このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

嫌気性蛋白質の浄化および DesB ジオキシゲナーゼ活性と抑制の勉強用酸素電極による速度論的解析

8.3K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/58307

⸱

2018年10月3日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Wesleyan University

この記事について

サマリー

ここで嫌気性蛋白質の浄化、嫌気性蛋白質濃度、酸素電極システムを使用して後続の速度論的解析のためのプロトコルを提案する.DesB より安定し、精製し、嫌気性環境で保存されているときにアクティブであるジオキシゲナーゼ酵素酵素を用いた方法を示します。

要約

これらの酵素は、基質として酸素を利用するを含む酸素感受性タンパク質は伝統的な有酸素浄化メソッドを使用して精製した際の安定性が減少します。この原稿は、グローブ ボックスと反応速度論の前に蛋白質の脱塩でバッファーおよび試薬のカラム ・ クロマトグラフィ法の準備を含む嫌気性精製プロセスに関与する技術的な詳細を示しています。準備および酸素電極を使用して酸素を利用した酵素の速度論的解析を実行するためのメソッドは、述べる。これらのメソッドは、ジオキシゲナーゼ酵素細菌Sphingobium sp. ひずみ SYK 6 から没食子酸ジオキシゲナーゼ DesB を使用して説明します。

概要

鉄や他の金属には活性酸素を利用する酵素は、それらの除去のため細胞の還元環境から浄化プロセス中に不活化を受けやすい。したがって、これらの蛋白質はセル lysates として使用する必要があります、外部の還元剤にさらされるまたは最適な酵素活性1,2,3,4があるように嫌気浄化されます。これらの酵素は酸素感受性 (具体的には鉄を含む酵素)、嫌気的条件を維持しながらすべての精製と諸性質の手順を実行するそれらを完全に特徴づける必要です。これは、嫌気性チャンバー結晶5,6,7,8 を介してタンパク質発現に至る研究の範囲内で全体の研究室のセットアップを開発する研究者をつながっています。.

ここで、嫌気性の精製と酵素酸素電極を用いた DesB の速度論的解析法を報告する.DesB は、没食子酸ジオキシゲナーゼ細菌Sphingobium sp. ひずみ SYK-6 LigAB、同じ有機体から protocatecuate ジオキシゲナーゼに関連しているからです。日9、好気性の標準を使用して精製した場合不活化を受けやすいこのスーパーファミリーの酵素の一部可能性がありますに広範囲に研究されていないタイプ II プロトカテク酸-ジオキシゲナーゼ (PCAD) スーパーファミリーに属する両方の酵素蛋白質の浄化方法。PCAD 酵素のいくつかはありますが基質特異的2,10, 基板混乱を表示からさらにこのスーパーファミリーの特性評価は特異性の決定要因を識別するために必要です。小さな分子が直接競争の阻害を介して活動またはのバインディングを変更できますいくつか酵素ガ11,12,13,14,15で確認されています別のアロステリック ポケットが増加または減少酵素活性16する分子。速度だけでは、変調器の結合場所を区別できない、効果を理解するために重要なは活動変化の大きさを決定します。このような DesB のネイティブ アクティビティおよびその活動 4-nitrocatechol (4NC) を特徴付けるジオキシゲナーゼ酵素2,17,を抑制する一般的に使用される化合物の存在下での速度論的解析法18日が表示されます。

DesB は、リグニン由来芳香族化合物、基板10,19の一つとして酸素を使用して開口部を触媒するリングで extradiol ジオキシゲナーゼ (江戸) 反応による没食子酸を分解することができます。この酵素反応は芳香族 heteropolymer は、植物の細胞壁のリグニン分解のコンテキスト内で発生します。リグニンを depolymerized することができます、さまざまな芳香族化合物を降伏するさらに分けることが中央代謝物3,20,21,22,2324, ,25,26,27,28,29,30,31,32,33.Extradiol dioxygenases (江戸) を触媒、胸の谷間が金属配ジオール; に隣接して発生する dihydroxylated 芳香族化合物の反応を開環対照的に、intradiol dioxygenases は、2 つのヒドロキシル グループ (図 1) と芳香族化合物類似を切断します。他の多くの酵素のような EDOs 2 ヒスチジン 1-カルボン酸トライアド9,34,35から成る調整鉄 (ii) の二価金属センターがあります。これらの酵素は、酵素が非アクティブな2,36,37,38を表示されるに対し自動酸化、不活性化のメカニズムに基づくと酸化になります。

本稿では、実験手順では、DesB、没食子酸 (図 2 a) の C4 C5 結合に酸素の付加を触媒する細菌Sphingobium sp. SYK-6 から PCAD スーパーファミリーのメンバーを利用します。この胸の谷間の regiochemistry は、プロトカテク酸--4, 5-ジオキシゲナーゼ (図 2 b) は、LigAB に似ています。これまでのところ、この没食子酸ジオキシゲナーゼの調査は、DesB10,19,39を阻害する化合物のレポートを含めません。有酸素浄化方法の使用は、DesB では、変数の活動を嫌気的方法の使用に一貫して再現可能なアクティビティとタンパク質を取得することができました、出展しました。ここで説明した動力学的研究 DesB、没食子酸と DesB の反応と 4-nitrocatechol (4NC) による DesB の阻害の速度論的解析の嫌気性の浄化メソッドに示します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1. 一般材料と方法

  1. 表 1に示すようにすべての必要なメディアを準備します。15 分無菌 120 ° C のオートクレーブは、0.2 μ m フィルターを通過して MgCl2とグルコースの添加後 SOC ソリューションをフィルターします。オートクレーブに入れる前にミラーのホストゲノム スープ (LB 媒体) 溶液の pH を調整します。0.2 mM、0.1 mM 鉄アンモニウムの硫酸塩タンパク質発現と溶解性を高める L-システインのオートクレーブ滅菌ソリューション後補足 LB アンプ メディア ソリューションです。
  2. 表 2で説明したよう、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) の塩化物イオンとバッファーと連続したバッファーを準備します。彼らの最終的なボリュームにコンポーネントを希釈する前に (バッファーの準備のため 1 M HCl とトリスのベースを用いた) 溶液の pH を調整します。
  3. 表 3で説明した蛋白質の浄化のためのバッファーを準備します。彼らの最終的なボリュームにコンポーネントを希釈する前に (バッファーの準備のため 1 M HCl とトリスのベースを用いた) 溶液の pH を調整します。
  4. 1 穴ゴム栓で密封することができますし、ガラス管が含まれているボトルに準備されたバッファーを転送します。
    1. ストッパーでガラス管を真空装置に接続するのにホースを使用します。中速で攪拌しながら約 30 分間の否定的な圧力の下でドガにソリューションを許可します。
    2. シールが最初に、その後、真空をオフに真空を破る。次に、(エスケープ ガスベントとして使用することができます 1 つの短い針と、ボトルの底に達するのに十分な長さは、1) 2 つの 20 G 針でゴム栓を貫通します。30 分の中速で攪拌しながら窒素の定常流のバブルします。
    3. 針を削除し、3 つのサイクルの合計脱気、窒素バブリングを繰り返します。完了したら、正しく固体ゴム栓とボトルを密封します。さらにパラフィン フィルムと銅線 (20 G)、ストッパーを固定し、グローブ ボックスに配置します。
      注: すべての材料は、グローブ ボックスに配置、控えの間、続いて酸素吸引と窒素補充のパージの 3 サイクルを受けます。精製・濃縮に使用されるバッファーを頂いたし、グローブ ボックスに無期限に保存できます。
  5. 約 1 つへら (0.31"× 2"、両頭マイクロテーパー ステンレス製ヘラの小さい方の端) を 1 mL 約 1.5 mL 遠心チューブにガスを抜かれた水のナトリウム ジチオンの完全溶解してナトリウム ジチオン液を準備します。.グローブ ボックスから削除する前にパラフィン フィルム チューブをシールします。
    注: は、酸化を防ぐためにグローブ ボックスに固体ナトリウム ジチオンを格納します。

2. 蛋白質の浄化のアミロース カラムの準備

  1. アミロース列バッファーのハイフロー アミロース樹脂 (15 mL) を 5 列ボリューム (75 mL) と組み合わせてからスラリーを作る。2 つの 50 mL の血清ボトルに樹脂スラリーを転送し、ゴムキャップとそれぞれのボトルのシールします。スラリー、懸濁液から酸素を取り除くに約 1分間に 20 G、隔壁、およびバブルの窒素を 305 mm 針を穿刺します。樹脂とタンパク質含有溶液をグローブ ボックスに転送します。
  2. グローブ ボックスで解決し、レベルのベッドを作成する樹脂を許可する単純な活栓装備 2 x 30 cm ホウケイ酸列に樹脂を注ぐ。列バッファーを切るし、溶媒が真上まで約 1 のドロップ/秒または 5 mL/分で樹脂を通してバッファーをプッシュする加圧窒素ガスを使用して脱アミロース列バッファーの 3 列ボリューム (〜 30 mL の合計) のコラムを平衡させ、樹脂ベッド。
    注: 後、タンパク質が溶出 (3.5 以下のステップを参照)、アミロース列ガレージが 1 列ボリューム (10 mL)、水の 1 列量 1% ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS)、および最終的に、3 列ボリューム (30 mL) 水の洗浄によって再生成されます。グローブ ボックスの外側は、この手順を実行することができます。列樹脂は 4 ° c 20% エタノールで格納され、5 回までを再生成することができます。

3. 蛋白質の表現および DesB の嫌気性の浄化

注: DesB 遺伝子市販合成された、ペット 15 b、32 a、ペットおよびクローニング サイト NdeI および病原の制限を使用して pMAL c5x ベクトルに配置されて有する。

  1. (下記で簡単に説明) 大規模な表現のための正しい条件を決めるには製造元のガイドラインによるとタンパク質発現アッセイを完了します。
    1. 変換 DesB を含むプラスミド商業的、化学的に有能なエシェリヒア属大腸菌BL21 (DE3) 細胞、製造元の指示に従って。簡単に言えば、10 分間氷の上細胞を解凍、10 の 42 ° C でセルをセルの混合物、熱衝撃にプラスミド DNA のおよそ 10-50 ng を追加 s、追加 5 分 1 mL の最終的なボリュームを取得し、許可する追加の SOC のメディアのための氷の上にそれらをインキュベートし、60 分の 37 ° c (~ 200 rpm) を振るセルです。LB アンプ板追加し広がり細胞液を 100 μ l 添加し 37 ° C で一晩インキュベート
    2. 一晩インキュベートした後プレートからコロニー形成単位を選択し、この植民地を使ってポンド アンプ メディアの 10 mL を接種します。37 ° C で (~ 200 rpm) を振動で一晩、セルを育てなさい
    3. 10 mL の培地、一晩成長溶液 100 μ L を追加し、37 ° C で 3.1.2 の手順で説明するように、新しいメディアを振るとき 600 の光学濃度イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 1 mM の最終溶液濃度を取得するを追加 nm (外径600) は 0.4 から 0.8 の間。
    4. すぐにソリューションの 1 mL の約数を削除し、ラベル付けされた時間と 1.5 mL 遠心チューブに転送 0 時間を =。細胞のペレットを 10 分間 15,000 × g でチューブをスピンします。回転後、上澄みを除去し、4 ° C で細胞を保存
    5. (通常は 5、10、12、18、24 h) IPTG の添加後の時間間隔で追加因数 (各 1 mL) を削除します。3.1.4 の手順で説明するよう各チューブを遠心、上清をデカント、4 ° C で細胞を保存
    6. 試料を取得すると、すべてはからの細胞を再懸濁します細菌のタンパク質抽出液の 30 μ L で各 timepoint 10-15 分、室温でインキュベートして水溶性と不溶性を分離する 5 分間 15,000 × g でチューブを遠心分離蛋白質。
    7. 新しい微量遠心チューブに可溶性タンパク質溶液を移し、細菌のタンパク質抽出溶液の 30 μ L で残りの不溶性のペレットを再懸濁します。
    8. 塩化物イオンとバッファーの等しいボリュームと各ソリューション (各 timepoint の水溶性と不溶性の両方のソリューション) の 30 μ L を結合し、SDS ページのゲル40上に視覚化します。大規模な蛋白質の表現そして浄化のための可溶性画分で正しいサイズのバンドを含む車線に対応する条件を選択します。
      注: 最小限の可溶性タンパク質では、上記の条件を使用して生成された当初、以来様々 なサプリメント追加された 0.2 mM L システインと強化された蛋白質を示す 0.1 mM 鉄アンモニウム硫酸塩の可溶性タンパク質発現に与える影響をテストするには式です。このタンパク質式画面によると DesB の可溶性生産のため適切な表現のベクトルは pMAL c5x ベクトルだった
  2. 大腸菌BL21 に変換を次 (DE3)、80% のグリセロールの 100 μ L と 900 μ L の培養 (37 ° C、200 rpm で振とうしながら成長した一晩) を組み合わせることで DesB/pMal c5x の在庫を作る。クライオ チューブに-80 ° c 株式を格納します。
    注: 作成新しいフローズン タイプ約 6-8 ヶ月ごと。
  3. ピペット チップを使用して冷凍ストックから細胞をこすりし、揺れで 37 ° C で LB アンプ メディアの 5 mL で一晩成長細菌培養を開始します。37 ° C と一晩培養細菌を使用して 200 の rpm で 2 L フラスコで LB アンプ メディアの 1.5 リットルを接種します。
    注: 酸素にタンパク質の観察された感受性のため分かった削減ヘッドスペースガス フラスコと中程度の大規模な式の速度向上蛋白質収量の揺れ。
  4. タンパク質の発現を誘導するときに 600 の光学濃度 nm (外径600) は 0.4-0.8 ~ 1 mm IPTG の 0.2 mM L システインと 0.1 mM 鉄アンモニウム硫酸を添加しました。30 ° c の孵化の温度を下げ、200 rpm で振る。スピン ・ ダウン 4,700 × g 10 分間に 24 h 後誘導後遠心分離して細胞と使用済みメディアを破棄します。
  5. リゾチームの 1 mg の添加に続いて、成長のすべての 1.5 L あたりアミロース列バッファーの 20 mL の細胞ペレットを再懸濁します。氷の上を 20 分間かき混ぜます。
    注: より多くのバッファーをタンパク質としても粘性のソリューション可能性があります均質化、次の手順を中断解決策があまりにも粘性の場合追加できます。
  6. 約 15,000 psi で 3-5 パスで高圧均質化によって再懸濁細胞液を溶解させます。50 mL の遠心管に蛋白質を転送し、1 分の窒素とヘッド スペースをフラッシュします。細胞ライセート不溶性のがれき撤去を 40 分間 20,000 × g で遠心分離します。
    注: 成功した均質化コレクション フラスコにチューブを通して流れるし、ソリューションが半透明の灰色茶色色として表示されますフォーム ミセルにタンパク質を原因します。プロセス全体の氷の上の均質化蛋白質を保ちます。
  7. 遠心分離の後転送上清 (以上 1 つ必要があります)、50 mL のチューブにキャップ ゴム中隔と 20 ゲージ針、酸素を転置するために 2 分のためのソリューションを通じてゆっくりとバブルの窒素のガス管です。パラフィン フィルムで中隔を包むとさらに、銅線で固定し、列の材料と一緒にグローブ ボックスに上清をもたらします。
  8. コラムを平衡させ (手順 2.3 参照) 列に上清タンパク質を読み込むとします。通過 (1 滴/秒または約 5 mL/分) 適度に加圧窒素下で 5 mL の一部分を収集します。次に、アミロース列バッファーの別の 3 列ボリュームを使用して、列を洗って、適度に加圧窒素 (約 5 mL/分) の下でガラス試験管に 3 mL の一部分を手動で集めます。5 列ボリューム (~ 50 mL) の溶出バッファーを使用したタンパク質を溶出し、手動で適当な窒素圧力 (約 5 mL/分) の下で 3 mL の一部分を収集します。
    注: 分数または収集できます重力ろ過を用いたします。約 12 溶出画分を収集する必要があります。
  9. 分数の 30 μ 因数を収集し、タンパク質を含む可視化できるようにグローブ ボックスからそれらを削除 SDS-PAGE 分析による分数。
    注: 収集した分数は、このテストの期間はグローブ ボックスに残ります。精製 DesB は通常 5 から 3 の分数列からた。

4. 嫌気性蛋白質濃度/バッファー交換

  1. 76 mm 再構成されたセルロース膜フィルター (カットオフ 10 kDa) と加圧、攪拌セル コンセントレーターを組み立てます。組み立てのコンセントレーターがグローブ ボックスに転送されると膜を維持するコンセントレーターに 20% のエタノールの十分な量を追加します。
    注: は、細胞膜には涙がないしわない o リングがあることを確認します。
  2. 撹拌槽のコンセントレーターをグローブ ボックスに持ち込み後、に水膜をエタノール溶液を洗ってください。キャップし、チューブと、余分な水分の膜をきれいにする撹拌セルを加圧します。
  3. コンセントレーターに SDS ページ (図 3) で決定されたタンパク質を含むすべての画分を追加します。総蛋白質の解決の容積の 150 mL を生成するための十分な exchange バッファーを追加します。
  4. 外線 N2を用いた撹拌槽室を加圧し、適度な攪拌スピード 50 mL に蛋白質を集中します。
    注: は、約 20 分かかります 50 mL の濃度を達成します。
  5. 100 mL の 0.1 mM ジチオトレイトール (DTT) と 0.1 mM 硫酸第一鉄アンモニウム交換バッファーを補完、撹拌槽にソリューションを追加し、攪拌スピード中等度 50 mL の合計容積に蛋白質を集中します。
  6. ソリューション 50 mL の量に達すると後、もう一度補われた交換バッファーの追加、その攪拌スピード穏健派と 10 mL の合計容積に解決策を集中します。
  7. 集中を使用して蛋白質 0.45 μ m 孔サイズのシリンジ フィルターそして因数個々 の 0.2 mL ポリメラーゼの連鎖反応 (pcr) の管に (各蛋白質の解決の約 150 μ L を含む) にフィルターを適用します。グローブ ボックスから頂いた因数を削除し、フラッシュがすぐにそれらを液体窒素に凍結します。因数-80 ° C で保存します。

5. DesB の脱塩

  1. 使用前に約 1.5 時間の窒素ガスでグローブ バッグをフラッシュします。
  2. 氷の上、グローブ バッグ内浄化された DesB 蛋白質の 150 μ 因数分解しなさい。
  3. タンパク質を分解すると、小さな重力、9 mL ホウケイ酸列のセファデックス G-25 粗脱塩ゲルの 3 mL を含む列を脱塩を準備します。2 列ボリューム (~ 6 mL) を洗い流す脱バッファーを脱塩します。
    メモ: は、(約 7 使用) 後ゲル色が白から黄色に変更がある場合に脱塩ゲルを交換します。
  4. 重力制御のプロセスを介して列に解凍 DesB をロードします。流れを破棄します。約 5 ml のバッファーを脱塩のタンパク質を溶出します。
    注意: グローブ バッグを継続的に充填ガスのタンクからの圧力で解列から点滴速度を影響します。
  5. 列からタンパク質の溶出の最初の決定、12 バイアル/有害溶出 (バイアルあたり 3 滴を含む) を収集します。ゴム隔壁で密閉、それらを削除グローブ バッグと蛋白質の存在のためのテストから直接 (SDS ページのゲルの分析) によってまたは間接的 (を介して各画分の活動の検討)。
    注: 通常、分数個々 にテストされるアクティビティのアクティブなタンパク質の最大濃度の割合に対応する最大の活動手順 7.1 で説明しました。DesB は通常、脱塩蛋白質の次の 9 滴を収集した後、第 7 回のドロップで始まってた。タンパク質因数は、速度測定 (手順 7.1 7.4) 中に氷に格納されます。

6. 酸素電極の準備

  1. 黒い酸化物の目に見える兆候がないまで銀アノード リングと白金陰極電極クリーナーと湿った綿棒を磨きます。
  2. はさみ、スペーサー用紙 (またはも同様に動作するタバコ ローリング ペーパー) の約 1 つ 1.5 インチの四角にカットします。その後、電極の折り返しを支援するためにコーナーに広場と 2) スリットの各面に 1) 小さな三角形をカットします。
  3. 銀陽極上に 50 %kcl 溶液 5 滴溝し、彼らは、ソリューションの 1 つの連続的なリングを形成するので接続を追加します。白金電極の上に 50% の KCl 溶液 2 滴を追加します。慎重に白金電極上にスペーサー紙を置き、スペーサー紙を滑らかに空気の泡がないので。
    注: は、スペーサー紙を引き裂くことを避けるために注意を使用します。
  4. 約 2 インチの長さは、S4 30 m PTFE (ポリテトラフルオロ エチレン) 膜の一部を切断し、スペーサー紙の上に置きます。彼らは電極の外側のリングに揃えて配置されますので、膜の端が切れます。
  5. O リングのアプリケーターを使用して、紙と膜電極上にスペーサーを固定する電極を小型の o リングを押してください。その下にある膜がないことを確認、電極の円形溝に大きな o リングを配置します。ベースの上に電極の上部室をスライドさせ、一緒に 2 つのネジします。
    注: 2 つは上ねじ止め正しく場合は空気泡棒の商工会議所の側面に。
  6. そのベースに組み立てられた電極を配置して電極を監視システムに接続します。電極制御プログラムを開始し、液相キャリブレーション プロトコル (図 4 a) を実行することにより、電極のキャリブレーションします。温度変数は実験が行われ、部屋の温度は、周囲の圧力変数地域と現在の気象条件によって異なります。
    注: 大気圧は、地域の天気予報から入手できます。
  7. 電極箱に 25 mM Tris バッファーの 1 つの mL を追加、プランジャーを挿入、酸素飽和液の調整を開始、100 を攪拌速度を調整します。電極が安定、酸素の飽和溶液を決定のキャリブレーション セット ポイント (図 4 b)。
  8. プランジャーを削除せずには、空気の泡 (図 4) を追加することに注意しながら、商工会議所に約 1 mL のナトリウム ハイドロサルファイト溶液を注入するのに 1.2 x 40 mm 針と 1 mL 注射器を使用します。ナトリウム ハイドロサルファイト添加直後に電極チャンバーを密封するのにゴム栓を使用します。
  9. すべての酸素を利用し、プログラムが完了するまで続行して保存 (図 4) 校正校正を許可します。商工会議所からソリューションを吸引し、プランジャーと脱イオン水で商工会議所を 5-6 回リンス亜ジチオン酸ナトリウムの完全な除去を確実にします。洗浄、側腕真空フラスコに接続されているピペット チップ搭載プラスチック製のチューブを使用します。細胞膜の損傷を防ぐ。

7. 酸素電極を用いたカイネティックアッセイ

  1. 連続 25 mM Tris バッファー ph 7.5 のソリューションで活性酵素液 1 μ L をテストし、100 μ M の没食子酸を含むアクティブな蛋白質を含んでいる脱塩因数を識別します。最大観測活動と残りの実験のため、aliquot(s) を使用します。(手順 5.5.1 参照)
  2. O2を使用して O2消費量を測定することにより酵素反応の速度を決定する-クラーク型電極電極コントロール ユニットを介してコンピューター統合。
    1. 各速度データ ポイント DesB の測定は、電極箱に 25 mM Tris バッファー (pH 7.5) の 1 つの mL を追加します。没食子酸の原液を 25 mM の計算された容積を目的最終的な基質濃度 (0.05 〜 25 ミリメートル) を達成するために Tris バッファーに追加します。
      注: は、毎日没食子酸と水と阻害化合物の新鮮な在庫ソリューションを準備し、7.5 0.1 mM NaOH 添加で pH を調整する必要に応じて。
    2. 10 後 s を可能にするソリューションの混合攪拌のチャンバー内にプランジャーをゆっくりとシールし、上部のスクリュー ダウン。クリーンな組織は、商工会議所から避難は余分な液体を吸収する使用場合があります。酵素 (背景 O2消費率 ± 0.5 μ M/分) の付加に進む前に、少なくとも 1 分溶液中の酸素濃度の安定した測定を作り出すことができるそれを平衡に電極を許可します。
    3. ガス タイト 10 μ L のシリンジを使用すると、プランジャーを電極箱に約 1 μ L の酵素 (約 3-7 μ M 酵素) を追加します。
      注: 酵素の量が増加または十分な反応速度を許可する特定の因数の観測活動への応答で減少します。
    4. 最初の 30 の傾きに基づく反応速度の計算線形データの正しい酵素添加後の s の背景、30 を使用して O2消費酵素剤添加の直前にデータの s。触媒作用の率は O2消費量 (図 5 a) のレートと同じです。
    5. プラスチック製のチューブを使用して吸引による電極チャンバーを空に与えられた基板濃度の速度データのコレクションの後側腕真空フラスコに接続され、4-6 サイクルの水で繰り返し洗浄。7.2.1 新しい基質の濃度を使用しての手順で説明するよう、電極にソリューションを設定します。
    6. 順序付けされていない方法で基質濃度を変化し、(図 5 b) 時間と酵素活性の減少のためのアカウントに実験の過程で複製します。
      注: 特定濃度の反復実行されるより以前に実行と比較した速度の 30% 減少を示す、追加のアッセイを実行しない酵素のバッチで。通常、30-40 の実行後、酵素は活性の 30% 減少を示しています。
    7. K猫(基板の製品への転換に触媒定数) と Km (ミカエリス定数、運用初期速度がある基質濃度として定義されて、速度論的パラメーターを決定します。最大速度の半分)、グラフパッド プリズムを用いた Michaelis−Menten 式 (図 6) に基質濃度のそれぞれからデータの最小二乗フィッティングによる。
  3. 4 nitrocatechol (4NC) を分解速度に及ぼす影響をテストし、DesB と阻害定数 (K私) を決定するを追加します。反応条件ごとにストック トリス (50 mM)、没食子酸 (25 mM)、および 4NC のソリューション (25 mM) と 25 mM Tris バッファー (pH 7.5) 1 mM 没食子酸との 2 mL の溶液を生成する水で希釈を組み合わせるし、4NC の濃度を変化させます。4NC のボリュームは、目的の最終的な阻害剤濃度 (0.05 〜 20 ミリメートル) を達成するために変化させた。
    1. ソリューションの混合を許可する攪拌の 10 秒後商工会議所でゆっくりとピストンを配置、スクリュー トップ ダウン。クリーンな組織は、商工会議所から避難は余分な液体を吸収する使用場合があります。均衡を取って、酵素 (背景 O2消費率 ± 0.5 μ M/分) の付加に進む前に、少なくとも 1 分の酸素濃度の安定した測定を生成する電極を許可します。
    2. 前述したように、タンパク質 (ステップ 7.2.3) を追加 (7.2.4 ステップ)、反応速度を決定する、次の条件のため電極をリセットします。
    3. この一連の実験において、複数回の阻害剤の反応速度を決定します。1 mM の基板に様々 な添加剤の存在下で酸素消費率と阻害剤 (v/vo) の不在の標準化によって阻害を決定します。
    4. 方程式 7.3a [没食子酸分解し、方程式 7.3B グラフ作成プログラム (図 7) を使用してデータが抑制の抑制に合います。
  4. ブラッドフォードの試金運動のすべての実行が完了した後に実行することによって各実験のため正確な酵素濃度を決定します。
    注: すべての料金は、酵素濃度の修正されました。この手順は、グローブ ボックスやグローブ バッグで行う必要はありません。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

DesB マルトース結合タンパク質 (MBP) 融合コンストラクト (図 3) の精製から個々 の分数の SDS ページのゲルの分析は、示されています。ゲルを明らかにタンパク質が純粋である (MW = 91.22 kDa)、DesB の存在を除いて (MW = 49.22 kDa) と MBP タンパク質ドメイン (42 kDa) をお互いから切断します。分数 E2 および E3 は、濃度 (ステップ 4.2) に選ばれました。

DesB カイネティックアッセイから再現性のある結果は、適切なアセンブリ、校正、および実験手法によって異なります。これらの変数は、O2ソリューション (図 4 a) アッセイ中に解散する予定の割合を決定する正しい周囲温度と圧力を入力する必要があります。最初の信号 1800 と 2000 ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

アクティブな精製された DesB タンパク質を得ることに重要なステップは、形成と酵素の減らされた鉄 (ii) アクティブ サイトの維持を含みます。よう、誘導、浄化、集中、パフォーマンスを修正し、脱塩の手順は活性酵素を正常に取得に欠かせない。1 mM 鉄アンモニウムの硫酸塩の存在下でタンパク質の発現を誘導する鉄 (ii) は DesB の活性部位に正しく組み込まれてことを保証します。このメソッドは、アミドヒドロラーゼ金属酵素は、しばしば適切な折りたたみを許可する成長媒体に金属添加と金属サイト6,41,42 を結合の満室稼働を必要とするとのそれらのような研究に触発され ,43。

嫌気性の精製とグローブ ボックス内の濃度は、おそらくこのプロトコルの最も重要な技術的に困難なステップです。グローブ ボックスの脱酸素雰囲気を維持するために不...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者ない競合する金銭的な利益やその他の利害の関係があります。

謝辞

テクニカル サポートのウェスリアン大学の博士カミーユ ・ ケラーに感謝したいと思います。嫌気性蛋白質精製方法および O2 の使用に関する彼らのアドバイス教授リンゼイ + Eltis、ジェナ ・ k ・ Capyk ブリティッシュ ・ コロンビアの大学から、テキサス大学オースティン校からキリスト教ホイットマンのおかげで特別な-電極。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノディスゴールドバイオテクノロジーI2481C50
クーマシー ブリリアントブルー R-250バイオ・ラッド161-0400
過硫酸アンモニウムバイオ・ラッド161-0700
30% アクリルアミドバイオ・ラッド161-0158
N,N'テトラメチル-エチレンジアミンバイオ・ラッド161-0801
アミロース樹脂ハイフローニューイングランドバイオラボE8022S
BL21(DE3)有能な大腸菌細胞ニューイングランドバイオラボC2527I
L-システインシグマアルドリッチC7352
没食子酸シグマアルドリッチG7384
4-ニトロカテコールシグマアルドリッチN15553
鉄硫酸アンモニウムMallinckrodt5064
ナトリウムジチオン酸塩Alfa Aesar33381-22
小麦の血清のびんFisher Scientific06-406G
25 mm Acrodisc PF シリンジ フィルター Supor 膜ポール Corportation4187
400 mL Amicon 攪拌細胞濃縮器EMD MilliporeUFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa カットオフ再構成セルロース メンブレンフィルターEMD MilliporePLGC07610
DL-dithiothreitolGold Bio TechnologiesDTT50
Sephadex G-25 粗い脱塩剤カラムGE Healthcare17-0033-01
2 mL クリンプトップバイアルFisher Scientific03-391-38
Oxygraph Plus 電極制御ユニットハンザテックインスツルメンツOXYG1 Plus
酸素電子チャンバーハンザテックインスツルメンツDW1
電極ディスクハンザテックインスツルメンツS1
PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m リールハンザテックインスツルメンツS4
電極クリーニングキットハンザテックインスツルメンツS16
スペーサーペーパージグザグガソリンスタンド
Heシリーズ Dri-Lab グローブボックス真空/雰囲気会社
HE-493 Dri-Train真空/雰囲気会社
ダブルエンド マイクロテーパー ステンレス鋼 スパチュラフィッシャー・サイエンティフィック21-401-10
DWK ライフサイエンス キンブル・コンテス フレックス コラム エコノミー コラムフィッシャー・サイエンティフィックk420400-1530
10 μL、モデル 701 N SYR、セメント NDL 26s ga、2 インチ、ポイント stlye 2 シリンジハミルトン80300
DWK ライフサイエンス キンブル Kontes フレックス カラム エコノミー カラムフィッシャー サイエンティフィックK420401-1505
エマルシフレックス-C5 高圧ホモジナイザーアベスチン
B-PER 完全細菌タンパク質抽出試薬サーモフィッシャーサイエンティフィック89821
鶏卵白のリゾチームSigma Aldrich12650-88-3
ドデシル硫酸ナトリウムサーモフィッシャーサイエンティフィック151-21-3
アンピシリンシグマ アルドリッチ7177-48-2
トリプトンフィッシャーサイエンティフィックBP-1421-500
酵母抽出物フィッシャーサイエンティフィックBP1422-2
塩化ナトリウムフィッシャーサイエンティフィS271-10
カリウムッシャーサイエンティフィックP217-3
マグネシウムッシャーサイエンティフィックM33-500
キストロースフィッシャーサイエンティフィックD16-3
酸化ナトリウムフィッシャーサイエンティフィックS318-1
ス塩酸塩ッシャーサイエンティフィックBP153-500
マルトースフィッシャーサイエンティフィックBP684-500
グリシンフィッシャーサイエンティフィックG46-500
ズ ならどこでも入手可能ック塩化フィ塩化フィデ水トリフィ

参考文献

  1. Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75 (3), 583-588 (2007).
  2. Barry, K. P., Taylor, E. A. Characterizing the Promiscuity of LigAB, a Lignin Catabolite Degrading Extradiol Dioxygenase from Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Biochemistry. 52 (38), 6724-6736 (2013).
  3. Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (3), 607-614 (2014).
  4. Imsand, E. M., Njeri, C. W., Ellis, H. R. Addition of an external electron donor to in vitro assays of cysteine dioxygenase precludes the need for exogenous iron. Archives of Biochemistry and Biophysics. 521 (1), 10-17 (2012).
  5. Tsai, C. -L., Tainer, J. A. Methods in Enzymology. David, S. S. 599, Academic Press. 157-196 (2018).
  6. Kuchenreuther, J. M., et al. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. Public Library of Science ONE. 5 (11), e15491(2010).
  7. Dupuy, J., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction data for the aconitase form of human iron-regulatory protein 1. Acta Crystallographica Section F. 61 (5), 482-485 (2005).
  8. Fan, L., et al. XPD Helicase Structures and Activities: Insights into the Cancer and Aging Phenotypes from XPD Mutations. Cell. 133 (5), 789-800 (2008).
  9. Vaillancourt, F. H., Bolin, J. T., Eltis, L. D. The ins and outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 41, 241-267 (2006).
  10. Sugimoto, K., et al. Molecular Mechanism of Strict Substrate Specificity of an Extradiol Dioxygenase, DesB, Derived from Sphingobium sp. SYK-6. Public Library of Science ONE. 9 (3), e92249(2014).
  11. Lewis-Ballester, A., et al. Structural insights into substrate and inhibitor binding sites in human indoleamine 2,3-dioxygenase 1. Nature Communications. 8, (2017).
  12. Lipscomb, J. D., Hoffman, B. M. Allosteric control of O-2 reactivity in Rieske oxygenases. Structure. 13 (5), 684-685 (2005).
  13. Mccray, J. A., Brady, F. O. Allosteric Control of Transient Kinetics of Carbon Monoxide-L-Tryptoohan-2,3-Dioxygenase Complex-Formation. Federation Proceedings. 32 (3), 469(1973).
  14. Pearson, J. T., Siu, S., Meininger, D. P., Wienkers, L. C., Rock, D. A. In Vitro Modulation of Cytochrome P450 Reductase Supported Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity by Allosteric Effectors Cytochrome b(5) and Methylene Blue. Biochemistry. 49 (12), 2647-2656 (2010).
  15. Walsh, H. A., Daya, S. Inhibition of hepatic tryptophan-2,3-dioxygenase: Superior potency of melatonin over serotonin. Journal of Pineal Research. 23 (1), 20-23 (1997).
  16. Barry, K. P., et al. Exploring allosteric activation of LigAB from Sphingobium sp strain SYK-6 through kinetics, mutagenesis and computational studies. Archives of Biochemistry and Biophysics. 567, 35-45 (2015).
  17. Reynolds, M. F., et al. 4-Nitrocatechol as a probe of a Mn(II)-dependent extradiol-cleaving catechol dioxygenase (MndD): comparison with relevant Fe(II) and Mn(II) model complexes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 8 (3), 263-272 (2003).
  18. Tyson, C. A. 4-Nitrocatechol as a colorimetric probe for non-heme iron dioxygenases. Journal of Biological Chemistry. 250 (5), 1765-1770 (1975).
  19. Kasai, D., Masai, E., Miyauchi, K., Katayama, Y., Fukuda, M. Characterization of the gallate dioxygenase gene: Three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Journal of Bacteriology. 187 (15), 5067-5074 (2005).
  20. Billings, A. F., et al. Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp. nov. Standards in Genomic Sciences. 10 (1), 106(2015).
  21. Brown, M. E., Chang, M. C. Y. Exploring bacterial lignin degradation. Current Opinion in Chemical Biology. 19, 1-7 (2014).
  22. Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M., Rahmanpour, R. Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Natural Product Reports. 28 (12), 1883-1896 (2011).
  23. Clarkson, S. M., et al. Construction and Optimization of a Heterologous Pathway for Protocatechuate Catabolism in Escherichia coli Enables Bioconversion of Model Aromatic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 83 (18), (2017).
  24. de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M., Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. Journal of Biotechnology. 236, 110-119 (2016).
  25. Falade, A. O., Eyisi, O. A. L., Mabinya, L. V., Nwodo, U. U., Okoh, A. I. Peroxidase production and ligninolytic potentials of fresh water bacteria Raoultella ornithinolytica and Ensifer adhaerens. Biotechnology Reports. 16, 12-17 (2017).
  26. Gall, D. L., Ralph, J., Donohue, T. J., Noguera, D. R. A Group of Sequence-Related Sphingomonad Enzymes Catalyzes Cleavage of β-Aryl Ether Linkages in Lignin β-Guaiacyl and β-Syringyl Ether Dimers. Environmental Science & Technology. 48 (20), 12454-12463 (2014).
  27. Li, J., Yuan, H., Yang, J. Bacteria and lignin degradation. Frontiers of Biology in China. 4 (1), 29-38 (2009).
  28. Masai, E., Katayama, Y., Nishikawa, S., Fukuda, M. Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes involved in degradation of lignin-related compounds. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 23, 364-373 (1999).
  29. Morales, L. T., González-García, L. N., Orozco, M. C., Restrepo, S., Vives, M. J. The genomic study of an environmental isolate of Scedosporium apiospermum shows its metabolic potential to degrade hydrocarbons. Standards in Genomic Sciences. 12 (1), 71(2017).
  30. Shettigar, M., et al. Isolation of the (+)-Pinoresinol-Mineralizing Pseudomonas sp. Strain SG-MS2 and Elucidation of Its Catabolic Pathway. Applied and Environmental Microbiology. 84 (4), (2018).
  31. Shi, Y., et al. Characterization and genomic analysis of kraft lignin biodegradation by the beta-proteobacterium Cupriavidus basilensis B-8. Biotechnology for Biofuels. 6 (1), 1(2013).
  32. Varman, A. M., et al. Decoding how a soil bacterium extracts building blocks and metabolic energy from ligninolysis provides road map for lignin valorization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), E5802-E5811 (2016).
  33. Wu, W., et al. Lignin Valorization: Two Hybrid Biochemical Routes for the Conversion of Polymeric Lignin into Value-added Chemicals. Scientific Reports. 7 (1), 8420(2017).
  34. Koehntop, K. D., Emerson, J. P., Que, L. The 2-His-1-carboxylate facial triad: a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron(II) enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 87-93 (2005).
  35. Lipscomb, J. D. Mechanism of extradiol aromatic ring-cleaving dioxygenases. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 644-649 (2008).
  36. Machonkin, T. E., Doerner, A. E. Substrate specificity of Sphingobium chlorophenolicum 2,6-dichlorohydroquinone 1,2-dioxygenase. Biochemistry. 50, 8899-8913 (2011).
  37. Suzuki, T., Kawamichi, H., Imai, K. Amino Acid Sequence, Spectral, Oxygen-Binding, and Autoxidation Properties of Indoleamine Dioxygenase-Like Myoglobin from the Gastropod Mollusc Turbo cornutus. Journal of Protein Chemistry. 17 (8), 817-826 (1998).
  38. Vaillancourt, F. H., Labbe, G., Drouin, N. M., Fortin, P. D., Eltis, L. D. The Mechanism-based Inactivation of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by Catecholic Substrates. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 2019-2027 (2002).
  39. Sugimoto, K., et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of gallate dioxygenase DesB from Sphingobium sp. SYK-6. Acta Crystallographica Section F. 65 (11), 1171-1174 (2009).
  40. Gallagher, S. R. SDS‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. 6 (1), 7.3.1-7.3.28 (2012).
  41. Xiang, D. F., et al. Function Discovery and Structural Characterization of a Methylphosphonate Esterase. Biochemistry. 54 (18), 2919-2930 (2015).
  42. Vladimirova, A., et al. Substrate Distortion and the Catalytic Reaction Mechanism of 5-Carboxyvanillate Decarboxylase. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 826-836 (2016).
  43. Korczynska, M., et al. Functional Annotation and Structural Characterization of a Novel Lactonase Hydrolyzing d-Xylono-1,4-lactone-5-phosphate and l-Arabino-1,4-lactone-5-phosphate. Biochemistry. 53 (28), 4727-4738 (2014).
  44. Netto, L. E. S., Stadtman, E. R. The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 333 (1), 233-242 (1996).
  45. Arciero, D. M., Orville, A. M., Lipscomb, J. D. Protocatechuate 4,5-Dioxygenase from Pseudomonas testosteroni. Methods in Enzymology. 188, 89-95 (1990).
  46. Harpel, M. R., Lipscomb, J. D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans. Journal of Biological Chemistry. 265 (11), 6301-6311 (1990).
  47. Ishida, T., Tanaka, H., Horiike, K. Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenase with broad substrate specificity. Journal of Biochemistry. 135 (6), 721-730 (2004).
  48. Vaillancourt, F. H., Han, S., Fortin, P. D., Bolin, J. T., Eltis, L. D. Molecular Basis for the Stabilization and Inhibition of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by t-Butanol. Journal of Biological Chemistry. 273 (52), 34887-34895 (1998).
  49. Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, 305-314 (2005).
  50. Wolgel, S. A., et al. Purification and Characterization of Protocatechuate 2,3-Dioxygenase from Bacillus macerans: a New Extradiol Catecholic Dioxygenase. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4414-4426 (1993).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

嫌気性蛋白質の浄化および DesB ジオキシゲナーゼ活性と抑制の勉強用酸素電極による速度論的解析
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。