性^20,21の研究では特に、生体試料の開発されました。これらの技術は一定外力を適用するフィードバックの下で動作することができますもが非常に短い時間のための力にさらされている (ミクロン) の小径のサンプル用に最適化された (通常より 1 秒)。

蛋白質ベースのゲルを変更したワイヤを用いて正常に調べた。たとえば、ヒドロゲルを鋳造リング形状の拡張^4,22の関数として経験を積んだ力の変化を測定する伸張のワイヤの使用をことができます。蛋白質ベースのゲルのレオロジー特性を研究するための他のアプローチは、せん断応力を制御ワイヤを使用します。これらの技術は低いサンプル ボリュームを達成し、ソフトマテリアルを容認できます。しかし、その原因タンパク質アンフォールディング生体内で、強制的にこれらのメソッドの欠如引きを模倣する能力、ヤング率は、さまざまな仮定や修正²³を必要とする複雑な理論に基づいて計算されます。

中径管重合タンパク質の少量を利用した新しいアプローチを行ってきた最近 < 1 mm。この技術の私達の最初の実装目的のプロトコル¹⁵次ゲルを伸ばした長さクランプ モードで動作していた。この方法で蛋白質作りを体験拡張および力の両方の連続的な変更ドメインを展開、一方データ解釈面倒。最近では、我々 はフィード バック ループが定義済み力プロトコル⁷ (図 2) に少量の蛋白質ゲルを公開できる新しい力クランプ ワイヤ技術を報告しています。アナログ PID システムはコンピューターから送信セット ポイントと力センサーを用いて力を比較し、2 つの入力の差を最小限に抑えるためにボイスコイルを動かすことによってゲル拡張子を調整します。力のこの '固定' 蛋白質ゲルのバイオメカニクスを測定する実験の新しい種類今できます。

力ランプ モードで係留タンパク質ハイドロゲルは、定数の増加と時間の力の減少を経験します。PID は、タンパク質とゲル製剤の種類によって、非線形の方法で拡張子を変更する任意の粘弾性変形を補正します。力のランプの主な利点は、ヤング率と、展開とタンパク質ドメインの巻き戻しのためのエネルギー散逸などの標準的なパラメーターの定量化できます。

定数強制モードで応用力を段階的な方法で変更します。このモードでゲルは伸びると弾性力が増加または減少し、それぞれになると契約、時間依存型変形が続きます。ゲル経験一定力時に行われ、この粘弾性変形はドメインの展開/折りたたみを直結します。簡略化された方法でこの拡張機能は、十億の単一分子トレース一緒に平均化され、すべてを一度に測定はいくつかの等価なものとして見なすことができます。クリープと力と時間の関数として蛋白質ゲルの緩和を検討する定数力プロトコルを使用できます。BSA を用いたタンパク質ゲルのための力の関数として弾性および粘弾性の拡張と適用ひずみ⁷の反動の線形依存関係があることを最近示しました。

ここでは、全体的なハイドロゲルを蛍光簡単に L 蛋白質の混合物 (8 ドメイン²⁴L₈として描かれている) とタンパク質 L eGFP コンストラクト (L eGFP) から作られた複合ゲルを使用して力クランプ レオメータの操作を詳細します。示してください。

プロトコル

1. 試薬液の調製法

1. [トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタンを 20 mM と 150 mM の NaCl、pH 7.4] Tris バッファーを使用して、目的の濃度に興味の蛋白質を溶解/希釈開始タンパク質溶液を準備します。
   注: ヒドロゲルに架橋つながる最小のタンパク質濃度使用されるタンパク質に依存しては通常 > 1 mM。
2. 過硫酸アンモニウム (AP) (1 M) の株式と tris(bipyridine)ruthenium(II) 塩化準備 ([Ru(bpy)₃]^{2 +}) APS を溶解することにより (6.67 mM) ソリューション及び Tris バッファー [Ru(bpy)₃]^{2 +}粉末。

2. タンパク質ベース ハイドロゲル合成

1. 1 mL 注射器に押されたプランジャーで 23 G 針を固定します。
2. かみそりの刃を使用して (で 0.022 の内径と外径の 0.044) 10 cm ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) チューブをカットします。PTFE チューブの一方の端に、針と注射器を接続します。
3. しらん溶液にチューブの 2 番目の端を挿入し、シリンジのプランジャーを取り消しによって管を入力します。30 分程度の管を残します。
4. シランのソリューションを削除し、圧縮空気管を乾燥します。
   注: シラン ソリューションのすべてが乾燥していることと、管内残留物は残っていないことを確認します。
5. APS と [Ru (bpy) 3] タンパク質溶液を混ぜる^{2 +}定体積比を用いた 1.5 mL チューブに [例えば15:1:1 または 15:0.5:0.5 (v: v: v)]。
6. 渦光ソリューション完全に混ぜ合わせます。
7. (例えば、14,000 x g) 任意の気泡をソリューションから削除する最大速度でミックスを遠心します。
8. 光の混合物に処理 PTFE チューブの開放端を挿入し、シリンジのプランジャーを入れ込んでチューブにソリューションを描画します。
9. ロード チューブ加熱することを防ぎ、室温 (図 1 b) で最大 30 分のそこにそれを維持する 100 W 水銀ランプから 〜 10 cm を配置します。
   注: 場合によっては、光を露光時間が退色を抑える、蛍光ゲルのゲル化時間の短縮を聡に 30 がここで使用される低ですることができます。
10. 針からチューブを外し、かみそりの刃を持つハイドロゲル端に近くの管の端をカットします。
11. 鈍化 24 G 針を使用してトリスのソリューション (図 1) に、ハイドロゲルを押し出します。
    注: 鈍い針、ハイドロゲルのサンプルに損害任意のノッチを避けるために使用されます。
12. 押し出し中または気泡によるを形成し欠陥をもつゲルを破棄可能性があります欠陥のゲルを目視で確認します。

3. タンパク質ベース ハイドロゲル添付ファイルとクランプ力レオメータ セットアップ

1. 計測器制御プログラムを開始します。ボイスコイル モーターをオンにします。コイル位置を (例えば、7.5 mm) の範囲の終わりの方の値に設定します。
   注: 最大移動範囲、ヒドロゲルへの可能な拡張を最大限の終わりの方には、ボイスコイルの位置の使用をお勧めします。
2. Zのフックを転置-方向、 xでベンドでそれらを揃える-の方向 (引き座標;図 2 bを参照してください)。X用マイクロ メーターねじの値を記録-方向。
3. 等しい長さの鎖に 2 滅菌縫合糸を切る (2-3 cm である;図 3 aとBを参照してください)。
4. 各鎖に緩いダブルオーバーハンド ノットを結ぶ、力センサー (図 3および3 D) に接続されているフックに 2 ループ。
5. Tris バッファーで実験室を埋めるし、医療ピンセットを使用して塗りつぶされた室にゲルのサンプルを転送します。
6. ボイスコイルを配置、溶液表面に近いセンサー フックを力およびxを使用してすべての方向にフックを配置/y/z-マニピュレーターを配置します。
7. 医療ピンセット、ハング声に接続されているフックに蛋白質ゲルのサンプルの両側コイルし、強制的にセンサー (図 3) を使用します。
8. 医療ピンセットで縫合糸ループの両端を持ち、同時にそれらを引いて 1 縫合音声コイル フック ハイドロゲル サンプル ループを締めます (図 3 D)。
9. ループの繰り返し手順 3.8 は力センサー (図 3 D) に接続します。
   注: は、構造上の損傷およびハイドロゲル サンプルの横の切断を防ぐために縫合糸の極端な締め付けを避けてください。
10. 任意のすべりを防ぐために各フックのベンドに縫合糸のループを締め3.2 でフックのゼロの区別を見つけるに参照としてこれらのベンド ポイント使用。医療はさみ (図 3 D) を使用して縫合の余分な長さをカットします。
11. Zを使用してアタッチされたハイドロゲルを移動- zに沿ってマニピュレーター-実験的ソリューションでゲルを浸す実験室に向かって軸。
12. Y-zマニピュレーターを使用してゲルがない任意の応力下におけるゲル サンプルを合わせます。
13. 力センサーをゼロし、 xを使用して 2 つのフックを独立した-マイクロメータ ゲルを開始力を経験するまでの段階します。Xマイクロ メートルねじ少し引き返すいったんこれが起こる、-方向。
14. ボイスコイル モーターとセンサーの両方のマニピュレーターの位置を記録し、これらの値と 3.2 の手順で測定したものの違いを使用して正確な実験の開始時にテザリング フック間隔を計算します。
15. ~1.5 - 2 mm に余裕の曲線の範囲を設定し、ゲルの余裕期間 (図 4 a) を測定します。
    注: スラック測定ごとに 2 体制 (図 4 a) に合わせて最適なデータ ポイント数、初期ボイス コイル位置近く余裕の政体の開始を維持してください。ゲルの長さはフックとたるみで 2 政体の間の交差点の間の分離を使用してミクロンの解像度で判断できます (また見なさいステップ 5.1) のカーブします。力センサー実験条件の変化のための時間のズレと下にないゲル余裕の曲線の一部はこの可能なドリフトのレポートを強制します。PID ループ (図 4 a差込み) にセット ポイント コマンドを送信するとき、計測器を制御するプログラムはこの違いを自動的に補正します。

4. 蛋白質ベース ハイドロゲル特性定数力測定と制御力ランプを使用して

1. 力ランプ実験
   1. 力ランプ サイクルを実行すると、必要な読み込み速度 (例えば、0.01 mN/秒) に力を高めることによって、反転"V"として開始し、最終的な勢力とプロトコルの期間を入力します。その後、フォールディングとゲルの弾力性を回復するタンパク質のドメインを許可する > 200 s mN (または低力) 0 でゲルを保持します。
   2. トレースを保存します。
2. 定数力実験
   1. 一定の力 (例えば、 1 マンガン) に時間の定義された量の 30 s と増加し、力の低い力 (例えば、0.1 mN) を適用することで定数力プロトコルを実行 (例えば120 s)、続いて同じに戻る力を低焼入> 300 s フォールディングとゲルの弾力性を回復するタンパク質のドメインを許可するため (例えば、0.1 mN) の値。
   2. フィードバックの応答時間を最大化する PID 設定を調整する最初のパルスに続くループ ( 2 D 図を参照してください)。
      注: 硬いゲルおよび力の小さな変化、ループの応答時間は力センサーの電子とコイルの応答時間によって制限されます、5 ms⁷低くすることができます。柔らかいゲルおよび力の大きな変化は、応答時間、(図 2 D) ゲルの弾力性によって決まります。
   3. トレースを保存します。

5. データの解析

1. ゲルの起動時に発生する力 (Δx 4 a を図の挿入)、ゲルの長さLの方程式を使って計算する、計算されるコイル位置とフックの間測定の分離を利用しました。
   L = L₀ + ∆x
   ここでは、 L₀は実験 (ステップ 3.14) の前にマイクロメータねじの位置から測定、フック間の距離です。
   注: 完全な架橋が発生しない低蛋白濃度のゲル、測定長さはトレースするから変更されます。また、時間の長い期間にわたってハイドロゲル中のタンパク質があります老化効果²⁵ゲルの全体的な延長の結果になります。
2. ひずみを取得するゲルの長さ測定の延長を正規化します。
3. 重合用チューブの内径を用いたトランスバーサル表面積測定力を正常化します。

結果

図 1 aは、EGP/L₈ハイドロゲルを合成するために使用光反応のスキームを示しています。図 1 bは、光の前後に PTFE チューブのヒドロゲル混合物を示しています。トリス ソリューション内の押出 L eGFP₈ハイドロゲルを図 1に示します。ハイドロゲルのサンプルには、ノッチなど構造上の欠陥はありません。明らかに目に見える損傷のヒドロゲルを破棄しなければなりません。

組み立てのレンダリングとクランプ力レオメータの分解図は、図 2 aと2 bに掲載されています。図 2は、線形のボ...

ディスカッション

ここで、低ボリューム蛋白質ベースのゲルの力学的応答特性を調査する力クランプ ワイヤ手法について述べる。また、制服の円筒低ボリューム蛋白質ゲルのサンプルを合成するプロトコルが提供されます。フックで任意の力学的変形または蛋白質ベースのゲルのサンプルやゲルの滑りの損傷を引き起こすことがなく各種の弾力性と蛋白質ベースのゲルの種類の結び方を記述するプロトコルについて述べる。線形音声コイルおよび力センサー、アナログ PID システムは力のランプなど一定の力制御プロトコルのアプリケーションを有効にします。最近では、さまざまな実験的ソリューション⁷における BSA ベース ヒドロゲル濃度の異なる架橋の力学的応答特性を研究するこの手法が使用されています。

策定タンパク質ハイドロゲルと作業するときの重要な側面は、測定の再現性です。ゲルには、あまりにも低たんぱく濃度または不完全な架橋が配合されています、永久的なプラスチック変形が延長⁷時に表示されます。これらの変形はだろう粘弾性効果ドメイン展開とゲル内分子再配...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
SI-KG4A 力変換器	ワールド精密機器 (WPI)	SI-KG4A
リニア ボイス コイル モーター	機器 ソリューション	LFA2010
ウシ血清アルブミン	ロッキーマウンテン バイオロジカルズ (RMBIO)	BSA-AAF-1XG / 100 G
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503-1KG
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
過硫酸アンモニウム	Sigma-Aldrich	248614-100G
トリス(ビピリジン)ルテニウム(II)塩化	Sigma-Aldrich	544981-1G
EXPRESS医療用品 6-0 NYLON 縫合糸 12/PK	フィッシャー サイエンティフィ	NC0395626
1mL シリンジのみ、ルアーロック チップ	BD	309628
シラン、シグマコート	シグマ アルドリッチ	SL2-25ML
マイクロボア PTFE チューブ、0.022 インチ ID x 0.042 インチ OD、100 フィート/ロール	コールパーマー	EW-06417-21
皮下注射針、23 ゲージ	ヘルスケア サプライ プロ	305194
Jensen Global JG24-1.5X Red IT ディスペンシング ヒント - 24 ゲージ	KIMCO	JG24-1.5X
USH-103D USHIO 100W ショート アーク水銀ランプ	ALB	USH-103D USHIO
医療用ピンセット
医療用はさみ
オリンパス
カスタムパーツのコンピューターコードとCAD設計は、リクエストに応じて対応する著者に提供することができます。