方法論記事

生体の屈折率-屈折率整合素子の作製

DOI：

10.3791/58296

⸱

2018年9月10日

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of Utah, 2Huntsman Cancer Institute, University of Utah

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、マイクロ構造と水溶液間不一致の屈折によるマイクロ流路内でしばしば起こるアーティファクトを除去するために MY133 V2000 からマイクロ流体デバイスの作製について説明します。このプロトコルは、化学的、機械的に密着性を高める、カプセル化されたデバイスを圧縮するのにアクリル ホルダーを使用します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マイクロ流体デバイスの使用は、生体用定義ツールとして浮上しています。現代顕微鏡技術と組み合わせると、これらのデバイスが同時に相補的な測定することができる堅牢なプラットフォームの一部として実装できます。これらの 2 つの手法の組み合わせによって作成された主な課題は、マイクロ流体デバイスを作るための伝統的材料と生体臨床医学で通常使用される水溶液の屈折で不一致です。この不一致は、チャネルやデバイスの端に近い光の成果物を作成できます。1 つのソリューションは、屈折率を水のような MY133 V2000 などフッ素系高分子を用いたデバイスを作製するために使用材料の屈折を減らすこと (n = 1.33)。MY133 V2000 ソフト ・ リソグラフィー技術を使用して作ったマイクロ流体デバイスの構築の実証で、アクリル ホルダーと組み合わせて MY133 V2000 作製したデバイスとの密着性を高めるため O2プラズマを用いた、ポリジメチルシロキサン (PDMS) 基板。デバイスが満ちている典型的なイメージング実験の過程で細胞培養条件を維持するために、デバイスの能力を発揮する 24 h のための細胞培養媒体それを孵化によってテストされます。最後に、定量位相顕微鏡 (QPM) を使用して、大量のマイクロ ライブ付着性のセル内の分布の測定します。このように、PDMS など伝統的な柔らかい材料の代わりに MY133 V2000 など低屈折率のポリマーからデバイスの加工によりより高い精度を発揮します。全体的に、マイクロ流体デバイスを製造するためのこの方法は、光の成果物を減らすし、測定精度を高めるために既存のソフト ・ リソグラフィーのワークフローに容易に統合できます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マイクロ流体技術の開発は、微視的スケール流れ1,2のユニークな物理を活用した新たな医療技術の広い範囲を可能にしました。これは、セル剛性3、表面マーカー4成長5など、臨床的に関連するバイオ マーカーを定量化するマイクロ流体プラットフォーム上に構築された診断技術が含まれています。単一のセルを操作することによっては、たとえば悪性腫瘍6の指標としてバイオ マーカーの不均一性を測定するマイクロ流体デバイスを使用できます。顕微鏡を用いたマイクロ流体アプリケーションを結合する能力が複数バイオ マーカーを同時に測定する装置のことでこれらのプラットフォームの有用性をさらに増加している7。

QPM は、光を通過し、透明なサンプルの内部物質と相互作用と位相シフトを測定する顕微鏡技術です。個々 の細胞の塊は、屈折のバイオマス密度8,9知られている関係を用いた QPM 測定から計算できます。前作は、QPM はセル成長10,11と細胞力学特性を介して障害強度12の臨床的に関連するパラメーターを測定できることを示しています。マイクロ流体システムと組み合わせた場合、QPM 可能性がある生体外で高度に制御された環境の細胞挙動を測定する使用できます。マイクロ流体と QPM を組み合わせることに直面している主な課題の 1 つはソフト ・ リソグラフィーによるマイクロ チャンネル13を構築に使用されるほとんどのポリマーの高屈折です。

様々 な顕微鏡技術とマイクロ流体の組み合わせに直面している重要な課題は、水14,15の屈折を基準にしてデバイス材料の屈折の不一致です。これに対処する 1 つの方法は、サイトップ16や MY133 V200013など低屈折ポリマーを使用しています。後者はフッ素系紫外線 (UV)-水に似た屈折硬化型アクリル系ポリマー (n = 1.33) 多くの確立されたマイクロへのスムーズな統合を可能にするソフト ・ リソグラフィー技術と互換性のあります。デバイス作製のワークフロー。これは、マイクロ流体デバイス作製、適していないだけ MY133 V2000 になりますが、QPM、植民地と単一セルのスケール両方の細胞の変化を測定する顕微鏡の他のアプローチと組み合わせて容易にすることができます。MY133 V2000 は、位相アンラッピング光通過水 MY133 インターフェイスとして、ほとんどの位相シフトを生産することによってのための成果物を排除します。

屈折のミスマッチをなくす、フッ素系ポリマー、MY133-V2000 などから作製したデバイスに関連付けられている 1 つの主要な挑戦はガラスや PDMS など他の材料に低粘着力。現在の仕事は、ソフト ・ リソグラフィーを用いた MY133 V2000 マイクロ流体デバイスの作製を示します。O2プラズマ チャネルの PDMS 表面を治療するためにカスタム作製のアクリル ホルダーと組み合わせて基板により、封印されたチャネルを作成する、基板にデバイスが準拠しています。このデバイスは、細胞培養と細胞診断の臨床的意義があるどちらの生きているセルの成長と細胞内輸送細胞バイオマスの測定の重要なアプリケーションがチャネルの質量を測定する QPM に適して医療および創薬探索。

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プロトコル

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1. ポリジメチルシロキサン負の作製

  1. ポリジメチルシロキサンの準備
    1. PDMS シリコーン ・ エラストマーの加硫試薬の 1.8 g 18 g を測定します。エラストマーを含む測定ボートに硬化剤を注ぐ。
    2. エラストマーと 1 分は積極的に硬化剤を混ぜるし、30 分の真空チャンバー内に混合物を置きます。
    3. 真空から、PDMS を削除、クッキー カッターを使用して負に 15 g を注ぐ (半径 = 3.8 cm) 側には、逃げるから、PDMS を維持し、残りの PDMS の混合物をカバーします。
    4. 真空チャンバー内で 10 分間、PDMS を含む金型を置きます。
    5. 真空チャンバーから PDMS を含む金型を削除、治すために、アルミ箔でカバーし 60 分 150 ° C に設定ホット プレートの上に置きます。
    6. 注ぐ逆ガラス シャーレ (直径 10 cm) に残りの PDMS は、鋳型として別のクッキー カッターを使用して、PDMS のパッドを作成します。PDMS 負が完全に硬化するまで、真空チャンバ内に置きます。
    7. 60 分 150 ° C で治すため予熱したホット プレートに真空から、PDMS にペトリ皿を転送します。
  2. ポリジメチルシロキサンのプラズマ表面処理
    1. 負から、PDMS を慎重に取り外します、PDMS とクッキー カッターの下に鋭いかみそりの刃を挿入します。
    2. PDMS; の大きな部分から負をカットする鋭い趣味はナイフを使用してください。それは、負を妨げることがなくその上に PDMS の別の部分を添付するには、十分なバッファー領域をカットする必要があります。
    3. シャーレから、PDMS を慎重に取り外します負の硬化 PDMS の下に鋭いかみそりの刃を挿入します。
    4. 負の部分と同じサイズは、パッドから PDMS の部分をカットする趣味のナイフに使用します。その後、負の上に配置されるとき、マイクロ周り収まるように十分な部屋を PDMS の新しい作品から長方形をカットします。
    5. (ガラス、石英、ポリスチレン、または他の材料から作られたスライド) など平らな基板上に PDMS (負と四角形) の両方の部分を入れて、クリーナー高周波 (RF) に挿入します。ドアを閉めるし、真空ポンプを使用して空気を排気によって商工会議所のシールします。デジタル真空圧コント ローラーを使用して 400 mTorr の圧力まで空気を注入します。
      注: プラズマ洗浄に使用される基板はプラズマ クリーナー使用されていない場合に、入れてプラズマ クリーナー自体が 60 秒前のアクリル ベース層が基板に付着することを防ぐために、負の治療に。
    6. 高、高周波設定を切り、ピンク空気プラズマが表示ウィンドウに表示されます。プラズマ治療 30 枚 PDMS の s、RF 設定の電源を切ります。商工会議所の内容に影響を与えるからの乱流の空気の流れを防ぐために商工会議所をゆっくりと再入力する空気ができるように。
    7. クリーナー プラズマから、PDMS を削除し、ベンチの上に置きます。その後、慎重に負にわたって PDMS 四角形を反転し、鉗子のペアとそれを押し下げます。お互いに準拠する PDMS の 2 つの部分を許可する 10 分間休ませます。
  3. Fluorosilane 負のポリジメチルシロキサンの表面処理
    1. 小さな (1 H, 1 H, 2 H, 2 H ペルフルオロ オクチル) トリクロロ シラン (PFOTS) のドロップ 2 を配置するスポイト使用ボートの重量を量るし、ガラスの真空チャンバーに挿入します。
    2. (つまりマイクロ負が上向き) アルミ箔の部分に PDMS を反転し、ガラスの真空槽にそれを置きます。その後、24 時間の継続的に商工会議所を避難させます。

2. MY133 マイクロ チャネルの作製

  1. MY133 V2000 マイクロ構造を形成
    1. MY133 V2000 の 400 μ L で PDMS の負の値を入力します。
      注: 否定的な必要がありますがいっぱいわずかです。
    2. 任意の気泡を削除する 2 h の真空チャンバーに負の MY133 V2000 いっぱい PDMS を配置します。
    3. 真空から MY133 V2000 を外し、ゆっくりと、少しあふれ負 MY133 V2000 の平らな面を作成し、重合を阻害する酸素を防ぐのトップに対してガラス スライドを押してください。
      注: PDMS、チャネル表面でが部分的に抑制、重合後の段階で接着を可能にします。スライド ガラスは石英、硬化のデバイスの任意の黄変を防ぐことができますと比較してわずかに減少 UV 透過性 (35%)。
    4. 400 W の UV オーブンに MY133 V2000 を挿入し、紫外線を 300 の最大強度の 50% に設定 MY133 V2000 マイクロを治すため s。
      注: デバイスを治すために使用ピーク波長は約 375 nm バンド幅約 25 nm。電源の約 4,500 mJ/cm2は、電源メーカーの推奨を硬化最低 2 倍よりわずかに多くであるマイクロを治すために使用だった。
  2. アクリル ホルダーを構築
    1. ベクター ドローイング ソフトを使用してアクリル ベース層を描画します。ベース層は、長いと 25 mm 幅 25 mm x 11 mm 中心の四角形と四角形は、厚さ 1.5 mm 75 mm であることを確認します。
    2. ベクター描画ソフトウェアを使用してアクリルの中間層を描画します。中間層は中央広場 (5 mm × 5 mm) と四角形 (厚さ 1.5 mm、幅 75 mm 長く、25 mm) と 15 mm で区切られた 2 つ円 (直径 3 mm の両方) を確認します。
    3. ベクター描画ソフトウェアを使用してアクリルの最上位のレイヤーを描画します。最上位層は中心の正方形 (5 mm × 5 mm) で四角形 (厚さ 3 mm、幅 30 mm 長く、25 mm) と 15 mm で区切られた 2 つ円 (直径 3 mm の両方) を確認します。
    4. レーザー カッターでベクター ドローイング ソフトで作成したデバイス設計をカットします。100% のパワーと 30% の速度の設定の例を使用します。2 回アクリルが向いていることを確認するプログラムを実行します。
    5. サイズ M5 0.80 mm タッピング ツールを使用してアクリル トップ層の穴をタップします。
    6. 残留マークや火傷を削除するアセトン入りのアクリルを拭いてください。
  3. アクリル ホルダー MY133 V2000 の接合
    1. アクリルのベース層を接着剤、シアノアクリ レート系瞬間接着剤などを使用してガラス基板に接続します。アクリルの端に 2 滴を置き、接着剤を平らに広げ、使い捨てのツールを使用します。アクリルにガラス基板を置き、代わりにそれを保持するガラスの重量を使用して乾燥して接着剤を許可します。
    2. 肯定的な変位をプレパラート PDMS の 100 μ L で露出したガラスをコートします。真空スピン コーターの基本レイヤーの挿入し、厚いコート PDMS 膜約 10 μ m のガラスに均等に 2 分間 1,500 rpm に設定します。
    3. スピン コーターからベース層を外し、慎重にアセトンや紙タオルでアクリルをコーティングした任意の余分な PDMS をぬぐいます。未硬化の PDMS を邪魔しないように注意します。
    4. 2 h の 65 ° C のオーブンで、PDMS を治すための PDMS の基本レイヤーを焼きます。
    5. ピペット 1 mL PDMS のスライド ガラスに、ガラスの別のスライドを使用して、側面をにじみ出す始めるまで、PDMS を均等に分散します。150 ° C 10 分のホット プレートで、これを治します。
    6. MY133 V2000 デバイスと同じサイズの四角形に硬化 PDMS を切ると、アクリルの中間層を使用すると、金型として、貯水池の穴をパンチし、PDMS ガスケットに PDMS でウィンドウを表示する正方形をカットします。
    7. MY133 V2000、チャネル側、同じまたはステップ 1.2.5 で、PDMS のプラズマ治療用として似たような平らな基板を置きます。クリーナー O2プラズマにおける MY133 V2000 チャンネルと一緒に硬化 PDMS 基板を含むアクリル ベース層を配置します。高レベル 200 mTorr と RF に真空圧力を設定し、30 のチャネルとガラス基板の表面-御馳走 s。
    8. 鉗子を使用すると、すぐにチャネルに配置、MY133 V2000 ベース層アクリルの矩形切り欠き側を MY133 V2000 連絡先、PDMS。
    9. デバイス貯水池とガスケットの穴を並べる MY133 V2000 デバイス上に PDMS のガスケットを配置します。
    10. デバイス アセンブリのクランピング表面を提供するためにベンチの上の上げられたプラットホームに未完成のデバイスを置きます。
    11. 注射器を用いたアクリル セメントの 3 mL を抽出します。薄いコーティングを提供するために基本レイヤーの上に十分なアクリル セメントを配布します。さらに可能な限り、チャネルに材料の湧水はいけないコートを作る。
    12. ベース層のアクリルの上に中間層のアクリル作品を配置します。穴 MY133 V2000 チャネルの貯水池と揃っていることを確認します。
    13. 3 小さなクランプを使用して、ベース層を保持するために中間層としてアクリル セメント中の 2 分間できるだけしっかりと一緒になって硬くなり一緒にアクリルの部分を結合します。MY133 V2000 デバイスの下に閉じ込められているから空気を防ぐためにこのステップの中に貯水池はふさがれていないか確認します。
    14. デバイスからの圧力を削除し、上層部にアクリルと予想される連絡先の場所で中間層にアクリル セメントを配置します。
    15. 貯水池と穴の位置が合っていることを確認、アクリルの中間層部分にアクリルの最上位のレイヤーを配置し、残り 2 分間ベンチにアクリル セメント乾燥中。

3. テストと MY133 V2000 デバイスの使用

  1. リーク ・ テスト
    1. 密着性とフローをテストする貯水池の穴の 1 つに食品染料または脱イオン水の 10 μ L を追加することによって MY133 V2000 デバイスをテストします。
    2. 貯水池に (1/8 で外側の直径) とチューブを挿入し、真空トラップにもう一方の端を接続します。プル染料に真空または正常なデバイスが作成されていることを確認するチャンネルを介して水をオンに。
    3. チャネルまたは貯水池のリークがないことを確認するには顕微鏡下でチェック、エタノール、リザーバー、10 分間室温で放置し、エタノールを許可します。染料またはチャネルの水をきれいにする真空を使ってエタノールを引き出します。
    4. チャネルをエタノールにスプレーし、滅菌スチロール皿に入れてください。パラフィルムでしっかりと包んで、必要になるまで無菌環境で保存できます。
      注: この時点で、デバイス処理しなければならない無菌汚染防止のため。デバイスを使用する準備ができたら、容器の外はエタノールを使用し、バイオ セーフティ キャビネット コンテナーを開いて前に滅菌する必要があります。
  2. MY133 V2000 デバイスでめっき MCF7 細胞
    1. MCF7 細胞文化のインキュベーターで、非本質的なアミノ酸、グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシン 10% 牛胎児血清を添加したダルベッコ最小値必要な媒体 (DMEM) から成る完全なメディアで 10 cm シャーレで細胞を成長します。5% CO2と 37 ° c. の温度で 20% O2を含む湿気のある大気を維持します。マイクロでそれらを播種する前にセルを約 80% 合流に成長します。
    2. まず、70% エタノールによるマイクロ チャネルを含んでいるポリスチレンの皿をスプレーします。その後、周囲のラボ環境からチャンネルを守りパラフィルムを削除する前にキャビネットのバイオにそれをもたらします。
    3. マイクロ流路表面にひと血漿由来フィブロネクチンを 10 μ G/ml にそれダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) で希釈することによって固定します。チャネルにこのソリューションの 20 μ L を注入し、45 分の 20 ° C でインキュベートします。
    4. 細胞培養媒体の 20 μ L 注入によってチャネルにチャネルからフィブロネクチン ソリューションを洗うし、20 の ° C で 10 分間インキュベートします。
    5. DPBS、10 mL で細胞を洗浄し、1 x トリプシンの 1 mL を追加することによって、細胞を trypsinize します。37 ° C 完全なメディアの 7 分 Neutralize 9 mL のトリプシンで細胞を孵化させなさい。
    6. チャネルの細胞の 20 μ L の注入し、イメージングの前に基板に添付できるように 45 120 分の 37 ° C でそれらを孵化させなさい。

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結果

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このプロトコルでは、MY133-V2000、低屈折率マッチング水の弗素化ポリマーの作製について説明します。このプロトコルの主な機能は、チャネルを密封するために必要な余分な機械的な力を提供するためにアクリル ホルダーにデバイスを製造、酸素プラズマを用いたフッ素化ポリマーの特徴である接着剤の不足を克服する方法に対して PDMS 基板 (図 1)。最終的なデバイスの低屈折は、巨視的なスケール (図 2) に明確に表示されます。この素材から作られたチャネルの端が明らかに空気 (図 2A) に見られるが、屈折の接戦のため (図 2B) 水に浸漬するときを区別するために困難になります。これは作製後材料の光学特性の簡単なチェックを提供します。正常に完了したデバイスは、

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ディスカッション

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MY133 V2000 は、PDMS など伝統的なソフト加工材料の代替として使用できます。前作は、高い屈折率、PDMS などの材料が作製材料とチャネル内水溶液の組合わせを誤まる屈折によるチャネル壁近くに重要なアーティファクトを紹介示しています。13. MY133 V2000 により水溶液の生物医学アプリケーションで通常使用するマイクロ流体デバイスの屈折を一致します。これは作製材料伝統的なマイクロ以上の明確な利点を提供する、高度な顕微鏡技術とマイクロ流路を結合するとき画像アーチファクトを低減します。マイクロ流路中のアーチファクト低減信号をマイクロ チャネル構造13に近い距離でより正確に定量化するこのシステムにより蛍光定量位相顕微鏡 (図 3) で可能にしました。

フッ素系ポリマーとして MY133 V2000 は通常チャネル構造と他の材料の粘着力が弱いを展示導入される伝統的な加工材料と比較されたとき主要な制限。このような課題を克服...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、ユタ大学と組み合わせて資金によってと同様、研究では、副大統領のオフィスを与えるハンツマン癌研究所とハンツマン癌研究所で CRR プログラムを受賞 P30 CA042014 によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
MY133-V2000MY ポリマーMY133-V2000
シルガード 184エルスワース 接着剤184 SIL エラストキット 0.5KG
フィッシャープレミアム顕微鏡スライドフィッシャーサイエンティフィック12-544-4.118
インチ (3.0mm) x 12インチ x 12インチ アクリルシート米国プラスチック株式会社44290.060
インチ (1.5mm) x 12インチ x 12インチアクリルシート米国プラスチック株式会社44200
SCIGRIP 3 非常に高速セット アクリルセメント米国プラスチック株式会社45735
標準アルミホイル (厚さ .6 mm)VWR89107-726
キムワイプフィッシャーサイエンティフィック06-666
インスタキュア+ 瞬間接着剤ボブ・スミス・インダストリーズBSI-109
1/8" PVCチューブマクマスターカー5231K55
マコーミック食品着色ターゲット13353207
X -Acto #1精密ナイフX -ActoX3201
X -Acto #18ヘビーウェイトウッドチゼルブレードX -ActoX218
VWRカミソリブレードVWR55411-055
表面処理細胞培養皿フィッシャー科学FBO12922
フィブロネクチンヒト血漿Sigma-AldritchF0895-1MG
トリプシン-EDTA 10xFisher Scientific15-400-054
コーニング ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水Fisher ScientificMT21030CM
Gibco ペニシリン-ストレプトマイシンFisher Scientific15-140-148
HyClone Nonessential Amino Acids 100xFisher ScientificSH3023801
Fetal Bovine SerumOmega ScientificFB-12
Corning DMEM with L-glutamine and glucoseFisher ScientificMT10013CV
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silaneSigma-Aldritch448931Reacts violently with water
Ethanol, 200 proof Decon Labsフィッシャーサイエンティフィック04-355-223
アセトンフィッシャーサイエンティフィックA18P-4
ベルアート 42025 プラスチックデシケーターコールパーマーEW-06514-30
エピローグフュージョン レーザーカッター、120 Wピローグレーザーエピローグフュージョン M2 32 レーザー
等温攪拌ホットプレートフィッシャーサイエンティフィック SP88850200
Ateco 14111 1.5インチステンレス鋼カッターAteco14111
Pyrex ガラス細胞培養皿Fisher Scientific08-747B
無線周波数プラズマクリーナーHarrick プラズマPDC-32G酸素ガスに使用
ブラックホール研究所 Digivacブラックホール研究所モデル 215
Intelli-Ray 紫外線オーブンUvitronUVO338
コンパクトスピンコーターMTIコーポレーションVTC-100A
フィッシャーブランド アイソテンプオーブンフィッシャーサイエンティフィック15-103-0510強制空気対流
ギルソン 容積式ピペット P1000フィッシャーサイエンティフィFD10006G
ヘラセル VIOS 160iフィッシャーサイエンティフィック13 998 212PM
エック

参考文献

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MY133 V2000 PDMS

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