Method Article

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

DOI:

10.3791/58320

⸱

October 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Chicago, 2The Institute for Biophysical Dynamics, University of Chicago, 3Faculty of Chemistry, Wrocław University of Science and Technology, 4Nikon Instruments Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

従来のエピ蛍光イメージング、分子検出に基づく超解像イメージング、およびマルチカラー単一分子検出を結合、統合された顕微鏡システムの構築の実践的なガイドの紹介など単一分子蛍光共鳴エネルギー移動イメージング、コスト効率の高い方法の 1 つの設定にします。

Abstract

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蛍光顕微鏡は、その場で生体分子の検出し、その動態とリアルタイムの相互作用を監視する強力なツールです。従来のエピ蛍光顕微鏡に加えて様々 なイメージング技術は実験の特定の目標を達成するために発達しました。Å の解像度と単一分子検出に基づく分子間相互作用の構造変化とに報告される単一分子蛍光共鳴エネルギー移動 (smFRET) を含むいくつかの広く使われている技術超解像度 (SR) イメージング、回折限界顕微鏡に比べて twentyfold に空間分解能約 10 を高めることができます。従来エピ蛍光イメージング、分子検出に基づく放射光イメージング、マルチカラー単一分子検出など、1 つの顕微鏡の複数の撮像方法をマージ顧客設計統合システムを紹介します。smFRET イメージングを含みます。光学素子を切り替えることにより、簡単かつ再現性をもってさまざまな撮像方法を実現できます。このセットアップは、ルーチンと多様なイメージング実験コストの削減と建物の個々 の目的別顕微鏡に比べて、領域の必要性と生物科学のすべての研究所によって採用する簡単です。

Introduction

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蛍光顕微鏡は現代生物学研究のための重要なツールであり、蛍光イメージングは多くの生物学研究所で定期的に実行されます。Fluorophores が付いている興味の分子をタグ付け、直接顕微鏡の下で視覚化し、ローカリゼーション、構造、相互作用、およびアセンブリ状態で体内または体外で経時変化を記録できます。従来の蛍光顕微鏡は横方向に 200 ~ 300 nm と 500 ~ 700 nm 軸方向1、2、そして、したがっての 100 s でイメージングに限る回折限界の分解能があります。ナノメートル-ミクロン スケール。分子集合体または組織の細部を明らかにするため、回折限界を破ることができる様々 な SR 系が開発されています。SR を達成するために使用される戦略は、誘導放出の枯渇 (STED) 顕微鏡3,4や構造化照明顕微鏡 (SIM)5,6,などの非線型光学効果7、確率光再建顕微鏡 (嵐)8とセンサー ローカリゼーション顕微鏡 (パーム)

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Protocol

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1. 顕微鏡設計・組立

  1. 励起パス
    注: レーザー、差動干渉の対照 (DIC) のコンポーネント、顕微鏡本体、照明アームに、励起パスが含まれます。
    1. 振動分離光学テーブルを準備します。たとえば、48 × 96 × 12' の構造減衰テーブルは、すべてのコンポーネントの十分なスペースを与えます。
      注: 構築 (例えば、21.4 ± 0.55 ° C) 温度制御付きの部屋の設定です。温度安定性は光学アライメントを維持するために重要です。
    2. 光ファイバー接続用照明アームが装備されている顕微鏡本体をインストール 100 倍油浸型全反射対物レンズと DIC のコンポーネント。
    3. 4 つのレーザー ヘッドを配置 (647 561 nm nm、488 nm、405 nm、図 1 bに囲まれて) 熱光学テーブル上にシンクし、同じ高さとは (例えば良好な安定性を確保するため可能な限り短い放出されるレーザー光あるを確認、' 3')。
      注: レーザー ヘッドは、他のレーザーより短い高さで座っている場合、は、それの下に十分な厚さのアルミ板を置きます。常にヒート ・ シンクと最高の放熱 (図 1 b) の光学テーブル間最大の接触を確認します。レーザーは SR イメージングのために....

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Results

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この顕微鏡では、柔軟性と再現性のあるさまざまなイメージング方法を切り替えることができます。ここで各イメージング モジュールで収集したサンプル画像を紹介します。

図 5は、SR 取得中に点滅に分子の PSF を示します。最終的な SR イメージ (図 5E) を生成する何千ものような画像が再現されます。図 5 eは、図 7Aのエピ蛍光イメージで示すように、同じ細菌規制 Rna を示しています。図 7は、U2OS 哺乳類細胞における大腸菌細胞における小規制 RNA と mRNA の代表的なエピ蛍光画像を示します。両方の Rna は、DNA オリ.......

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Discussion

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このハイブリッド顕微鏡システムには、複数の顕微鏡を購入する必要があります。光学テーブル、テーブル ・ インストレーション、ソフトウェア、およびワークステーションを含む全ての部品の総コストは約 $230,000。マグ レンズと 3 D レンズを含むカスタム加工部品コスト約 $700 (コストは異なる機関で実際の請求によって異なります) です。典型的な市販システムのための統合単一分子検出に基づく SR 顕微鏡コスト以上の $300,000 〜 400,000 と容易に使用できない smFRET 測定、または合理的な視野のエピ イメージング白ライトなしソース。したがって、ここで紹介した方法は、コスト大幅削減で複数の顕微鏡と同等の画像処理機能を実現できます。

この変調顕微鏡システムは、さまざまなメーカーから選べるボディをに基づいてできます。3 D レンズは、排出スプリッター、顕微鏡本体内またはフィルター ホイールと客観的ノーズピースと使用可能な領域を含む排出パス内の任意の位置で潜在的インストールことができます。ただし、3 D レンズの物理的な場所は 3次元イメージングのための最高の非点収差.......

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Disclosures

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著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

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J. f. は、サール学者プログラムおよび NIH のディレクターの新しいイノベーター賞からサポートを認めています。著者は、ポール セルビン ラボ (アーバナ平原イリノイ大学) 3 D レンズを配置するための有用な示唆をご了承ください。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ニコンTi-E顕微鏡スタンドニコンTi-E
対物レンズニコン100X NA 1.49 CFI HP TIRF
顕微鏡イメージングソフトウェアニコンNIS-Elements Advanced Research/HCHCには、SRイメージングに使用されるプログラム取得モジュールである「JOBS」モジュールが含まれています。
イルミネーションアームニコンTi-TIRF-EM 電動イルミネーターユニット M倍率レンズ用のスロットを持つアームです
アナライズブロックニコンTi-Aフィルタータレットに取り付けられています。
Zドリフト補正装置ニコンPFS対物レンズノーズピースにステッピングモーター、IR LED、検出器を搭載するシステムです。
光学テーブルトップTMC783-655-02R
光学テーブルベースTMC14-426-35
647 nm レーザーCobolt90346 (0647-06-01-0120-100)変調レーザーダイオード 647nm 120mW レーザーヘッド、CDRHコントロールボックス、USBケーブル、PSU(電源ユニット)を含む
561 nmレーザーCoherent1280721OBIS 561nm LS 150mW レーザーシステム
488 nmレーザーCobolt90308 (0488-06-01-0060-100)変調レーザー ダイオード 488nm 60mW レーザー ヘッド、CDRH コントロール ボックス、USB ケーブル、PSU (電源ユニット)
を含む 405 nm レーザークリスタライザーDL405-025-O405 (+/-5)nm、25mW、円形、M2 <1.3、低ノイズ、CW、TTL最大20MHz、TTLおよびTTL用BNCコネクタ2個アナログ調整
ヒートシンクCobolt11658(HS-03)2ユニット、ファンHS-03なしヒートシンク、647nmおよび488nmレーザー用ヒートシンクヒート
シンクCoherent1193289Obisヒートシンク、ファン付き、165 x 50 x 50 mm(561 nmレーザー用
CAB-USB-miniUSBCobolt109082ユニット、647 nmおよび488 nmレーザー用通信ケーブル高さ
調整用アルミニウムMcMaster-Carr9146T35多目的 6061 アルミニウム、長方形バー、4MM X 40MM、高さ調整用 561 nm レーザー アルミニウムを上げるための長さ
1 フィート McMaster-Carr8975K248多目的 6061 アルミニウム、厚さ 1-1/4 インチ X 3 インチ 幅 X 1 インチ 405 nm レーザー
BNC ケーブルL-comCC58C-6RG58C 同軸ケーブル、BNC オス / オス、6.0 フィート
BNC アダプターL-comBA1087同軸アダプター、BNCバルクヘッド、接地
SMA-BNCアダプターHODSMA-870Cobolt MLDレーザーはSMAインターフェースを備えているため、このアダプターはBNC接続に使用されます。
SMB-BNCアダプタFairview MicrowaveFMC1638316-12SMBプラグ - BNCメスバルクヘッドケーブル RG316 Coherent Obisレーザ用12インチ同軸
データ収集カードNational InstrumentsPCI-672313ビット、32チャンネル、800 kS/秒 レーザ、DIC LEDなどを制御するためのアナログ出力デバイス
バリアフィルタホイールコントローラサッター計器ラムダ10-B光学フィルタチェンジャー
発光スプリッターCairnOptoSplit III
ダイクロイックビームスプリッターChromaT640LPXR-UF2OptoSplit IIIで赤色発光と緑色発光を分離するダイクロイックビームスプリッター
ChromaT565LPXR-UF2OptoSplit IIIで緑色と赤色の発光を分離するダイクロイックビームスプリッター OptoSplit
III発光フィルターChromaET700/75M2ユニット、OptoSplit IIIの赤色発光用蛍光フィルター(Alexa Fluor 647など)、バリアフィルターホイール
蛍光フィルターChromaET595/50M2ユニット、OptoSplit IIIの黄色/緑色発光(Cy3Bなど)用蛍光フィルター、バリアフィルターホイール
蛍光フィルターChromaET525/50M2つのユニット、青色発光用蛍光フィルター(Alexa Fluor 488 / GFPなど)OptoSplit IIIおよびバリアフィルターホイール
蛍光フィルターSemrockFF02-447 / 60-25紫色発光用蛍光フィルター(DAPI / Alexa Fluor 405など)、バリアフィルターホイール
ダイクロイックビームスプリッターChromazt405 / 488/561/647 / 752rpc-UF3に取り付けられています顕微鏡本体内部の647、561、488、405nmレーザー励起用マルチバンドダイクロイックビームスプリッター
DAPIフィルターセット顕微鏡本体に取り付けられたChroma49000
ニコンレーザー/TIRFフィルターキューブChroma91032
590ロングパスフィルター647nmレーザーと561nmレーザーを組み合わせるためのT590LPXR-UF1
525ロングパスフィルターChromaT525LPXR-UF1、すでに組み合わされた647 nmと561nmのレーザーを488 nmレーザーと組み合わせるための
470ロングパスフィルターT470LPXR-UF1、すでに組み合わせた647 nm、561 nm、488 nmのレーザーと405 nmレーザーを組み合わせるための
レーザークリーンアップフィルター(647)Chromazet640/20x647 nmレーザーから他の波長をクリーンアップするための
クリーンアップフィルター(488)SemrockLL01-488-25488nmレーザーLED
光源ExcelitasX-Cite120LEDDAPIイメージングのみに使用される
ミラーマウントニューポートSU100-F3K
オプティカルポストニューポートPS-2
パワーメーターニューポートPMKITレーザーパワーの測定用
ダイクロイックビームコンバイナーマウントエドモンド・オプティクス58-872Cマウント キネマティックマウント、レーザー励起アセンブリにダイクロイックビームコンバイナーを保持するため
テーニングリングThorlabsCMRRダイクロイックビームコンバイナーマウントに使用
ファイバーアダプタープレートThorlabsSM1FC/PC ファイバーアダプタープレート 外部SM1 (1.035"-40) スレッド
Z軸並進マウントThorlabsSM1ZZ軸トランスレーションマウント、30 mmケージ対応
アクロマティックダブレットレンズThorlabsAC050-008-A-MLØ5 mm、マウントされた無彩色のダブレット、ARコーティング:400 - 700 nm
プレートThorlabsCP1TM0930 mmケージプレート、M9 x 0.5内部ねじ、8-32タップ
ケージアセンブリロッドThorlabsER4アセンブリロッド、4インチロング、&オスラッシュ;6 mm
ケージ取り付けブラケットThorlabsCP02B30 mm ケージ取り付けブラケット
シングルモード光ファイバーThorlabsP5-405BPM-FC-2パッチ ケーブル、PM、FC/PC から FC/APC、405 nm、パンダ、2 m
マルチモード光ファイバーThorlabsM42L01Ø50 マイクロ;m、0.22 NA、FC/PC-FC/PCファイバーパッチケーブル、1 m
アクロマティックダブレットレンズ(マグレンズ)ThorlabsACN127-025-AACN127-025-A - f = -25.0 mm、Ø1/2 "アクロマティックダブレット、ARC:400-700 nm、 "マグレンズ"の凹レンズ"
アクロマティックダブレットレンズ(マグレンズ)ThorlabsAC127-050-Af = 50.0 mm、Ø1/2 "アクロマティックダブレット、ARC:400-700 nm、「マグレンズ」の凸レンズ「マグレンズ」
リテーニングリングThorlabsSM05PRRSM05プラスチックリテーニングリングØ用;1/2インチレンズチューブとマウント、「マグレンズ」用
チップネジThorlabsSS3MN6M3 x 0.5ナイロンチップ止めネジ、長さ6 mm、「3Dレンズ」を保持するため3D
レンズCVIレーザー光学系RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700f = 10 m、長方形シリンドリカルレンズ
EMCCDカメラAndoriXon Ultra 888
100 nmマルチチャンネルビーズサーモT7279、TetraSpeck マイクロスフェア
赤色色素ThermoAlexa Fluor 647
黄緑色色素GE HealthcareCy3
緑色色素GE HealthcareCy3B
青色色素ThermoAlexa Fluor 488
) はものです はものです レーザーから他の波長をクリーンアップするため LEDクランプフォーク ニューポートPS-Fリケージケージナイロン

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
  2. Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
  3. Klar, T. A., Hell, S. W.

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