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方法論記事

抗がん剤抗体抗悪性腫瘍薬による効果の増強: 組み合わせインデックス式を用いた抗体医薬の相乗作用の検出

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DOI:

10.3791/58291

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2019年1月19日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes Angers (CRCINA), Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université d'Angers, Université de Nantes, Nantes, France, 2Service de chirurgie pédiatrique, Centre hospitalier universitaire (CHU) de Nantes, Nantes, France, 3Unité de Formation et Recherche (UFR) des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Université de Nantes, Nantes, France

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、シュー クリームと Talalay 組み合わせインデックス式を使用して抗がん剤抗体と前臨床モデルで抗悪性腫瘍薬の間の相乗作用を評価する方法について説明します。

要約

敵対的なモノクローナル抗体 (mAb) による化学療法剤の増強効果は、がんに対して効果的で安全な治療を設計するための重要な戦略を構成します。ここでは、前臨床段階で合理的な組み合わせを識別するプロトコルを提供します。まず、Talalay ・周1の組み合わせのインデックス式を使用する抗癌剤 mAb と細胞毒性薬物の相乗効果を評価するために細胞に基づく試金を記述します。これは測定の腫瘍細胞と抗体-感受性インデックス (CI) 値の組み合わせを計算するコンピューターが自動的に分析に続いて、MTT アッセイを使用して含まれています。CI の値 < 1 テスト Mab と細胞毒性薬1間の相乗作用を示します。体外の調査結果、体内を裏付ける、さらに異種移植腫瘍モデルの組み合わせ療法の有効性を評価する方法を説明します。このモデルでは、併用療法が腫瘍の成長は、単剤コントロールと比較して有意な拡張生存の結果大幅に遅れます。重要なは、生体内で実験は併用療法は忍容性を明らかにします。このプロトコルには、前臨床モデルで抗癌性の薬剤の組み合わせの有効性評価と臨床試験を評価する合理的な組み合わせの同定ができます。

概要

癌のさまざまな種類の多数の治療に従来のアプローチは、単独療法に基づいていた。場合でも、それは多くの場合使用このメソッドは複合療法2を選ぶことにつながるいくつかの障害に会った。特に、がん細胞が耐性を代替生存メカニズム3患者4の治療の失敗の結果を誘導することによって単一の薬剤と扱われたときになりやすい。また、単独療法、薬、高用量で投与は通常。多くの場合このような状況は我慢でき治療2を停止するために医師を強制的に強力な用量依存性副作用の発生の結果します。これらの理由から、抗癌剤分子の協会は今単独投与することが好ましい。

理想的な薬の組み合わせは、正常細胞に対して毒性を増加することがなく、腫瘍細胞に対する相乗効果で作用するでしょう。相乗効果は、それぞれ個々 の薬剤別に演技の合計よりも大きい治療効果を生成する 2 つ以上の薬剤の相互作用を指します。このような相互作用が臨床治療効果2にあります。治療抵抗性を制限、効果をアップ、また毒性2を減らすことができます。実際には、その副作用を下げる様々 な経路をターゲットに各薬剤の投与量を削減できます。さらに、分子の 1 つはまた癌細胞に対する増感剤として使用できます。感作細胞に関する 2 番目の薬の効果を高めることができるし、少ない用量で使用される5をすることができます。

併用療法は、2 つ以上の化学療法薬および/または6モノクローナル抗体などの生物製剤を含めることができます。これらの Mab の関心とは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害 (ADCC) を含む免疫学的経路を介して腫瘍細胞を殺すことができる細胞の表面抗原を発現する細胞を標的免疫エフェクター細胞の関与7、および補体依存性細胞傷害 (CDC)6。彼らは、を介してアポトーシス8,9,10,11を介した非免疫機構も機能できます。この場合、プログラム細胞死のプロセスの誘導が癌細胞に感光性、彼らの機能を弱める、関連付けられている化学療法薬を低用量でより効果的に。そのため、アポトーシスの mAb が抗がん剤のレジメンを設計するため適しています。

別の数学的モデルは、薬剤の相乗効果の評価に記載されています。それらの 1 つは、組み合わせのインデックス方法1に基づいています。シュー クリーム1によって開発された中央効果原理に基づくです。中央効果方程式は、次のとおり薬剤の投与量と薬の効果を関連付けます。

figure-introduction-1

ここで、 Dは薬物投与です。Dmは中央効果線量;Fa ; 線量によって影響を受ける割合は、します。mは、線量効果プロット1の形状を示す指数です。中央効果用量を使用して、 Dxを阻害するあるいはセルの"x"% を殺す薬剤の投与量を計算します。CI 値が1を次のように、薬の組み合わせの添加剤の効果を評価するために計算されます。

figure-introduction-2

1 の低 CI 値を示し、添加剤の効果の低 CI 値 < 1 の低 CI 値間の相乗効果を示します > 1 拮抗作用1を示します。このメソッドのアプリケーションはさらに相乗効果と全ての用量で対立を決定する CompuSyn、コンピューター プログラムの可用性によって促進されるまたは効果のレベルは自動的にシミュレートされた12。

当社グループ O アセチル GD2 ガングリオシド (OAcGD2) 神経芽細胞腫抗原13 mAb 8B6 特定を開発し、さらにこの mAb がアポトーシス11の属性と細胞死を誘導することができることを示した。MAb 8B6 神経芽細胞腫細胞抗悪性腫瘍剤トポテカン感光性を与えることができるかどうかをテストするため、我々 は周1によって開発された上記の方法を適応しました。まず、mAb 8B6 とトポテカンの実効線量 50 (ED50) 値を決定します。次に、ED50値に基づいて 2 つの化合物の等効力比を持つ神経芽細胞腫細胞は、上記のシミュレーション ソフトを用いた CI 値を決定する公開されます。このメソッドは mAb 8B6 とトポテカンの併用体外間の相乗作用を実証することができます。次に、さらに効力とこの組み合わせ療法生体内での安全性を評価するためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、前臨床試験において強力かつ安全な抗がん剤 mAb との化学療法のエージェントの組み合わせを選択する簡単に適用できます。本研究の概略は、図 1で提供しています。

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プロトコル

動物飼育・実験の手順は、(契約 #C44 278 ・ #APAFIS 03479.01) は、フランス政府によって承認されました。動物のケアと手順が #2013-118 科学的目的に使用される動物の保護に関する指令 EU 2010/63/EU とフランス法の下で実施されました。

1. mAb 8B6 薬物相互作用間とトポテカンの併用体外の評価

  1. 96 ウェル サンプル準備
    注意: 機関の健康と安全委員会に相談し、実験室の安全に関連するローカル規制ルールに従います。メディアや細胞、試薬の使用前に素材・安全データ シートの情報を確認します。適切な無菌技術を使用し、層流フードの仕事します。セルの操作に使用されるすべてのソリューション/機器は滅菌である必要があります。
    注: 次のプロトコルは付着性のセルで使用するために設計されました。非粘着性細胞懸濁液; 成長にメソッドを適用するために必要な変更このプロトコルは、実験条件ごとに 4 連を使用します。
    1. T75 フラスコの IMR5 セルを育てます。
    2. 最初の日 (0 日目)、細胞密度を確認する顕微鏡下で細胞培養を観察します。フラスコから細胞の培地を吸引、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 5 mL で洗い、0.05% エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 3 mL を追加/PBS ソリューション。フラスコを (37 ° C、5% CO2) 3 分のためのインキュベーターに戻ります。
    3. 細胞の剥離を顕微鏡下で細胞培養を調べます。
      注意: 必要な場合は、腫瘍細胞の種類に応じて、追加の 3 〜 5 分のためのインキュベーターにフラスコを返します。
    4. フラスコに完全な細胞培地 10 mL を追加し、細胞懸濁液を滅菌 15 mL の円錐管に転送します。300 × gで 5 分間細胞を遠心します。診断を使用してセルをカウントします。
    5. 削除し、上澄みを廃棄します。完全培地に細胞ペレットを再懸濁します。最終濃度が 1 × 105セル/mL の中のボリュームを調整します。
    6. 細胞懸濁液を 100 μ l 添加である各、10 の4セルと 96 ウェル培養プレートの種子 84 井戸。図 2に示す実験的レイアウトに従います。
    7. セルのインキュベーター (37 ° C、5% CO2) で 18 h のセルを孵化させなさい。
  2. 薬剤調製した溶液
    注意: 薬/mAb 鋭敏化研究、タイミング、長さ、および特定の薬/mAb の問題に合わせて集中治療を変更します。初期濃度が最終濃度 x 3 であることに注意してください。
    1. (1 日目)、次の朝は、完全な成長媒体を使用して次の薬液を準備します。
      1. モノクローナル抗体調製した溶液
        1. MAb 濃度 240 μ g/mL の抗体作業ソリューションを取得する完全な成長媒体を 500 μ l 添加の mAb を希釈します。
        2. 図 2に示すように 5 つの 2 倍のシリアル希薄を実行します。
      2. トポテカンに調製した溶液
        1. 120 の最終濃度と薬物実用的なソリューションを取得する完全な成長媒体を 500 μ l 添加の薬上記として希薄 nM。
        2. 図 2に示すように 5 つの 2 倍のシリアル希薄を実行します。
      3. 抗体と薬物に調製した溶液
        1. 120 nM 薬と 240 μ g/mL mAb (作業ソリューション) で解を得るための完全な成長媒体を 500 μ l 添加薬物と mAb のソリューションを希釈します。
        2. 図 2に示すように 5 つの 2 倍のシリアル希薄を実行します。
    2. 最終濃度に到着、実験的レイアウト (図 2) に示すように対応する井戸に各薬液の 50 μ L を転送します。
      メモ: は、図 2に示すように未処理細胞井戸に完全な成長媒体の 50 μ L を転送します。
    3. インキュベーター (37 ° C、5% CO2) で 72 時間細胞を孵化させなさい。
  3. MTT の試金
    1. 各ウェルに MTT 試薬溶液 10 μ L を追加します。
    2. 4 h の 37 ° C で孵化させなさい。
    3. マルチ チャンネル ピペットを使用してを各ウェルに溶解液 (0.01 M 塩酸 10 %sds) の 100 μ L を加え、ピペッティングで徹底的に混ぜます。
    4. 加湿チャンバー (湿度 95%) で 4 h の 37 ° C で孵化させなさい。
    5. 570 で吸光度を読み取り (570) nm と 620 nm の吸光度 (620)。
      注: は; 吸光度を読む前にピペットで各サンプルを再び混ぜる吸光度 620 nm 非特異的なバック グラウンド値の補正を可能にします。
    6. 補正吸光度を計算: 吸光度を補正、570-620を =。
    7. 細胞生存率を次のように計算: 細胞生存率 = 100 × (平均補正吸光度/平均補正吸光度を制御)。
    8. 次の方程式を使用して分数影響値 (Fa) を計算: 1 - (平均補正吸光度/平均補正吸光度を制御)。
  4. 単一の薬物相互作用解析シミュレーション ソフトウェアと薬の併用試験
    1. スタート ウィンドウを開くシミュレーション ソフトウェアを実行します。
    2. 新しいテスト] ボタンをクリックして、メインウィンドウを開きますをクリックします。
    3. 名ウィンドウで、実験の名前を入力します。
      注:日付窓の日付を追加できます。
    4. 新しい単一の薬剤のボタンをクリックします。
    5. 完全名] ウィンドウで、名前を入力します。
    6. 略語展開ウィンドウで省略形を入力します。
    7. 「ユニット」ウィンドウに薬物濃度単位を入力します。
    8. Enterキーを押すデータ ポイント 1 用量とFa の値を入力します。
    9. すべてのデータ ポイントを入力するまでこの手順を繰り返します。
    10. [完了] ボタンをクリックします。
    11. MAb データ点を入力に同じ手順に従います。
      注: は、薬剤によって使用されるものと同じ濃度の単位を使用します。
    12. 新しい薬コンボボタンをクリックします。
    13. 薬モノクローナル抗体を選択します。
    14. 一定の比を選択し、 [ok]をクリックします。
    15. 完全名] ウィンドウで、名前を入力します。
    16. 略語展開ウィンドウで省略形を入力します。
    17. 比ウィンドウに薬/mAb の比率を入力します。
    18. データ ポイント 1 用量を入力し、 Enterキーを押します。
      メモ: プログラムは自動的に mAb とコンボの用量を計算します。
    19. データ ポイント 1 Faの値を入力し、 Enterキーを押します。
    20. すべてのデータ ポイントを入力するまでこの手順を繰り返します。
    21. [完了] ボタンをクリックし、レポートの生成] ボタンをクリックします。
    22. 薬、モノクローナル抗体を選択し、 [ok]をクリックします。
    23. コンボを選択し、 [ok]をクリックします。
    24. ヘッダー、 CI テーブル、およびサマリー テーブルを選択します。[Ok]をクリックします。
    25. 分析ファイルのファイル名を入力し、保存をレポートを生成する] をクリックします。
      注: [ok]をクリックすると、コンピューターの既定の web ブラウザーでは自動的にレポートが開きます。
    26. レポートを印刷するには、web ブラウザーのファイルメニューから印刷を選択します。レポートには、ED50、エドの組み合わせごとに単独または組み合わせと CI テーブルを使用いずれかのエージェントのタイトル、日付、ファイル名、説明、パラメーター (m、Dm、および r)、ED50を含む概要テーブル セクションが含まれます。75、ED90、および ED95。
      注: の CI 値 < 1 相乗作用の低 CI 値を示します = 1 を示し、加法の CI 値 > 1 拮抗作用を示します。

2. 非肥満の糖尿病性 NOD Scid ガンマ マウス (NSG マウス) のひと神経芽腫を異種移植片の生成

注: 細胞培養の汚染を除外します。基底膜マトリックスは、5 ° C の上のゲルを形成するのですべてのカルチャウェアや基底膜マトリックス試薬と接触しているメディアは、prechilled/氷冷をする必要があります。全体の過程で氷の上基底膜マトリックスを維持します。

  1. IMR5 細胞懸濁液の調製
    1. 基底膜マトリックス試薬を使用する前に 4 ° C の冷蔵庫の氷にバイアルを水没で一晩解凍します。
    2. 0 日上記のとおり培養 IMR5 セルを収穫します。
    3. セルを転送すると、15 mL の円錐管と 300 x gで 5 分間遠心します。
    4. 上清を捨てます。2 セルを洗浄して、氷冷 PBS の 15 ml x 5 x 107セル/mL の氷冷 PBS での細胞懸濁液を準備。
      注: 必要な場合は、1.5 mL 遠心チューブに細胞懸濁液を転送します。
    5. 基底膜マトリックス バイアルを旋回します。
      注意: 基底膜マトリックス試薬が解凍し、分散します。
    6. 基底膜マトリックスの試薬の 1 つのボリュームを追加し、107セル/mL x 2.5 の細胞懸濁液を取得するピペッティングで混ぜます。
    7. 氷の上細胞懸濁液を保ちます。
  2. マウスの作製
    注: マウスは 6 ~ 7 週齢をする必要があります。
    1. 特定の病原体フリーの状態の下でマウスを維持します。
    2. マウスが到着した後、3 ~ 5 日間順化期間を許可します。
    3. 接種の日にフランクを剃る注射をされる手順 2.3.6 を行われます (を参照)。
  3. 腫瘍細胞の注入の準備
    注: は、プロシージャ全体で無菌冷たい基底膜マトリックス細胞懸濁液を保つため。
    1. セルをミックスし、慎重に 21 G 針搭載 1 mL 注射器に細胞懸濁液を描画します。
    2. シリンジ内に気泡がないことを確認します。
    3. 消毒液とマウスの接種領域を消毒します。
    4. 注射部位での指の間の側面にマウスの皮膚を軽く絞る。
    5. 皮膚のひだと正確に針を挿入します。針を置か皮下注射をように組織に深く。
    6. マウスの下の右のフランク IMR5 細胞懸濁液 (すなわち、10 の6セル × 2.5) の 100 μ L を皮下注入します。
    7. 漏れを防止し、針を撤回する注射器を回転させます。
  4. 体重変化と腫瘍成長の監視
    1. 長さ (A) と (B) とキャリパー腫瘍の幅を測定します。
    2. 式 (A × B2) × 0.5 を使用して腫瘍体積を計算します。
    3. 腫瘍が 50 〜 60 mm3の平均量に達したときは、治療を開始します。

3. 医薬品、抗体投与マウス

  1. MAb 8B6 の静脈内投与
    1. MAb ソリューションに 25 G 針を搭載した 1 mL 注射器を慎重にご記入ください。
    2. 尾静脈を拡張する 10 分間の熱ランプの下でマウスを置きます。
    3. 齧歯動物落でマウスを抑制します。
    4. 消毒液とマウスの接種領域を消毒します。
    5. 尾静脈内腔針顔上向きの傾斜面 (図 3 a) を維持しながら貫通の 2-4 mm に平行の針を挿入します。
    6. 抗体溶液を 100 μ l 添加を静脈注射 (静注)。
    7. 注入が終了したら、軽く出血を防ぐために注入部位を圧力します。
  2. トポテカンの腹腔内投与
    1. 25 G 針を搭載した 1 mL の注射器に薬液を描画します。
    2. その後端の小高い臥位の位置で、マウスを保持します。
    3. 消毒液とマウスの接種領域を消毒します。
    4. マウスの腹部正中線を探し、精神的の象限に腹部を分割します。右または左下腹部 (図 3 b) に注射部位を探します。
    5. 右または左下腹部に、~ 10 ° の角度で腹部 (5 mm) に針を挿入します。
    6. 100 μ L の薬液を腹腔内注入 (i. p.)。
    7. 注射部位を消毒します。

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結果

代表的な結果や数字14以前出版された仕事からの許可と適応されます。

抗 OAcGD2 モノクローナル抗体 8B6 相乗的神経芽細胞腫細胞ライン増殖に対するトポテカンの抑制効果を高めます。

薬とトポテカンと mAb 8B6 ・薬・ MTT アッセイを用いた神経芽細胞腫を最初に測定した人間の IMR5 の抗体依存性間の相乗作用を評価するために使用する抗体濃度を確立。MAb 8B6 やトポテカン 72 時間だけへの暴露は、IMR5 セル実行可能性 (図 4 a)、濃度依存的な抑制で起因しました。用量反応曲線は、各化合物の50値 ED の計算を許可しました。このため、解析シミュレ...

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ディスカッション

薬物相互作用の効果を予測する 3 つの方法を使用できます: isobologram 方法論17、非線形混合モデル18、および組み合わせインデックス1。インデックス分析の組み合わせは、ユーザーフレンドリーなコンピューター プログラムの可用性でそのアプリケーションを簡略化するために最もよく使用されます。この目的のため我々 は最初 MTT の試金19を実行することによって単独で、または組み合わせてを使用した各エージェントの量影響応答を特徴付けられます。この方法論は、570 nm19の吸光度の最大値を持つ紫色の塩製品でテトラゾリウム塩を減らすために実行可能なセルの能力に依存します。死では、セルは、MTT を塩に変換する能力を失います。したがって、色の塩製品の数量は文化19で実行可能なセルの数に比例です。確かに、測定セル増殖19...

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開示事項

S.Fa、j. f. と s ちゃんは、保留中の抗-O-アセチル-GD2 抗体医薬の臨床応用をカバーする特許の発明者として指定されます。

謝辞

サポートを付与: 財団・ デ ・挙デ L 'ユニヴェルシテ ・ ド ・ ナント、レ Bagouz' à La Ligue contre le がん comité マノン ・ ド ・ ロワール = アトランティック県、comité デュ モルビアンと comité ・ ド ・ ヴァンデの宇根バラを注ぐ S.A.R.A.H、エトワール ・ ド ・ マーティンとソシエテ ・ フランセーズ ・ デ ・ ルッテ contre レ ラ癌エ レ leucémies デ ランファン et ・ デ ・ L'adolescent (SFCE)。および j. f. は、La Ligue Contre Le がんによってサポートされます。著者は、構造 Fédérative ・ フランスのフランソワ ・ Bonamy の UTE 施設をありがとうございます。著者は、IMR5 セルを提供するための博士 s. Suzin (Inserm、パリ) とさん h. Estéphan を彼女のテクニカル サポートにもありがとうございます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Cell Proliferation kit (MTT)Roche11-465-007-001
CompuSyn softwareComboSynCombosyn は、http://www.combosyn.com
電気シェーバーBiosebBIO-1556
Fetal calf serumEurobioCVFSVFF00-01RPMI 1640 Firefox の 10% 熱不活性化子牛胎児血清
で無料でダウンロードできます。Mozilla CorporationFirefoxは、http://www.mozilla.org/en-US/firefox/
Heat lampVerre&から無料でダウンロードできます。クォーツ4003/1R
の人間の神経芽細胞腫IMR-5の細胞株Accegen BiotechnologyABC-TC0450IMR-5は5459762の人間の神経芽腫の細胞株IMR32のクローンである。IMR-5細胞は、Santos Susin博士(U.872、パリ、フランス)L
-グルタミンGibco25030-0242 mM in RPMI 1640
Lysis溶液 ロシュ 11-465-007-001
mAb 8B6ナント大学N/A
マトリゲルコーニング354248
ムルティカン FCサーモフィッシャー サイエンティフィック N08625
針21G 1½ BD Microlance304432
Needle 25G 1TerumoNN-2525R
NSG マウスCharles River Laboratories5557
Nunc MicroWell 96-well microplatesThermofisher167008
PBSVWRL182-10
PBS, 0,05% EDTASigma-AldrichE9884
PC を実行するWindows 7MicrosoftWindows 7は、http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7 ペ
ニシリン-ストレプトマイシンGibco15140-122100ユニット/ mLペニシリン、100 mg / mLストレプトマイシン、RPMI、1640
リザーバー、Thermofischer Scientific8094
、げっ歯類、抑制剤BiosebTV-150-SM
RPMIで購入できます。1640Gibco31870-025
シリンジ 1 mLHenke Sass Wolf5010.200V0
トポテカンSigma-AldrichT2705
、、試薬、、

参考文献

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抗がん剤抗体抗悪性腫瘍薬による効果の増強: 組み合わせインデックス式を用いた抗体医薬の相乗作用の検出
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