方法論記事

限外ろ過遠心分離法を用いたマウスの気管支肺胞洗浄液細胞小胞の分離

DOI：

10.3791/58310

⸱

2018年11月9日

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care, Women's Guild Lung Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Medicine, Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、2 つ小胞細胞の隔離のプロトコル、遠心限外濾過とマウスの気管支肺胞洗浄液のサンプルから細胞小胞を分離する密度勾配遠心法と遠心をについて説明します。両法によりマウスの気管支肺胞洗浄液由来細胞の小胞は定量化され、特徴付けられます。

要約

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細胞小胞 (Ev) は、通知機能を生理学的および病理学的状態の間に多くの生物学的に重要な役割を果たす新たに発見された細胞レベル下のコンポーネントです。EVs の分離は、各テクニックに固有の制限のため、この分野で主要な挑戦を続けています。密度勾配遠心法で差動遠心は一般的に使用されるアプローチと EV 分離のゴールド スタンダード プロシージャと見なされます。ただし、この手順は、時間のかかる、労働集約的で、一般的に気管支肺胞洗浄液などの少量サンプルが適さない場合があります低レベルの拡張性の結果します。限外ろ過遠心分離法は簡単な時間と労働効率の良い高回収率と純度をまだ提供して示す.この分離方法は特に少量試料のための EV 分離に適している方法でされる可能性を提案します。

概要

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エクソソームは、EVs を, 直径 50-200 nm の最小サブセット、シグナリング プロセス1,2,3,4、5の多様なアレイにまたがって複数の生物学的機能を持っています。彼らは主に脂質、蛋白質および核酸6,7,8,9 など貨物分子を介して細胞間コミュニケーションを促進することで細胞およびティッシュの恒常性を支配します。.EV 研究の 1 つの重要なステップは、分離プロセスです。差動遠心 (UC)、密度勾配遠心法 (DGC) の有無は金標準的なアプローチが、この方法には非効率的な EV 回収率と低いスケーラビリティ10などを含む、主要な制限事項,11,12、それは細胞培養上清または高エキソソーム生産試料などの大きなボリューム サンプルへ最高の利用を制限します。利点と限外ろ過、クロマトグラフィー、ビーズや、列ごとマイクロ流体、immunoaffinity 分離サイズ排除など、他の方法の不利な点はよく記述されているとする現代の補足的な手順が開発されて克服し、各アプローチ11,12,の13,14,15の技術的制限を最小限に抑えます。他は UC のメソッド16,17,18に匹敵する純度を提供する代替手法であるフィルター ユニットのナノポーラス膜の限外ろ過遠心分離 (UFC) 示されています。この手法は、代替の分離方法の一つとして考えられます。

気管支肺胞洗浄液 (BALF) では、さまざまな呼吸器の条件19,20,21,22に多数の生物学的機能を持つ EVs が含まれます。BALF 派生 EVs が伴います洗浄回収の限られた量と同様に、ヒトでは、気管支鏡検査手順の侵襲によるいくつかの課題を勉強しています。マウスなどの小型実験動物、数ミリリットルのみ正常肺条件で回復することができます、炎症や線維化肺23より。その結果、下流用差動遠心による BALF の EV の分離のための十分な量を収集できないことがあります。ただし、正しい EV 集団を分離は、EV の生物学的機能を研究するための重要な要因です。効率と効果の微妙なバランスは、よく確立された EV 分離方法に挑戦を続けています。

この現在の調査を示す 100 kDa 分子量カットオフ (MWCO) ナノ膜フィルター ユニットを利用した遠心限外濾過法アプローチは BALF など少量の生体試料に適している.この手法は、簡単に効率的と高純度および BALF 由来の電気自動車の研究をサポートするための拡張性を提供します。

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プロトコル

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動物の使用率および動物のすべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ヒマラヤスギ シナイ医療センター (CSMC) でによって承認されました。

1. マウスの気管支肺胞洗浄液 (BALF) コレクションと準備

  1. BALF コレクション
    1. ケタミン (300 mg/kg) と頚部転位によって腹腔内経路を介してキシラジン (30 mg/kg) のカクテルとマウスを安楽死させます。
    2. 22 G 血管カテーテルを気管に挿入します。氷冷滅菌ダルベッコ リン酸バッファー生理食塩水 (DPBS) の 1 ミリリットル (mL) を含むインスリン注射器を接続し、血管カテーテルを通って両方の肺に DBP の 1 mL を植え付けます。
    3. BALF を取得し、50 mL の円錐管に、BALF を分注シリンジのプランジャーをゆっくりと撤回します。氷の上の BALF を維持します。
    4. 1.1.2 と 1.1.3 の手順を繰り返します (各マウスの合計で 4 x) x 3。
      注: 約 0.8 mL 注入の 1 ミリリットルあたり取得一般的に。また、個々 のマウス (すなわちBALF の 3 mL)、次の手順を実行することができますが、下流の実験で EVs の一貫性を保つのための大きなバッチの分離は、複数の BALF サンプルのプールします。
  2. BALF 準備
    1. 25 マウスからの BALF のプール、2 つの等しいセット (因数あたり 〜 35 mL) に分割します。
    2. 遠心分離機 400 × g、5 min のための 4 ° c で BALF の細胞と他の細胞の残骸を削除し、上清を収集します。
    3. 1,500 × g、10 分、4 ° c で上清を遠心分離機、細胞の残骸を削除します。上清を収集し、EV の分離手順に進みます。

2. マウスの気管支肺胞洗浄液細胞小胞の分離

注: この研究では、2 台の EV 隔離技法には、すなわち UFC と浮力で遠心分離する使用 EVs BALF から。各メソッドの詳細なプロトコルを説明します。

  1. 限外ろ過 (UFC) 遠心分離濃縮法
    注: このメソッドは、前述のプロトコル10から変更されました。
    1. 0.2 μ m の滅菌注射器フィルター ステップ 1.2.3 から上澄みをフィルター処理して、氷の上のフィルターの BALF。
      注: これはサイズ排除ステップという 200 より小さい小胞だけ nm が収集されます。
    2. 10 分 4 ° C で 10 分間遠心する 1,500 × g で遠心ユニット滅菌 DPBS 100 kDa MWCO 遠心ろ過ユニットを平衡、DPBS を破棄します。
      注意: フィルター デバイスの膜は、DPBS と平衡に達したが、一度膜保たれなければならないウェット デバイスが使用されるまでのすべての時間で。
    3. 2.1.1 のステップから BALF サンプル 15 mL でフィルター ユニットと 3,000 x g で 4 ° C で 30 分間遠心を埋めるフロースルー BALF は破棄されまたは別の標準的な管に集め、将来使用するため-80 ° C で保存することができます。
    4. 残り 0.2 μ m フィルター BALF の 2.1.3 のステップを繰り返します。
      注: 十分に 35 mL の開始元のボリュームから BALF EVs を集中する遠心の 3 つの繰り返しをかかった。これは 1-1.5 mL 未透過で起因しました。
    5. によって、繰り返しピペッティング優しく 14 ml 滅菌 DPBS の未透過を洗います。30 分、4 ° C での 3,000 x g でフィルター ユニットを遠心分離機、DPBS を削除し、EV 非透過を集中します。
    6. 総回復を確保するため、サイド ・ ツー ・ サイド動きを使用してサンプルを出し入れフィルター デバイスの下部に、pipettor をすることにより、フィルター デバイスから集中 BALF 派生 EVs を収集します。
    7. 因数 BALF 派生 EVs-80 ° C (手順 3. を参照) さらに粒子定量化及び評価のために格納します。
  2. 浮揚性の密度勾配遠心法 (DGC) で遠心 (UC)
    注: 次のプロトコルは、前述のプロトコル24から変更されました。
    1. 2.1.1 のステップから 37 mL 遠心チューブに上清を転送および超遠心機を使用しての 4 ° C で 30 分間、10,000 × g でサンプルを遠心分離します。清と 4 ° C, 60 分で、100,000 × g で遠心分離を収集します。EV のペレットは、遠心分離、ステップ 2.2.3 の浮揚性の密度勾配バッファー (表 1) の異なる濃度を準備します。
    2. 上澄みを廃棄し、200 μ L の DPBS で EV ペレットを再懸濁します。
    3. 50 %iodixanol 作業ソリューション (表 1) の 300 μ L と EV の懸濁液を混合し、15 mL 遠心管にそれを転送します。50% iodixanol EV 混合サスペンション上に順番に層下部から上部への順序で次のバッファー ソリューション: 30 %iodixanol (4.5 mL) iodixanol (3 mL)、15 %iodixanol (2.5 mL)、および 5 %iodixanol (6 mL) の 25%。230 分の 4 ° C で、100,000 × g で遠心します。
      注: 浮揚性の密度勾配が下部上部に最低濃度 (5%) に最高濃度 (50%) とスケーリング iodixanol の割合に基づいています。Iodixanol の異なる濃度を生成するには、実用的なソリューション (50 %iodixanol) 混ぜ均質媒体 (表 1) の様々 な量。
    4. 15% と 25% の割合を収集し、15 mL にボリューム アップさせる滅菌 DPBS でそれらを希釈します。新しい小型超遠心機チューブと 60 分のための 4 ° C で、100,000 × g で遠心分離機に転送します。
    5. 上澄みを廃棄し、さらに特性評価のための滅菌の DPBS の 50 μ L で EV ペレットを再懸濁します。

3. 細胞小胞の定量化

注: BALF 派生 EVs 回復収量は 2 つの指標を量的に表わされます。

  1. ナノ粒子追跡測定分析 (国税庁)
    1. 1: 200 で EV サンプルを希釈-DPBS と負荷インスリン注射器にサンプルの 1 mL の 1: 500。サンプル シリンジをシリンジ ポンプに接続し、粒子数とサイズ (材料の表を参照) を測定し始めます。
    2. すべてのサンプルの測定を 1 14 と検出のしきい値でカメラのレベルを設定します。30 で 1,500 フレームの反復測定値 5 s は 20 の遅延で、各サンプルの記録された読み取りの間 s。組み合わせて、最終濃度とサイズの報告のデータを平均します。
      注: 正確なすべての粒子をキャプチャするすべての粒子を視覚化し、同様の設定を使用して、各実験ではすべてのサンプル測定のために適切なカメラのレベルを調整します。
  2. プロテインの定量
    注: ビシンコニン酸 (BCA) の蛋白質の試金は BALF から派生した EVs のタンパク質濃度の測定に使用されました。
    1. 1 x 換散バッファーの EV サンプルを可溶化します。
    2. 560 で吸光度を測定することにより比色検出を使用して BCA 標準プロトコルごと BALF から派生した EVs の蛋白質の量を定量化するプレート リーダーで nm。

4. BALF 由来細胞の小胞の検出

注: 通称エキソソーム表面のマーカー蛋白質 (TSG101 や CD63、CD81、CD9) SDS ページとイムノブロットおよび流れの cytometry による EV のリカバリを確認する使用されました。

  1. SDS-PAGE および免疫ブロット
    1. あぶらとり読み込みバッファー (リチウム dodecyl 硫酸塩) と 1.6 mL チューブの 50 mM ジチオトレイトール (DTT) で各サンプルの EV 蛋白質の同量を溶解します。70 ° c 10 分のサンプルを加熱します。
    2. 4-12% に加えて、Bis トリス アクリルアミドゲル ステップイン 4.1.1 からサンプルをロードし、電気泳動の実行 (150 v、35 mA) 35 分。
    3. 乾式転写法による硝酸セルロースの膜に蛋白質を転送します。
    4. 60 分、常温 (RT) ロッキング 5% スキムミルクと膜をブロックします。
    5. 5 %bsa でトリス緩衝生理食塩水トゥイーン 20 (TBST) 一晩揺動、4 ° c で 1: 500 希釈で EV 表面タンパク質マーカー、腫瘍感受性遺伝子 101 (TSG101) への抗体と膜を孵化させなさい。
    6. 次の日、洗って膜 3 x、10 分それぞれ TBST バッファーで洗うし、反ウサギ IgG、室温 60 分 1:5,000 希釈で、HRP リンク抗体とインキュベート
    7. 3 膜を洗浄する x、10 分 TBST バッファーで、それぞれを洗います。化学発光 HRP 抗体検出試薬とイメージ (イメージング システムの材料の表を参照) を持つ膜を開発します。
  2. フローサイトメトリー
    1. BALF から派生した EVs の能の両面染色バッファー (PBS + 5 mM EDTA + 0.5 %bsa、0.1 μ m のシリンジ フィルター膜濾過) 49 μ L で希釈します。
    2. それぞれの個々 のサンプルに次の抗体の各追加: 1) ラット抗マウス PE CD63 抗体 (100 ng の反応あたり);2) ラット抗マウス PE CD81 (500 ng);3) ラット抗マウス FITC CD9 (200 ng)。暗闇の中で 60 分間揺動、4 ° C で孵化させなさい。
    3. 染色バッファー膜フィルターの能の両面の 450 μ L のサンプルを希釈し、フローサイトメトリー解析のサンプルを対象 (材料の表を参照)25。
    4. 次のように流れの cytometer 設定を調整する: 1) ハイパー ログ (hlog); すべてのチャンネルを設定2) セット 4; で SSC のトリガー3) セカンダリ トリガーをオフにします。低速設定でサンプルを実行し、各サンプルの少なくとも 10,000 のイベントを取得します。
    5. 解析ソフトウェアを使用して各サンプルの低フローサイトメトリー分析を実行 (材料の表を参照してください)。

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結果

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マウス BALF から EV 分離を行った同じ日に UFC と UC DGC の分離方法を使用して。UFC メソッドは、UC DGC テクニック必要な処理時間の 8 時間に対し、約 2.5-3 h を必要しました。これはバッファーと試薬の準備時間を含んでいませんでした。遠心分離の長い期間の間にいくつか他のタスクを実行できる可能性がありますをそれに留意されたいです。それにもかかわらず、全体の手順は、ほぼ UC DGC 分離技術の全体の日続いた。

UFC 法による分離された通常のマウスからの EVs の BALF の派生には、小さいサイズと UC DGC EVs (176.7 ± 7.8 nM、図 1 b) と比較して、均一サイズ分布 (148.8 ± 1.1 nM、図 1 a) が表示されます。UFC テクニックあった深遠な 65-fo...

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ディスカッション

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過去数十年間、科学者は生体のホメオスタシスの EVs の意義を解明しています。EVs がその生理活性貨物分子1,21,22,26,27を近隣や遠くの細胞を調節することによって多くの病気プロセスに大きな役割を果すより重要なは、,28,29,30未来の開発し、この分野の進歩は深く信頼性に頼ると識別し分離だけでなく効果的な方法 EV 人口のサブセットを修正がまた下位アプリケーションにその生物学的機能を維持する。10,

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

仕事をサポートするには、(PC) へ NHLBI/NIH 助成金 HL103868 と HL137076 (PC) へ、(PC の場合) にアメリカ心臓協会費と (パソコン) にサミュエル ・ オシン包括的がん研究所 (SOCCI) 肺がん研究賞を受賞。EV ナノ粒子追跡の分析のための Nanosight マシンを提供してくれますヒマラヤスギ シナイ医療センターで Smidt 心研究所に大感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Material
Amicon Ultra-15遠心フィルターUltracel-100Kシグマミリポア、セントルイス、ミズーリ州UFC910024
ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水(DPBS)コーニングセルグロ、マナッサス、VA21-031-CV
ショ糖シグマミリポア、セントルイス、ミズーリEMD8550
HEPESResearch Products International、Prospect、IL75277-39-3
EDTACorning Cellgro、Manassas、VA46-034-CI
塩化ナトリウムSigma-Millipore、セントルイス、ミズーリS3014-1KG
OptiPrepSigma-Millipore、セントルイス、ミズーリMKCD9753密度勾配中ケ
タミンVetOne、ボイジー、ID13985-702-10
XylazineAkorn Animal Health, Lake Forest, IL59399-110-20
Syringe 1 mLBD Syringe, Franklin Lakes, NJ309656
Angiocatheter 20 GBD Syringe, Franklin Lakes, NJ381703
Centrifuge tubes 15 mLVWR, Radnor, PA89039-666
Centrifuge tubes 50 mLCorning Cellgro, Manassas, VA430828
ビシンコン酸(BCA)タンパク質アッセイPierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL23235
Rabbit anti-mouse TSG101 AntibodyAbCam, Cambridge, MAAB125011
ラット抗マウスPE-CD63Biolegend, San Diego, CA143904
CD81
CD9
Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibodyCell Signaling Technology, Danvers, MA7074S
4x LDS
10x Reducing agent (Bolt)
10x Lysis buffer (Bolt)Cell Signaling Technology, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gelInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MANW04120
iBlot 2 Nitrocellulose mini stacksInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAIB23002
化学発光HRP抗体検出試薬 HyGLODenville Scientific, Holliston, MAE2400
超遠心チューブ 17 mLBeckman Coulter, Pasadena, CA337986
超遠心チューブ 38.5 mLBeckman Coulter, Pasadena, CA326823
Corning SFCA シリンジフィルター 0.2 µm poreThermo Fisher Scientific, Waltham, MA09-754-13
Equipment
CentrifugeEppendorf, Hamburg,Germany-Ultracentrifuge
Beckman Coulter, Pasadena,CA-Nanosight
(NS300)Malvern, Worcestershire, UK-粒度分布を測定するため粒子濃度
MACSQuant Analyzer 10 フローサイトメーターMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,Germany-iBlot
Transfer ApparatusThermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad
ChemiDoc MP Imaging SystemBio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10解析ソフトウェア
州州 州 抗体

参考文献

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