シリアル イメージの肥大と膜間距離を定量化

Summary

このアルゴリズムの目的は、シリアルのイメージの肥大と経路探索機能を使用して 2 次元の 2 つのエッジ間の距離を連続的に測定することです。このアルゴリズムは、さまざまな心臓の構造生物学、血管生物学、土木工学などの分野に適用できます。

Abstract

Perinexus と呼ばれる、最近説明細胞ナノドメインは心筋細胞間の電気伝導のための代替メカニズムである ephaptic、結合に関与しています。手動分割によるこの空間を定量化するための現在の方法は低速で、低空間分解能。我々 は 2 つの向かい合う 2 つの次元のエッジの間のピクセル数をカウントするバイナリの概要のシリアル画像不整を使用してアルゴリズムを開発しました。このアルゴリズムは、人の少ない時間を必要とする、手動プロセスの再現性を維持しながら手動メソッドよりも高い空間分解能をします。実際、経験し、初心者捜査官らはこの新しいアルゴリズムと以前の研究の結果を要約することができます。アルゴリズムは、perinexus を手動でアウトラインに必要な人間の入力、既存の経路探索アルゴリズムによって妨げ主に計算能力によって制限されます。ただし、アルゴリズムの高スループット機能、高分解能、再現性を越えてそれを作る用の汎用性と堅牢な測定ツール (2 D を 2 次元の間の距離の測定を必要とするアプリケーションの様々 な) エッジ。

Introduction

次のアルゴリズムは perinexus¹と呼ばれるナノドメインのギャップ接合プラークの端に区別点で構造的に結合された心筋細胞 2 つ間膜間の距離を測定するため開発されました。ephaptic^2,3,4、5の結合に関与しています。Perinexal の幅を高いサンプリング スループット メソッドの識別された必要性何百もの以前の研究⁶でマニュアルでのセグメンテーション法 perinexi の透過電子顕微鏡 (TEM) 像を分析する過程で空間分解能手動分割中に以前のマニュアルでのセグメンテーションのプロセスの精度を維持しながら中心線に直交約 15 nm 間隔で線を描画 perinexal の幅を測定するために。新しいアルゴリズムは、2 つの平行線の 1 ピクセルの太い、バイナリの輪郭を受け取り、シリアル イメージ拡張を使用して、2 つの膜の間のピクセル数をカウントします。イメージの肥大が無数のイメージ処理アプリケーションで広く使われて、輪郭やエッジ検出^7,8, このアルゴリズムを含むと、カウントのメカニズムとして、不整に使用します。中心線は孤立した経路探索アルゴリズムの⁹と perinexal の幅を使用してイメージの解像度に perinexus の長さに沿って解像度でそれから測定されます。解像度の違いはこの場合は 15 あたり 1 測定マニュアルでのセグメンテーションの 1 測定につき 0.34 nm nm 新しいアルゴリズムで、空間のサンプリング周波数の 44-fold 増加。さらに、手動分割のために必要な時間にこのサンプリング頻度の増加は約 1/5^thで行います。

従来の 0-150 で perinexal の幅を測定する現在の形態でこのアルゴリズムが使用されます、perinexus が 30 と 105 nm²間高原、関心の特定の領域内だけでなく、ギャップ接合プラーク⁵ (GJ) の端から nm^,3,10. サンプリング頻度の増加は、手動分割に比べて個々 の perinexus の測定値のばらつきを低減や、大量データの効率的な処理を可能にする分析時間の大幅短縮により。ただし、このプログラムは心臓インターカ レート ディスクのナノスケール電子顕微鏡画像に限定ではありません。同じアプローチは、血管径、心室駆出率や川の浸食や洪水なども非生物学的現象を定量化するされる可能性があります。このアルゴリズムは、任意の 2 つの擬似並列エッジ間の距離を定量化に適しています。

Protocol

注: ソフトウェア必要 ImageJ (または同じようなイメージを変更するソフトウェア) と Matlab R2015。ユーザーは、Matlab の他のバージョンとの互換性の問題を発生ことがあります。

1 処理前画像

1. 任意のグレースケール画像を確認任意の特定のピクセルの最大強度の値が < 255。補足ファイル S1 に含まれているカスタム Matlab プログラム"ImageSub.m"のイメージから 1 の値を減算してこれは通常です。

2. アウトライン、Perinexus

1. ImageJ や他の画像処理ソフトウェア perinexus を概説します。
2. 概要 1 ピクセルの厚さは、イメージ (0 から 255 のグレースケール イメージで 255) で最高強度の値に設定されてことを確認します。
3. その pentalaminar 構造^11,で¹²GJ を識別し、図 1のAに示すように、細胞膜脂質に反対 2 分岐、ポイントとして、perinexus の先頭を定義します。最初のセルの内側の膜と 2 番目のセルの内膜に沿って戻るをトレース、GJ のエッジから開始 ~ 200 nm。ImageJ、アウトラインを自動的に閉じるペンを離します。この人工閉鎖後でトリミングされます。
   注: アウトラインの小さくても誤アプリケーション数ナノメートル最終測定における誤差の発生する、可能な限り倍率高としての細心の注意と perinexus をアウトラインすることが重要です。

3. アルゴリズムと Perinexus の興味の選択の設定

注: 経路探索アルゴリズム MembraneSepDist m ファイルと同じディレクトリにするサイン、エッジ、グラフ、ノード、および経路探索用関数⁹が必要です。補足ファイル S1 内のすべてのファイルを見つけることが。

1. データと数字の場所を保存を選択します。M ファイルに現在ハードコーディングです。
   注: プログラムの最初の行は、すべての変数を消去し、すべてのウィンドウを閉じるコマンド ウィンドウのクリア機能です。M ファイルを実行する前にすべての必要な変数または数字を保存します。
   注: ソフトウェアのスクリーン ショットは、すべてハードコード値の補足ファイル S2 に含まれます。
2. "MembraneSepDist.m"プログラムを実行します。
3. パラメーターを設定します。
   注: GUI はグラデーションのしきい値、スケール、利子および手動起動の領域の既定のパラメーターをポップアップします。M ファイルで既定値を変更できます、または各イメージのため変更することができます。
   1. 空間微分勾配閾値を設定します。
      注: 高い値は中心線分離の選択より多くのポイントになります。高すぎたり (約 3.0 7.9 の範囲) の外低すぎる値計算の非効率性または不正確な中心線分離 (参照してください図 2の C) を降伏中心点の不正確な選択可能性があります。
   2. ピクセル/スケール単位のスケールを設定します。
   3. 関心領域の空間の下限と上限の制限を設定します。
      注: 当研究室の慣例では、関心の特定の領域は GJ^2,3,10の端から 30 と 105 nm の間です。
   4. 自動/手動の開始を設定します。ほとんどの場合、アルゴリズムは正確にギャップ接合が終了し、perinexus を開始する開始点を検出します。ただし、不規則な形の perinexi のいくつかのケースでユーザーでは開始点を手動で識別する必要があります。この値を設定すると、自動の場合は 0、マニュアルの 1。
4. 目的のイメージを選択します。
   注: m ファイルのフォルダー、ファイルの選択を変更できます。
5. 興味の perinexus を選択する画像をトリミングします。
   1. 画像が表示されたら、カーソルに十字型に変更されます。興味 (参照してください図 3) の perinexus の周りにボックスをドラッグして画像をトリミングします。トリミング ボックスは、四隅と各辺に大きくまたは小さくする正方形を使用して調整できます。
   2. トリミングするとき、perinexus の「開いている」終わりを確保 (GJ から最も遠い図 3参照) トリミング、トリミングされた画像端に達する 2 つ膜の概要。
      注: より簡単に興味の perinexus を参照してくださいして、適切にトリミングする画像全画面表示をすることをお勧めします。
6. 測定する反対のエッジの間にカーソルをダブルクリックすると、最後の作物を選択します。
   注: perinexus 内部ダブルクリックを実行することが重要です。プログラムは、中心線を識別するために失敗した場合、プログラムを再起動し、perinexus 内でクリックが発生したかどうかを確認します。
7. すべての肥大とびらん後最終的なセンターライン観察プログラムの有効性の最終的なユーザー評価のためにポップ。
   注:、Matlab は、プログラムが終了するまで、追加のコマンドを処理することができなくなりますをユーザーに通知する、プログラムの実行中] ダイアログ ボックスが画面に表示されます。このプロセスの所要時間は、配列 (イメージ) のサイズとコンピューターの処理能力によって異なります。
8. 場合は手動での開始ポイントを有効にすると、中心線のイメージ ポップアップにわたって観察十字カーソルと共に元の解剖学的画像 (図 2E参照)。目的の開始点近傍の perinexus の外のポイントを選択します。
   注: プログラム選択したピクセルに最も近い中心線の場所を検索し、開始点として使用します。
9. データを記録します。
   注意: プログラムが終わったら、プログラムを返しますマップされた中心線、GJ の端からの距離の関数としての perinexal 幅のプロット。さらに、プログラムは、150 まで平均 perinexal 幅に戻りますから Matlab コマンド ・ ラインで関心の特定の領域内の平均と同様、GJ の端から nm。W_p値と、GJ からの距離を変数"WpList"に格納または、ユーザーは手動で個別にそれらを記録できます。

4 アルゴリズムのトラブルシューティング

1. 中心線が適切でない場合識別された (図 2A) は図"Gmag"を開き、適切な勾配しきい値 (図 2C) を識別するためにインデックスを使用します。
2. 開始点を正しく識別されない場合は、手動で開始ポイントを設定 (プロトコル 3.8 を参照してください)。

Results

統計的手法:スチューデント t-検定を用いた実験群間比較を行った。P 値 < 0.05 は重要と見なされ、すべての値は、平均 ± 標準偏差として表されます。

マニュアルでのセグメンテーション。GJ 隣接 perinexus ナノドメイン幅 (W_p) の定量化は、マニュアルでのセグメンテーションによって行われます通常。このマニュアルでのセグメンテーションのプロセス図 1Aで例示されていて⁶で説明しました。オブザーバー GJ (図 1、赤ドット) のエッジを識別、perinexus の中心に沿って 5 nm を測定し、その時点で膜間距離を測定します。10、15、30、およびすべての 15 で繰り返すし、最大 150 nm nm。この技術は、効果的には、時間と空間のアンダー サンプリング、perinexus の長さに沿っての制限があります。

前の調査からの W_p測定によって異なります約 20 nm^2,3、1010 と 3 を意味する nm は、平均値の差は、統計的有意性を検出するために必要と思われる、0.7 のナイキスト周波数測定あたり nm ベース 0.34 の interpixel 解像度 nm。したがって、マニュアルでのセグメンテーションは時間がかかるが、メソッドは介入や病気の状態に関連付けられた W_pの違いを測定するのに十分です。

シリアル画像不整。適切な空間分解能を持つ高速、再現可能な方法で、perinexus を測定するために図 1B で見ることができる 2 つの手動でトレース膜間のピクセル数をカウントするシリアル イメージ膨張に基づくプログラムを開発しました。.

シリアル拡張プロセスを図 4に示します。バイナリ イメージの拡張として (図 4 a-4D)、拡張は、反転し、作業イメージ - 元のアウトライン (図 4E-4 H) の非バイナリ フォームに追加します。アウトラインが完全に満ちて (図 4D) になるまで繰り返します。この時点で、最終的な作業イメージ (図 4H) は特定のピクセルが非拡張残っている回数のカウントです。ですから、細胞膜の輪郭に近い値が非常に低く、中心に値が高い。各ポイントで領域を埋めるための肥大の数を数えることによって膜エッジ間の距離を計算できます。次の課題は識別する最終的な作業のイメージを空間微分を適用して行われている GJ からの距離の関数として perinexal 幅を定量化するために中心線を分離する (図 2-最後の画像と図 5 A)。補足ファイル S3 より不規則な形をした perinexus の 2 番目の例を見つけることが。

中心線識別します。最終的な作業イメージのグラデーションは、エッジからエッジまでの値をもう一度 (図 5A左右から) に低高高から変更拡張数と空間微分による定量化できます。空間微分 (図 5B) の大きさのみを考慮した概要と白い矢印で強調表示され、中心線が不連続な部分としてすぐに識別。これらの場所で増加する減少またはその逆からグラデーションの方向を変更します。中心線、輪郭のバイナリ イメージを生成するしきい値 (図 5C) を適用して (図 5D) の分離のセンターラインを生成元のアウトラインを引きます。中心線を分離するこの方法は計算効率のよい、空間微分に適用されるしきい値は結果の中心線のギャップを作成します。GJ からの距離の正確な測定を提供し、perinexus はそのままの状態で測定できるように、これらの隙間 (図 5D、挿入) する必要があります。続いて侵食 (図 5F) と"bwmorph"関数 (図 5E) のギャップを埋めるため、センターラインを拡張する最初に、(操作 = 'skel' n inf を =) を残しながら、できるだけ多くのポイントを除去するために、連続センターライン、Wasit Limprasert によって開発され、MATLAB 中央⁹で入手可能それ以降の経路探索アルゴリズムの計算効率を高めます。この膨張収縮機能は最終的な作業イメージ (図 5G) を組み合わせて完成した線が生成されます。しかし、この中心線は厚いピクセル以上で、多くの場合、中心線の正確な分離はないため。

Wasit Limprasert 経路探索アルゴリズムは、perinexus の中心線を決定するためです。経路探索アルゴリズムは最高値 - この場合は残った (図 5G、挿入) 中心線に沿って最も反復非拡張センターに最も近い値を追跡することです。結果は、図 6に示すように、中心線の自動トレースです。中心線を分離することによって、perinexal 幅は、GJ、図 6B (上) のようにの端からの距離の関数として、または関心の特定の領域の平均の幅として表示できます。

カーネル分析します。デジタル画像は正方形アレイに基づく拡張カーネルは正方行列に同様に基づいていることに注意することが重要です。これは対角線にわたって拡張距離が直交より大きいことを意味します。したがって、我々 は次にカーネルにアルゴリズムの結果が影響を受けるかどうかを決定ましょう。カーネルに固有の変動性を定量化するために 5 つの異なるカーネルの形を分析した:「プラス」(上記の分析で使用される形状)、"X"、"ボックス"で、"行"、図 7で説明したよう。カーネルは、バイナリ イメージの各非ゼロのポイントで適用されます。図 7Aのそれぞれのカーネルの星では、中心、ホワイト 1 の値ですし、黒は拡張カーネルの場合は 0 の値を表します。

各カーネルの影響 (図 7B、トップ) 単一の水平約 perinexal イメージの平均の W_p測定経験豊富なユーザーによって定量化、Matlab の"imrotate"コマンドで画像を回転させることにより決定されたとコンピューティング W_pを 10 ° ステップで。W_p測定値 (図 7B下)に加えてカーネルを形に正弦波整流的イメージの方向で変動します。比較的まっすぐ perinexus は、垂直方向または水平方向に指向の場合は、値の小さい方になります。X、ボックスもラインのカーネルは、十字型カーネル上の任意の利点を提供します。Xとボックスのカーネルと同じ結果、しかしの値意味 W_pされた th_eの位相ずれに 45 °プラスカーネル。ラインのカーネルは、画像回転未満 30 以上 145 ° の緑のトレース データの欠如で見ることができる特定の角度で画像を完全に拡張に失敗しました。したがって、直交プラス拡張カーネル過大評価膜分離斜め約 45 ° で、例えば指向軸と perinexus を拡張とX ボックスのカーネル過小評価平均 W_p、perinexus の長い軸が 45 ° にもあったとき。この分析に基づいて、プラスの形をしたカーネルと拡張から生成された値に適用される補正係数を開発しました。イメージの方向、イメージ (式 1) の方向に応じて測定幅値で乗算この補正係数に関連付けられている分離膜の過大評価のために。

場合 θ < 45 °
     W_{p 修正} cosd(θ) = * W_{p 測定}
場合 θ ≥45 °
     W_{p 修正} cosd(θ) = * W_{p 測定}(式 1)

この方程式 W_p測定は上記のアルゴリズムと θ によって生成された元の W_p値は水平、角度から計算された角度します。Θ は、perinexal 中心線の鉛直方向の変化量で割った値の水平方向の変化量の逆タンジェントを撮影したものです。上記の補正に近い、perinexus の水平を基準にして、平均の角度 (図 8A左上) あたかも水平 perinexus から得られる測定結果と (図 8A左下)。この方程式の背後にある理論的根拠は、十字型カーネル (図 7A) は本質的に 2 つライン状のカーネル互いに直交配置であるという事実から来ています。など、下 45 ° (水平に近い)、肥大が垂直方向に発生して、正確な測定を与えるため角度のコサイン掛けて。逆に、角度 45 ° (垂直に近い)、不整上発生水平方向にし、サインを使用して正確な測定を決定します。正確に 45 ° の正弦と余弦が等しいです。補足ファイル S4 は、この概念の描写を提供します。この補正は角度の平均値に基づいて大幅に非線形図形を解析するときに注意を使用する必要がありますに注意してください。このプロセスは 20 のランダムに選択された perinexi の繰り返された、修正された測定は手動で回転、画像 (図 8A右) の再分析によって得られる測定と強く相関します。画像の向きの正確な補正を確認するには、ファントム エッジの 2 つのセットが生成された (図 8B、左) と 180 ° 回転させる。三角関数の補正アルゴリズムは正確に空間解像度や画像サイズ (図 8B右) に関係なく、それぞれの方向で正しい値を返しました。

分析アプリケーションと再現性方向に修正します。統計的に有意なマニュアルでのセグメンテーションのレポートを使った過去の研究が意味の W_pの違いより大きいまたは 3 に等しい呼び戻す nm、アルゴリズムを可能性がありますを使用して前の調査結果を要約する使用かどうかを判断することが重要だ、完全なデータセットです。2 つのオブザーバー - 新しいアルゴリズムを使用して経験し、perinexal 分析未経験 (観測 1 と観測 2 それぞれ)-12 房と診断された人の患者が含まれて以前の研究⁶から同じ画像を分析細動 (AF) 組織の採取と既存 AF (AF) を持っていなかった 29 患者の前に。経験豊富なユーザーことがわかった W_pよりも AF AF なし患者のかなり広い (21.9±2.5 および 18.4±2.0 の nm それぞれ、図 9A)。補正係数の適用をこれらの値は以前これらの報告に似ています (24.4±2.2 nm、20.7±2.4 nm、それぞれ)⁶。重要なは、経験の浅いユーザーは同じ有意差を発見した (22.1±2.8 nm、20.1±2.6 nm、それぞれ) 自動化されたプログラムと病気の状態の間。さらに、W_p値の標準偏差は 2-3 nm の標準偏差がアルゴリズムが構造の人工物を示す補正係数を変更しなかった自体とティッシュの処理。これらの結果は、自動化された手法が先行研究の結果を要約できることを示しています。

重要なは、perinexus は最近定義の構造体を GJ^2,3に隣接する膜分離の絶対値の範囲には、コンセンサスを達していません。外側-膜-する-外膜 GJ 幅は、20 nm¹³以前と推定されている、ので我々 も GJ の幅を測定することによってアルゴリズムの有効性を判断しようとします。両方のオブザーバーは、患者既存 AF (図 9B) の有無の差ギャップ接合幅 (GJW) が見つかりません。AF と非 AF 患者 GJW 絶対値は、経験豊かな観察者と 21.0 ± 3.1 nm と以前報告されているものに似たような経験の浅いオブザーバー 20.0 ± 2.2 nm のそれぞれ 20.5 ± 2.5 nm と 20.3 ± 1.9 nm をあった。

自動アルゴリズムがマニュアルでのセグメンテーションよりデータを分析するより少ない時間を必要かどうかを確認するのに両方および経験の浅いユーザーはタイムを記録 (補足ファイル S5) セット 10 イメージ トレーニングを定量化する必要な。および経験の浅いユーザー減少している解析時間で 4.7 〜 と 8.3 倍それぞれ空間で約 43-fold の増加とマニュアルでのセグメンテーション アプローチに対する自動アルゴリズムを使用して表 1に示します解像度、perinexus に沿って。

アルゴリズムのトラブルシューティングをします。アルゴリズムを実行するときに最も一般的なエラーは、最終的な中心線が画像の端で終了しないときに発生します。このような場合に十分なポイントは失敗し、大きくトリミング領域を選択または空間微分の閾値を上げるユーザー エラー メッセージを生成するプログラムを引き起こしている空間の派生マップから選ばれました。作物は大きいボックスを描画、大幅に経路探索やエッジ検出アルゴリズムを混乱させることができます図の端に近い空間微分変化としていくつかのケースではプログラムの信頼性が向上します。

また、経路探索アルゴリズム (図 2A) 低すぎる特にグラデーションのしきい値がある場合、中心線イメージの端に達した場合でも中心線を正しく識別するために失敗することが可能です。グラデーションのしきい値の設定が高すぎると、計算効率を減少させる経路探索アルゴリズム (図 2B) に組み込まれてより多くの不要なポイントになります。ユーザーは、画像配列の適切なしきい値を決定することができるないかどうか"GMag" (図 2C) プログラムによって生成され、ヘルプ ユーザーしきい値を決定することができます、ワークスペースで見つけることができます。中心線に沿ってポイントを見つけるし、これらの点が選択されていることを確認するには、そのインデックス値をやや上回るしきい値を設定します。特定の例では、適切なしきい値 (図 2C、挿入) ~5.1 上でしょう。

開始点は、perinexus (図 2D) の先頭に到達する失敗することも。この場合、プログラムを再実行、手動起動値を 1 に設定。中心線を分離後、ユーザーは、perinexus 外の点を選択して (図 2E赤の広場) に選択されているピクセルに最も近い中心点を開始点として設定されます。結果は完全中心線 (図 2F) です。

図 1:定量化プロセスの TEM 画像。マニュアルでのセグメンテーションのプロセス (A) には、中心線を推定しながら 12 の個々 の生体計測を実行するユーザーが必要です。(B) の自動のプロセスには、手動、連続、perinexus の概要のトレースが必要です。各画像の赤い点は、GJ のユーザー識別の終わりと、perinexus の始まりを表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

図 2: 中心線のトラブルシューティングします。中心線の識別とその解決策の失敗の主に 2 つのモード: 各イメージは Matlab で配列名が付いた。グラデーションのしきい値がすぎる場合は低 (A, 閾値 0.2) センターライン アルゴリズムは失敗することができます。設定しきい値をあまり大きく (B, しきい値 70) は経路探索アルゴリズムの計算効率を減らすことができます。GMag 配列から適切な勾配しきい値を決定ことができます (C を挿入)。中心線は、perinexus (D) の開始エッジに到達する失敗した場合、ユーザーは手動で開始点を選択する選ぶことができます。「開始点」オプションを開く gui のユーザー 1 に設定後、ポイントの外興味 (E) の perinexus を選択します。最終的な結果は、perinexus (F) の全体を正確に表す中心線をする必要があります。引用 (A-F) のすべてのラベルは、Matlab の変数名に対応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: Perinexus 選択します。Perinexus、青の矢印で示すように、(トリミング ツールが自動的に選択されます) それの周りにボックスをドラッグしてクリックとホールドをトリミングするには。このボックスは、拡大または縮小する辺と四隅に正方形を使用して調整できます。緑の矢印は、「オープン」のままユーザーが確認する必要があります perinexus の端を表すこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: シリアル画像不整。バイナリの概要は繰り返し 1 ピクセルずつ (A-D) に拡張し、後に各作業イメージ (画像 E H の非バイナリ フォーム) に追加。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5:中心線の分離や経路探索。最終的なイメージから空間微分を計算 (A) とその空間微分の大きさ (B) はアウトラインとセンターライン (白い矢印) を分離するために使用します。ユーザー定義のしきい値はアウトラインを示し、中心線し、元のアウトラインを引いてセンターライン (D) が得られます。ただし、しきい値の結果として中心線に欠番 (D - を挿入)。連続中心線を生成するためにセカンダリ拡張はその後経路探索アルゴリズムの計算効率を高めるための二次侵食が続く分離センターライン (E) で実行されます。この侵食されたイメージ (F) は、連続、1 ピクセル厚の中心線の識別を可能にする最終的な作業イメージを組み合わせて (G - を挿入)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 6: 最終的なデータ プレゼンテーション。プログラムは、元の TEM 画像 (A) の上に最終的な概要を出力します。ラインは 0-150 のため緑色に色分けされて nm、関心と赤 150 を超えた領域のためのユーザー定義領域の青い nm。さらに、プログラムは、平均の W_p (それぞれグラフの挿入)、W_pを表す、perinexus と (B) の関心の領域の始点からの距離の関数として同様に色分けされたグラフを出力します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 7: 拡張カーネル形状解析します。拡張カーネル (A) の図形: 中央の星は、拡張のピクセルを表します。白い箱は、プラス、X、ボックスまたは線の形での拡張によって影響を受けるピクセルです。約水平 perinexus (B、トップ、0 ° を示す赤い線) は、0 から 180 ° 10 ° と繰り返し拡張 (B、下) の別のカーネル図形を使用して手順を時計回りに回転だった。プラスと線状のカーネルは、ボックスと X 字のカーネルが 45 ° により、特定の方向で行カーネルで失敗するが同様の結果を生成します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 8: 画像の向き補正します。画像の向きを正しい、perinexus の角度の平均値から計算されますの開始- とエンド-points (A、左、黒い線の始点と終点) の位置。Y 方向 (左、緑線、) に変更のアーク タンジェントは補正角度 θ (左、黄色) x 方向 (左、赤い線、) 利回りの変化によって分かれています。目的は、perinexus のおよそ水平方向にイメージを作成されていた場合と同様、エッジ間の最小距離を与える平均 W_p値を修正、(以下、左)。式 1 で説明されている補正係数の適用は、解析の前に計算される θ によって各 15 ランダムに選択した画像を手動で回転する比較しました。回転イメージの値と修正値が相関 (R² = 0.991、A、右)、イメージの向きに対する有効な補正係数は、式 1 を示します。補正係数が適切なことを確認、2 つの幻は (B, 左) それらの間の既知の距離を完全に並列エッジの生成されました。ファントム 1 とファントム 2 ある 2.833 ピクセルの空間解像度/mm と 71.6 ピクセル/インチ、それぞれ。ブルー ダイヤモンドと B の赤い四角で示すように、右、アルゴリズム正確に計算される、幅 180 ° の画像回転の間で。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 9: アルゴリズム再現。自動プロセスを使用すると、画像の向き補正と、両方および経験の浅いオブザーバー発見 AF、ない AF グループ (A) 先行研究と一致して 2.6 の最小差の検出差 nm。さらに、どちらのオブザーバーは、有意差 GJW (B) を発見しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

	手動	自動
時間 - 観測 1 (s)	205±11	44±14
時間 - 観測 2 (s)	248±18	30±5
空間分解能 (測定/nm)	0.08	3.45

表 1: 手動および自動プロセスの比較。両方 10 イメージ トレーニング セットの手動分割処理を行うよりもアウトラインをトレースするイメージごとのより少ない時間が必要。さらに、自動プロセスがより高いサンプリング周波数、nm あたり 3.45 測定の記録に比べて 1 測定の平均ごとの 12.5 手動プロセスの nm。トレーニング セット画像は、経験豊富なユーザーによって実行されるように、概要と測定補足ファイル S5 で見つけることが。

Discussion

アルゴリズムは、この場合 perinexus^2,3,14の間の膜分離にはバイナリ イメージの 2 つの反対 2D エッジの間のピクセル数をカウントするのにシリアル イメージの肥大を使用します。空間微分および経路探索アルゴリズムは、¹⁵の前に行われているかのように、中心線のギャップを埋めるための二次膨張と侵食並びに続いて、中心線を分離する使用されます。中心線、この場合のエッジ分離の初めから距離の関数として perinexal 幅を表す最終的な拡張数イメージ、GJ の終わりと perinexus¹⁶の最初結合です。

4 つの主要なパラメーターは、プログラムの起動時に GUI でユーザー定義です。

1. グラデーションのしきい値
2. スケール
3. 興味範囲の地域
4. (自動または手動) ポイント選択手法を開始します。

アルゴリズムのエラーの最も一般的なメカニズムは、中心線の経路探索アルゴリズムのエンドポイントを決定する方法は、画像のエッジに到達するための障害です。このような問題を解決するために、ユーザーは手順 3.3.1, 経路探索アルゴリズムで必要な計算時間が長くなります空間の派生イメージからより多くのポイントを選択するプログラムを原因となるグラデーションのしきい値を増やすことができます。そのため、このアルゴリズムでは、計算の速度とセンターラインの整合性の間の妥協が必要です。それは、中心線のすべての点と適切な開始点での空間微分から見出される限り、空間微分のしきい値がありませんエッジ分離計測に及ぼす影響に注意してくださいすることが重要です。

エラーをする場合、関心領域の大半は拡張行列の軸に角度 45 ° 90 ° の手順でカーネルを拡張させるため、拡張値に影響を与えるイメージの方向が表示されます。したがって、拡張カウントできないがあります常にエッジ間のスペースの正確な表現。この制限は三角関数補正係数によって対処されていますが、データセット内のすべての画像が同じ方向に整列されている場合可能性があります無視される可能性が。さらに、断面平面が 2 つの膜を完全に垂直ではないことは可能であると注意を結果の解釈に使用する必要があります。図 9BGJW を使用して、私たちの perinexus 画像が平面内を示唆します。それでも、サンプル サイズの画像間のすべての断面のバリエーションのアカウントに十分に大きいことが不可欠です。さらに、私たち perinexal 幅の測定値は体内のスペースが、このアプローチはいくつかの介入や病気の状態を基準にして perinexal 幅の平均の違いを測定する使用を反映するように解釈しないでください。

現在のアルゴリズムでは、入力としてエッジを手動でトレース概要も必要です。スケールを正しく設定すると、限り、空間分解能がありませんアルゴリズムの測定に及ぼす影響図 6の画像と補足で追加の低解像度画像のさまざまな解像度で示されるようにすることが重要です。ファイル S6。アルゴリズムを向上させる次の手順概要代々 関心の領域を選択することができますツールと共に人間の介入が削除されます。これらの機能は、測定の精度を高めるし、ユーザー バイアスを減らすだろう可能性が高い。

この計算のアルゴリズムは、約 5 分の 1、工数、マニュアルでのセグメンテーションのプロセスと比較した場合の再現性に検出可能なペナルティなしで perinexus を定量化を必要とするより高速なメソッドを提供します。さらに、マニュアルでのセグメンテーションのプロセスは 1 つの測定 perinexal 幅その 15 nm の範囲内で、perinexus の膜分離が大幅に変わる可能性がサンプリングの下につながる可能性を定量化するすべての 15 ナノメートルを利用しています。一方、自動プログラムには空間分解能イメージング法、perinexal 幅のより細かく解決平均を提供するため、perinexus の長さに沿ってナノメートルあたりここで 2.9 ピクセルに等しい。

心臓の構造生物学の分野への応用が有望でエキサイティングなこのアルゴリズムの使用を TEM 像に限定されていません。このアルゴリズムの使用、フィールドを必要とする 2 つの擬似並列 2 D エッジの高精度、高分解能測定が行うことができます。アルゴリズムは、明視野観察や蛍光顕微鏡による血管の開発する衛星画像から川岸の浸食や洪水パターンから何かを追跡するために使用できます。循環器・ ポイント ・ オブ ・ ケア心エコーで心室駆出率 (EF) 計測の分野で最も有望な潜在的なアプリケーションの 1 つです。現在、標準的な技術は、新しいアルゴリズム、AutoEF は現在最先端の EF 定量化法^18,19ディスク¹⁷、複葉機法です。ディスクの複葉機方法、問題の商工会議所は手動でトレースし、という全体的なボリュームを積み上げ楕円形ディスクの総和で計算自動的に変更されたシンプソンのメソッドを使用して量を示されます。このメソッドの主な制限はない解像度、関心の特定の領域を識別するために、目的の部屋の合計断面積を返すことができますのみも相当な人間の入力と専門知識を必要とすることです。新しいメソッド、AutoEF、識別し、2 D 斑点アルゴリズムを用いた心室の端の概要を説明し、心室の断面積を計算します。このプロセスは、正確かつ効率的な心室の面積を測定しながら合計断面積を計測するだけのような制限があります。この主な欠点は、臨床医の診断および治療の能力を制限します。対照的に、本稿で提示アルゴリズムで、正中線を識別することができます、解像度イメージ投射様相の関心の特定の領域を特定する解像度に。Μ m の空間分解能を持つ超音波スキャナー、市販^20,21, このアルゴリズムが μ m の解像度でローカライズされた壁運動異常を検出できることを意味ために、これは重要です。代わりにセンチメートル。このアプリケーションを実験的に検証する必要がある、このアルゴリズムの最もすぐに有望なアプリケーションの 1 つです。実際に、スペックル追跡 AutoEF の機能と簡単に組み合わせることができるまたは手動トレースが従来の EF のデータと並行して高解像度情報を提供するマニュアルの面積で利用します。

汎用性の高い、現在のアルゴリズムは適用される、2次元画像のため開発されました。しかし、画像処理技術が向上するのにつれ、3 と 4 の D 定量化技術の需要の増加があります。したがって、アルゴリズムの次の反復処理は、同じアプローチは、現在画像処理プログラムの機能を超えて現在は自動的に中心線を定義する、3 次元オブジェクトへのバイナリ イメージを順次拡張を適応することです。このようなアルゴリズムだろう幅広い臨床的および実験的心臓 3 D 心エコー^22,23, 3 D 電子顕微鏡^24,25,を含む単独のフィールドで²⁶, と 3 D 磁気共鳴イメージング^27,28,29。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
タッチスクリーンモニター	Dell	S2240T	ソフトチップスタイラスが必要
デスクトップ	Dell	Precision T1650	8GB RAM
オペレーティングシステム	Microsoft	Windows 7 Enterprise	64ビットOS
プログラムプラットフォーム	Mathworks	Matlab R2015b	プログラムは、新しいバージョンまたは古いバージョンのMatlabと互換性がない場合があります