方法論記事

水銀、カドミウムの検出のための嫌気性バイオ アッセイ

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DOI:

10.3791/58324

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2018年12月17日

 ,  , 
1Department of Biology, University of Ottawa

この記事について

サマリー

ここでは、どのように異なる環境変数を評価する嫌気性の細胞化バイオ センサーを使用するプロトコルを提案無酸素環境で細菌に Hg と Cd のバイオアベイラビリティに影響を与えます。

要約

微生物への水銀 (Hg) のバイオアベイラビリティは、有毒の Hg biomagnification 食物網の重要なステップです。カドミウム (Cd) 変換と細菌にバイオアベイラビリティが主食作物に蓄積量を制御します。これらの金属のバイオアベイラビリティはソリューションでは、しかしより特に水銀は有毒な monomethylmercury (MeHg) にメチル化 Cd が根に続く無酸素条件下での種分化に依存します。全細胞微生物バイオ センサーは、金属細胞質に入るし、金属の生体利用性を評価するために有用なツールしたがっているとき、定量化可能な信号を与えます。残念ながら、バイオセンシングに対するほとんどの取り組みは、酸素の存在下で機能する既存のレポーター蛋白質の機能が制限されるため好気環境に制約されているところ。本研究では, 準リアルタイムで、時間以内無酸素条件下で金属を検出する開発し、全細胞バイオ センサー法で機能を最適化する取り組みを提案します。我々 はバイオ センサーは、バイオアベイラビリティの金属に影響を与える環境のサイクリングに関連するどのように化学変数を評価助けることができる方法について説明します。次のプロトコルには (1) Hg を準備するためのメソッドが含まれています、Cd 規格 (2) 無酸素条件下で酸素、(3) デザインの不在でバイオ センサーを準備し、変数のシリーズが Hg または Cd のバイオアベイラビリティと (4) に与える影響を判断する実験を実行定量化とバイオ センサー データを解釈します。グルコの線形範囲を示し、金属誘導型耐性と構成の両方の系統を用いた金属のバイオアベイラビリティと毒性とを区別するメソッドの機能を示す例を提供します。

概要

水銀 (Hg) が地球汚染物質と微生物をメチル化 Hg に、バイオアベイラビリティは食物網とその人間に可能な神経毒性影響と野生生物1を介してその biomagnification への第一歩。その微生物の水銀のメチル化は必要とする細胞内のプロセスが現在考えられる: i) bioavailable2,3,4,5,6,7 Hg の種、ii) 生理 Hg8,9,10をメチル化できる細胞のため。生物、カドミウム (Cd) bioaccumulates が foodwebs で biomagnifies しないのは、人々 と環境11急性暴露を原因として一般的な産業および商業プロセスで広く使用されています。微生物は環境に Hg の運命のいくつかの重要な役割を再生、Cd 地球化学や生態毒性に関するほとんどの研究微生物真核生物12に焦点を当てます。農作物 (米など) の消費量はカドミウム; への直接暴露の主な情報源です。この場合、根圏の微生物への Cd のバイオアベイラビリティに直接影響量の植物は13を蓄積することができます。

Hg 輸送経路は複雑であり、おそらく能動輸送ステップ14を含みます。最近仕事が HgIIが、Zn を使用することを提案した、トランスポーターが関与しているIIまたは MnIIトランスポーター7,15,16,17。CdIIは、誤って運ばれる仮定される一方二価金属輸送経路 (特に MnIIまたは ZnII) を介して細胞質に CdIIのメカニズム輸送中セルのまま投機的なおよびない Cd 固有の輸送経路は、識別された13,18をされています。トランスポーターの関与によらず、3 つの機械的要因は、最終的にセルに入力する金属の能力を決定する: ソリューション2,6,15, i) 重金属のスペシエーション16,17,19,20,21,22,23ii) 細胞膜17,24,25,26,27,28,29 biophysiochemical プロパティ ,30,31, および iii) 金属輸送サイト7,32にアクセスするための能力。(例えばEDTA)、汚染物質をキレート減らしたり硫黄鎖33、Cd、Hg は高親和性の溶存有機物 (DOM)、起因微生物生理学的条件下で無料のイオンとして存在する可能性が高い 34,35 (CdIIは、無料イオンまたはイオン対これらの ligands の不在として存在できます)。どのようにこれらの金属種が環境で彼らの運命に関連する条件の下で bioavailable を決定する効率的な方法が無い。例えば、Hg は嫌気条件14、下でメチル化、カドミウムと水銀が、種分化を還元型硫黄グループの整合性を維持する条件の下で調査することを必要とする軟質金属 (またはクラス B の陽イオン)。

微生物バイオ センサーは、この場合 Hg または Cd、金属の細胞内の濃度の応答で定量化可能なシグナルを出す細菌のセルです。な露出条件は、慎重に制御される金属が36セルを入力する方法を理解するための理想的なツールがあります。Hg バイオ センサーには通常merの調節の回路間融合遺伝子が含まれて-オペロン (含む遺伝子転写レギュレータ MerRas の演算子やプロモーターとしてよくオペロンの領域)、および遺伝子を報告 (などルクス、gfp、lac遺伝子)。水銀が細胞質に存在するダイズ、レポート遺伝子とその後の信号生産19,37の転写の結果にバインドします。特定の Cd バイオ センサー、通常cadCを使用して設計されていますcadAC、zntAまたはzntRエンコード転写レギュレータ38, しかし、ダイズが Cd5に低く、まだ定量化可能な親和性を持っていることは注目に値するです。ほとんどの好気性の制限により最近微生物バイオ センサーが残る無酸素条件下での金属の生体内変化についての洞察を提供することができないまで、通常発光や蛍光レポーター蛋白質を使用されます。これは、金属バイオアベイラビリティの嫌気性の検出が非常に困難条件の範囲で特に酸化還元 (例えば、硫化物とチオール) 敏感な配位子4,の存在下での彼らの環境運命に関連します。5,39。

軽減するための方法論的ハードル ライブ イメージング、Drepperらの酸素の不在で(2007 年) P. putidaから SB2 タンパク質の光酸素電圧ドメインに基づいて、フラビン ベースの蛍光蛋白質 (FbFp) を開発。このタンパク質ファミリーは酸素40の不在で蛍光を発することができます。建物 Drepperらの仕事は、私たちの研究室は Hg バイオアベイラビリティと塩分17の広い範囲にわたって好気、無酸素条件下での研究を可能にする嫌気性バイオ センサーを設計されています。現在の紙の準備および Hg または Cd のバイオアベイラビリティに影響を環境変数をテストするのには、バイオ センサーを使用する方法をについて説明します。バイオ センサーも共同環境で発生する可能性のある複数のストレスに応答するという事実に読者の注意を引くための手段として CdIIで実験を行うことにしました HgIIのバイオ センサーを開発しましたが行列;この場合 CdII転写レギュレータ ダイズ5にバインドする知られているために調べた。ここでは、代表的な校正といずれかの金属に関して線形機能の範囲を示します。我々 はまた与える例をバイオ センサーの結果は、決定的な (MgIIと MnII Hg バイオアベイラビリティ) と結論 (ZnII Hg バイオアベイラビリティ)。

プロトコル

1. 成長の媒体および露出メディアの準備

  1. 250 mL の成長培地を作るため。
    注:微量元素 #1 ソリューションと微量元素 #2 ソリューションはすでに準備ができて場合、は、1.1.5 のステップに進みます。
    1. 1.5 x 10-3 M Na2MoO4, 6.5 × 10-4 M Na2SeO45 x 10-3 M H3ボーの最終的なモルを含むクリーン メスフラスコ (200 mL) の微量元素 #1 ソリューションを準備します。3、および 0.1 M 水酸化ナトリウム。
      注意: 強アルカリ (NaOH)、腐食性です。確かとき最後のモル濃度が重要微量元素; を表すようにする試薬を計量します。Mo, Se, と b.
    2. 滅菌フィールドでフィルターはきれい/滅菌プラスチック/ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) ボトルに 0.22 μ m ポリエーテルサルホン シリンジ フィルターを使用して滅菌します。
    3. きれいなメスフラスコ 0.01 M MnSO4, 5 × 10-4 M ZnSO4, 3.25 x 10-3 M CoCl2の最終のモルを含む (200 mL) の微量元素 #2 ソリューションを準備 6.25 x 10-3 M NiCl2と 0.1 M H24。
      注意: 強い酸 (H2SO4) 腐食性します。確かとき最後のモル濃度が重要微量元素; を表すようにする試薬を計量します。Mn, Zn, Co および Ni。
    4. [滅菌] フィールドにフィルターをきれいなガラス瓶に 0.22 μ m ポリエーテルサルホン シリンジ フィルターを使用して殺菌します。
    5. [滅菌] フィールドにきれい/滅菌ガラス瓶 (250 mL 最小構成);冷凍 (-20 ° C) 因数は、1.25 4 M ナノ3 mL から 200 mL の純水、M9 最小塩 (5 x; 参照テーブルの材料) の 42.5 mL、0.6 M チアミン HCl の 1200 μ L、125 μ L 2 M MgSO4の 2 M グルコース 2.5 mL を追加します。、0.075 M L-ロイシンの 770 μ L/L イソロイシン ・ バリン ソリューション、250 μ L の微量元素 #1、250 μ Lの微量元素 #2、0.01 M EDTA ナトリウムの 250 μ L、塩します。
      注: 前と 0.22 μ m ポリエーテルサルホン シリンジ フィルターを用いた滅菌フィルターは、1.1.5 の手順ですべての試薬が準備されるべき。純水は、オートクレーブで滅菌することがあります。
    6. 今ステップ 1.1.5 からソリューションを含むガラスのボトルを取る。、緩くキャップは、嫌気性チャンバー空気ロックを循環。
    7. 嫌気性チャンバー4ボトルをしっかりと、キャップおよびすべて白い沈殿が消えるまで振るように 0.225 M FeSO4 0.2 M H2の 15 μ L を追加します。
      注: 前と 0.22 μ m ポリエーテルサルホン シリンジ フィルターを用いた滅菌フィルター 1.1.7 の手順ですべての試薬が準備されるべき。だから 0.2 M H20.225 M FeSO4を保存4 嫌気性チャンバー。
    8. 瓶のキャップを外し、ボトルからキャップを交換、交換する空気のため 1 分待つし、積極的に振る。この手順をもう一度繰り返します。
    9. ボトルにキャップをしっかり、嫌気性チャンバーから取り出して使用するまで冷蔵庫 (4 ° C) でボトルを保管します。
    10. 成長媒体は、1.1.5 に 1.1.9 の手順を繰り返すことによって週に一度リメイクする必要があります。
  2. 2 x 50 mL 円錐滅菌ポリプロピレン製遠心管で露出媒体の 100 mL を作る: に
    注: 我々 は、露出中事前に行うことができますしかし、汚染のリスクを最小限に抑えるため暴露試験の日に準備し、冷蔵庫の中に格納されているお勧めします。
    1. 嫌気性チャンバー内各 50 mL 遠心管追加嫌気性超純水の 42 mL、1 350 μ M ナトリウム β-Gylcerophosphate 冷凍 (-20 ° C) の因数は、1 M の 2 mL からモップ遊離酸、50 μ L の 1 M (NH4)2、4、2 メートルのブドウ糖の 125 μ L、2.5 M 島の 300 μ L、200 μ L 2.5 M NaOH の。
      注: 前と 0.22 μ m ポリエーテルサルホン シリンジ フィルターを用いた滅菌フィルター、1.2.1 の手順ですべての試薬が準備されるべき。超純水は、オートクレーブで滅菌熱にあります。2.5 M NaOH と 2.5 M NaOH は、プラスチック/PTFE の瓶に保存する必要があります。記載されているすべての試薬は、嫌気性チャンバーナトリウム β-Gylcerophosphate を除く、(-20 ° C) の冷凍庫に保存することである内保存されなければなりません。一般に、酸素の痕跡が残っていないか確認する嫌気性チャンバーで数日間すべてのプラスチックまたはガラスの部分とコンテナーを残すことをお勧め。
    2. 50 mL 遠沈管のキャップ、まあ、横に振る、pH を測定する 10 mL の約数を取り外します。この露出メディアの測定 pH は常に7.00 ± 25 ° C で 0.02を測定しなければなりません。PH はこの範囲内でない場合は、追加した 2.5 M コこれを補正するためのボリュームを調整してください。
      注: 決して pH プローブと pH を補正するソリューションを滴定しなさい。pH プローブは、露出媒体の汚染の源を表します。PH は 1.2.1 の手順で追加した試薬の製品を必ずします。
  3. 5-10 の mM ナノ3ストック溶液を調製し、露出の試金の時に使用する嫌気性チャンバーに残します。
    注: 5-10 mM ナノ3一次標準を作るのではなくより集中一次ナノ3標準を希釈する方が簡単です。

2. 水銀およびカドミウム標準の準備。

  1. 0.2 M H24 8 μ M 第二水銀 (HgII) ソリューションを準備するなど4。
    1. 0.2 M H2で millimolar (1 〜 10 mM) HgCl2HgNO3 HgSO4のソリューションを行うことで Hg2 +標準の準備その4。
      注意: 水銀は猛毒と H24は腐食性。すべての必要な個人用保護具とヒューム フードで動作します。
    2. PTFE の瓶の中 2.1.1 から標準を希釈します。0.2 M H2SO4 4 8 μ M Hg2 +の範囲内の濃度を取得します。
      注: 使用される酸は、だから分析グレード H2をする必要があります4。
    3. 2.1.2 から水銀は、水銀分析装置を使用して検証されるべき (材料の表を参照してください)。
      注: Hg 濃度を検証するための他の方法を使用可能性があります。
  2. 10 μ M の Cd の準備IIソリューション 10 mM H2SO4。
    1. 0.1 M H2CdCl2 (粉体の正確な計量範囲 10 〜 50 ミリメートル) の一次標準を準備その4。
    2. 希釈に 10 μ M Cd2 +2.2.1 から標準、きれいな酸リンス 20 mL のシリアル希薄のシリーズで PTFE と黒いフェノール スクリュー キャップとホウケイ酸ガラス瓶はゴム製はさみ金を直面しました。4すべての後続のシリアル希釈で 10 mM のまま、H2の濃度を確認します。

3. バイオ センサーの嫌気性暴露試金のための準備

  1. 120 μ G/ml アンピシリンを含むホストゲノム スープ プレート-80 ° C cryostock からプレート水銀誘導型バイオ センサー (E. 大腸菌 NEB5α PUC57merR PpFbFp をかくまっている) と恒常発現バイオ センサー (E. 大腸菌 NEB5α PUC19Balch PpFbFp をかくまっている)。これらのバイオ センサー17の生産に関する詳細については我々 の以前に発行された仕事を参照してください。
  2. 4:30-17 で 10 mL の LB (+ アンプ) に文化を接種して一晩成長します。
    注: プレートから始まってそれ暴露試金のための嫌気培養の準備に2 日間になります (すなわち文化は、月曜日の午後 (17-4:30) 開始の準備ができて水曜日正午のまわりで露出の試金)。次の手順は、必要な微生物学的テクニック暴露試験の日に文化を準備する必要が。
    1. 平板培養から 1 つの植民地を取るし、ホストゲノム スープ (LB) 21 μ Lアンピシリン ナトリウム塩 (最終濃度は 210 μ G/ml アンプ) 無菌培養管の 100 mg/mL 原液 10 mL を加えます。
    2. インキュベーター/シェーカーに文化を置き、一晩 220 rpm で振とうしながら 37 ° C で成長します。
  3. 9-10 AM で次の朝文化を再懸濁します、嫌気 (20% 接種) の日中に成長します。
    1. 嫌気性チャンバーにインキュベーター (ステップ 3.2.1) から文化、成長媒体(ステップ 1.1.9) をもたらします。
    2. 生殖不能のバルチ管に新鮮な成長中のアンピシリン (210 μ g/mL) 8 mL を追加します。
    3. 2 mL の微量遠心チューブに一晩培養と転送の 2 mL を収集します。90 秒間 10,000 の RCF ステップで遠心、上清をダンプし、新鮮な成長培地 2 mLに再懸濁します。8 mL の新鮮な成長中のアンピシリンを含むバルチ管に再懸濁の文化を追加します。
    4. 生殖不能の技術を使用して、慎重にバルチ管のゴム栓を配置します。嫌気性チャンバーから削除しインキュベーター/シェーカーに配置し、嫌気 220 rpm で振とうしながら 37 ° C で 3-17 まで成長します。
  4. 3 と 17 の間新鮮な成長媒体に 1% の嫌気性菌を実行し、一晩成長します。
    1. 培と共に嫌気性チャンバーにバルチ チューブ (ステップ 3.3.4) をもたらします。新鮮な成長媒体(1% 接種) 10 mL に滅菌バルチ チューブ アンプ (210 μ G/ml amp) 文化の100 μ Lを追加します。
    2. 生殖不能の技術を使用して、慎重にバルチ管のゴム栓を配置します。嫌気性チャンバーから削除、インキュベーター/シェーカーに置き、一晩 220 rpm で振とうしながら 37 ° C で成長します。
  5. 9 と 10 の間には、終日 (20% 接種) 嫌気成長する文化を再懸濁します。
    1. 嫌気性チャンバーにインキュベーター (ステップ 3.4.1) から文化、成長媒体(ステップ 1.1.9) をもたらします。
    2. 滅菌バルチ チューブに培とアンピシリン (210 ug/mL アンプ) の 8 mL を追加します。
    3. 2 mL の微量遠心チューブに一晩培養と転送の 2 m を収集します。90 秒間、10,000 × g で遠心、上清をダンプし、新鮮な成長培地 2 mLに再懸濁します。8 mL の新鮮な成長中のアンピシリンを含むバルチ管に再懸濁の文化を追加します。
    4. 生殖不能の技術を使用して、慎重にバルチ管のゴム栓を配置します。商工会議所から削除しインキュベーター/シェーカーに配置し、嫌気 220 rpm で振とうしながら 37 ° C で成長します。
  6. (ステップ 3.5.4) 分光光度計を使用するカルチャの増加率を監視、 0.6 の OD600に達するまで。必ず渦文化各 OD を読む前にしてください。
    注: この手順 3-4 時間、露出媒体(ステップ 1.2) は露出の試金(手順 4.1) と同様、この時間の間に準備されるべき。
  7. 文化、 0.6 (± 0.1) の外径600 (3-4 時間の予想成長) に達すると、成長を止めます。
    1. 2 x 2 mLの遠心管に嫌気性チャンバー (ステップ 3.6) 管と転送文化をもたらします。90 秒間、10,000 × g で遠心、上清をダンプし、新鮮な露出媒体の 2 x 2 mLで再懸濁します。
    2. 3.7.1 洗浄手順を繰り返します。一度成長媒体のすべてのトレースを削除します。
  8. 暴露試験(ステップ 4) で使用するバイオ センサーの株式を取得する 7 mL PTFE 標準バイアルに細胞培養 (ステップ 3.7) の両方のマイクロ遠心チューブ用を結合します。
    注: 必ず徹底的にまだ軽くピペッティング前後使用する前にバイオ センサーの株式をミックスしてください。メソッドは、時間までここで一時停止することがあります。

4. 露出アッセイ

  1. 板レイアウトを設計します。
    注: がすべてピペッティング値計算と株を始める前に準備をしなければ必ず、露出アッセイ。どのように正しく設計する実験とに含めるコントロールのテキストで詳細が。さらに、嫌気性のモニターに示されている嫌気性チャンバー内酸素がある場合、実験を開始しないでください。
    1. 96 よくテンプレートに従ってプレート レイアウトをデザインします。3 の技術的な反復実験を実行、これは、32 さまざまな治療法、最適バイアル (図 1を参照) を設定する 4 x 8 のグリッドによって表されます。

figure-protocol-1
図 1: 96 ウェル プレート (左) や、PTFE を含む対応する 4 x 8 のグリッドはプレートに転送する (右) をバイアルします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

注: Hg水銀誘導型バイオ センサーの 2 つの治療法と吸収に及ぼす変数の役割のためのテストが各変数に必要な:治療(バイオ センサー + 水銀 + 変数 + 硝酸) とその治療空白(バイオ センサー +変数 + 硝酸).細胞の生理学的変数の役割をテストする場合構成バイオ センサーを使用して 2 つの治療が必要変数ごとに:治療(バイオ センサー + 水銀 + 変数 + 硝酸) と治療の空白(バイオ センサー + 変数 + Hg)。水銀は、カドミウムに置き換えられます可能性があります。Hg や Cd は、較正曲線を実行するときに、変数になります。構成および誘引可能なバイオ センサー (同じプレート レイアウト) で同時に実行する必要はありません。プレート レイアウトと対応する 4 x 8 のグリッド (変数) のマグネシウムの濃度範囲をテストするときのテンプレートの例で提供されます表 1)。

123456789101112
、Hg によるバイオ センサー + 水銀 + 硝酸 0 mM MgHg によるバイオ センサー + 硝酸 + 0 mM Mg0 mM Mg 硝酸 + Hg 構成バイオ センサー0 mM Mg + Hg 構成バイオ センサー
bHg によるバイオ センサー + 水銀 + 硝酸 + 0.1 mM MgHg によるバイオ センサー + 硝酸 0.1 mM Mg構成バイオ センサー + 水銀 + 硝酸 + 0.1 mM Mg0.1 mM Mg + Hg 構成バイオ センサー
cHg によるバイオ センサー + 水銀 + 硝酸 1 mM MgHg によるバイオ センサー + 硝酸 + 1 mM Mg1 mM Mg 硝酸 + Hg 構成バイオ センサー1 mM Mg + Hg 構成バイオ センサー
dHg によるバイオ センサー + 水銀 + 硝酸 + 10 mM MgHg によるバイオ センサー + 硝酸 + 10 mM Mg10 mM Mg 硝酸 + Hg 構成バイオ センサー10 mM Mg + Hg 構成バイオ センサー
e

表 1: プレート レイアウトの例 Hg バイオアベイラビリティをテストするバイオ センサーを使用するため (5 nM) マグネシウム (0-10 mM) のグラデーションに

  1. アッセイ プレート レイアウトによると 4 x 8 のグリッドを設定します。
    1. 7 mL PTFE 標準バイアルをトレイに置きます。
      注: PTFE バイアルは、酸洗浄/熱使用に先立って滅菌をする必要があります。バイアルは、バイアルの外側を操作することによってのみ処理する必要があります。
    2. 各バイアルは、それぞれの治療に対応する露出媒体のボリュームを追加します。
      注: 2,000 μ L (2 mL) の容量の露出で追加された露出媒体になります:露出媒体μ L = 2,000 μ L-治療 (空白) μ L (など露出媒体 μ l = 2,000-100 μ l (バイオ)-40 μ l (硝酸態窒素)-100 μ l (Hg。)-100 μ L (変数 (例えばMgSO4)) = 1660 μ L)。テスト変数の追加ボリュームが最終巻の 5% (100 μ L) を超えないことを確認します。
    3. 各バイアルは、プレート レイアウトに従ってテストする化学変数のソリューションの対応するボリュームを追加します。
    4. 1.3 のステップから最終濃度が200 μ M (40-80 μ L)、硝酸を各バイアルに追加します。構成バイオ治療空白のこのステップを除外します。
    5. ステップ 2.1 または 2.2 から追加 Hg (5 nM変数をテストする場合) または Cd (300 nM変数をテストする場合) プレート レイアウトに従ってバイアルに。水銀誘導バイオ治療空白のこのステップを除外します。
      1. Hg を使用している場合は、 4-8 μ Mの在庫を取る、よく振る。100-250 nM Hg ソリューションの作業をするために 7 mL PTFE バイアルの露出媒体のソリューションを希釈します。この実用的なソリューションから必要なバイアルに Hg を追加します。この場合は 0 から 12.5 まで Hg の較正曲線 nM。
        注: Hg または Cd のバイオアベイラビリティの変数の効果をテストする場合ことを確認 [Hg]、または [Cd] がすべての治療の間で一定です。Hg または Cd に追加すること 1 つのピペット チップを使用して、しかし、バイアルに露出中に触れないでください。
  2. 手動で軌道運動で横に振る。
    注: 実験は、speciate 解決策で Hg または Cd に必要な時間に応じて今停止可能性があります。1 時間以上のままにした場合は、蒸発/汚染を防ぐために PTFE バイアルに PTFE キャップを配置します。
  3. バイオ センサーの株式の均質性を確保するために前後のゆっくりピペットします。バイオ センサーの株式の 100 μ L を各バイアルに追加します。手動で軌道を振る。
  4. 以下の条件で読むにウォーム アップをプレート リーダーの準備: 37˚C, 運動軌道振動 2.5 5 分ごとの読み取りと10 時間の間に読み取り、実行し、と蛍光測定温440 の蛍光励起 nmと排出量 500 nm。
  5. 96 well プレートの対応する井戸に 4 x 8 のグリッドで各 PTFE バイアルから200 μ Lをピペット (黒、96 ウェル クリア-下制約表面プレート)。各 200 μ L を転送する前に 5 回ピペット前後。
    注意: ピペット チップを廃棄するのではなく、ピペッティングの進行状況を追跡するため PTFE バイアルにピペット チップをおきます。
  6. 96 ウェル プレートをプレート リーダーのトレイに配置し、96 well プレートのふたを閉めてアッセイを開始します。

5. データの定量化

  1. 各時点での各治療の蛍光をそれぞれ個々 よくノイズを補正し、空白にする必要があります、治療空白。
    1. それぞれの治療(T) の各時点 (t) の蛍光はポイント 3治療全体の平均し、各ウェルの複製 (r1r3 回目の初期蛍光 (t0) のアカウントに変換しなければなりません). この治療の平均は、平均治療空白(TB) 同じ方法 (式 1) で翻訳、空白する必要があります。

蛍光(t) =平均(Tr1(t) - Tr1(t0) Tr2(t) - Tr2 (t0) Tr3(t) - Tr3(t0))-平均(TBr1 (t) - TBr1(t0) TBr2(t)- TBr2( t0) TBr3(t) - TBr3(t0)) (1)

注: これはスプレッドシート関数としてなされるべきであります。エラーの適切な伝播は、各時間ポイントも計算する必要があります。

  1. グラフ時間の関数として各処理の補正後の蛍光

figure-protocol-2
図 2: 時間の関数として蛍光データを修正します。蛍光測定相対蛍光ユニット (RFU)エシェリヒア属大腸菌NEB5α によって放出される HgIIの追加と時間をかけて pUC57merR Pp (誘導ひずみ) を抱いて (0 12.5 nM) 嫌気性の条件の下で。蛍光だった 3 技術の平均が 37 ° C でレプリケートされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

注: あるない 0 nM Hg 値グラフと他のすべての水銀濃度が 0 非表示されて nM 水銀治療の空白が。したがって、0 nM Hg x 軸とすべての肯定的な蛍光を表します任意の変数を与えられる Hg から蛍光。なくこの方法で蛍光、空白を省略可能ですが、テスト変数がバック グラウンド蛍光蛍光曲線は誤解を招く蛍光曲線を与える (すなわち、溶解有機物自体が蛍光を発するし、あるかないです。治療細胞および溶存有機物濃度、溶存有機物を含む空白増える蛍光信号)。

  1. 蛍光ピークを定量化します。定量化可能な蛍光ピークが通常ターミナル電子受容体としてすべて 200 μ M 硝酸態窒素の消費に費やされるエネルギーを表す 2.5-4 時間後発生します。このピークは、定量化する必要があり、その特定の治療の最終の蛍光値を表します。
    注: イベントの蛍光ピークが観測されない (すなわち、 Hg バイオアベイラビリティ)、治療コントロールの蛍光ピークの時点での蛍光性 (すなわち、ない追加変数または 5 nm Hg) 定量化する必要があります。また、治療では, 蛍光誘導が、蛍光はよく定義されたピークを生成しません、O2などのより高い親和性電子受容体の可能性が高い汚染があるし、措置のトレースを削除するにはすべてのソリューションと実験から酸素を再度実行する必要があります。

結果

蛍光ピークはステップ 5.3 に従って定量化されている、一度、Hg または Cd のいずれかの相対バイオアベイラビリティに影響を与える変数を説明変数の濃度に応じて蛍光ピークの結果がグラフ化できます。たとえば、図 2の [HgII] で蛍光の較正曲線図 3 aに示した誘導データが得られます。HgIIの校正曲線は常に Hg 誘導ひずみ; の 3 つのコンポーネントが含まれています。閾値反応についての蛍光信号の生産の前に 1-2 nM HgIIは [HgII] に正比例直線範囲どこ5 nM HgIIは、その範囲と高原の中心に確実に常になりますどこ[HgII] を増やすして蛍光信号には、もはや。[HgII] の毒性は、信号の生産には影響を与えません信号生産構成のひずみの変化を示さない。図 3BのII Cd の誘導ひずみ; 2 つのコンポーネントが常にどこ200-300 nM CdIIに線形の範囲と高原の中心部になります確実に常に線形範囲。[CdII] に伴い蛍光シグナルの低下は、Cd 濃度が高い細胞に有毒である、1000 nm CdII高原後誘導蛍光生産の減少を説明できることを示しています。したがって、環境変数に関して Hg または Cd のバイオアベイラビリティをテストするとき、私達を使用して提案する5 Hg の nMIIと300 Cd の nMII。

信号生産いくつかのインスタンスで Hg または Cd のバイオアベイラビリティに正しく起因することができますが、他のケースで信号の生産は、バイオ細胞ホストの生理状態の変化によって影響を受けます (例えば興味の金属またはテスト環境は有害) です。図 4 aで 5 nM Hg バイオアベイラビリティは Zn のグラデーションにわたってテストされた (0-10 μ M)。両方 Hg 誘導型耐性と構成系統、Zn 濃度の増加と信号の同じような減少があります。したがって、1 つは信号低下のバイオアベイラビリティに起因または亜鉛の毒性の結果であるかどうか識別できません。図 4 b 、4 C、5 nm Hg バイオアベイラビリティは、Mg のグラデーションにわたってテストされたII (0-10 mM) と MnII (0-10 μ M)。Mg の増加II , MnII濃度減少誘導ひずみの蛍光信号。その一方で、構成のひずみが Mg の増加とともに蛍光性の減少を示さなかったII , Mn のII濃度 (MgII , MnIIにとって有益です、FbFp の生産で細胞によって示されるように蛍光信号の増加)。これは、セルが実行可能な Hg バイオアベイラビリティの減少から Hg 誘導ひずみの蛍光減少の結果を示しています。このデータを強調、また全体的なセル フィットネスの構成の測定を提供するためにすべてのバイオ センサー アッセイ方法重要。

figure-results-1
図 3: 水銀およびカドミウムを用いるバイオ センサーの直線範囲。最大蛍光測定相対蛍光ユニット (RFU) ± 1 標準偏差大腸菌NEB5α から放出される pUC57merR Pp (Hg 誘導) と pUC19Balch Pp (構成) の添加をかくまっているA) HgII (0-15 nM)B) CdII (0-1,000 nM) 嫌気性の条件の下で。蛍光だった 3 技術の平均が 37 ° C でレプリケートされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-2
図 4: 亜鉛と不確定な結果とマグネシウム, マンガンによる決定的な結果の例です。最大蛍光測定相対蛍光ユニット (RFU) ± 1 標準偏差大腸菌NEB5α から放出される pUC57merR Pp (Hg 誘導) と pUC19Balch Pp (構成) の添加をかくまっているA) ZnII (0-10 μ M)、B) MgII (0-10 mM)、およびC) MnII (0-10 μ M) 嫌気性の条件の下で。[HgII] が 5 に設定されたすべてのトリートメントや蛍光の nM は 37 ° C で技術的な反復実験 3 の平均。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

微生物バイオ センサーは、金属は、微生物との相互作用のメカニズムを識別するために便利なツールです。ここでは、Hg を定量化することができます, 方法について述べるIIと CdIIバイオアベイラビリティのグラム陰性菌の宿主細胞 (エシェリヒア属大腸菌) し、数時間以内定量的な結果を与える。このプロトコルの主な長所の 1 つは、強い結合リガンドまたは金属析出する可能性がありますコンポーネントを回避することによって露出媒体の重金属のスペシエーションの広範な制御をことが。重金属のスペシエーションをモデル化されており、PHREEQC17を使用してこの露出媒体のテストしかし他の重金属のスペシエーション ソフトウェアを展開可能性があります。ないの追加の配位子、Hg 種分化は 97% Hg(OH)2および 3 %hg (NH3)22 +として存在するはずの場合 Cd 種形成がある間は 59% の Cd-β-グリセロリン酸、25 %cd2 +、および 16% CdSO4として提示します。簡単な熱力学的モデリング ソフトウェアを使用して、ユーザーは露出メディアをデザインおよび興味の金属のバイオアベイラビリティをテストできます。さらに、バイオ センサー宿主細胞 (大腸菌NEB5α) は塩化ナトリウム濃度と pH (5 8.5) の広い範囲にわたって実行可能な (0 0.55 M)17。

Hg メチル化嫌気性プロセスは、この研究に記載されているプロトコルには酸素、金属のバイオアベイラビリティに嫌気性代謝のより正確な説明を可能にするための要件はありません。これは重要ですので、酸素の存在は、遺伝子発現プロファイル48,49を変更し、したがって、潜在的な輸送経路;したがってこのメソッドは、現在好気性の選択肢を既存優位をプレゼントします。ここで紹介バイオセンシング構造かもしれない水銀のメチル化 (例えば、Geobacter、デスルフォビブリオ属) のより関連するかもしれない他の嫌気性ホストで使用され、潜在的大腸菌よりも少なく扱いやすい。ここで紹介した方法の 1 つの現在の制限は、検出限界がまだ既存好気性システム4,19,37に反して、午後レベルに達していないこと。44を取られる必要しかしこれらの低い検出限界を達成することに注意する重要ないくつかの手順です: 私) 配位子の添加は Hg ソリューションのままで、(Hg 不可逆的なバインドされる微生物の細胞壁に吸着がないことを確認しておく必要そのバイオアベイラビリティ25,27には; を防止する表面のチオールをセルに参照図 3Aで Hg の閾値反応)、ii) 細胞密度、または iii への変更) merの輸送蛋白質を含むように遺伝的構成を変更-オペロン (すなわちマートとmerP)、Hg フラックスの増加セル50,51中。これらの変更は、環境に関連する状況を評価する際、Hg の低濃度を検出するに有益であるが、必ずしも理想的ではないでしょう。彼らがバイオアベイラビリティ41,42,の種分化の役割を評価するために調査官を許可しない複雑なメディアで設計されていたバイオ センサー カドミウム前は主に「原理の証明」として存在するのに対し43,44。

バイオ センサーは、金属種に bioavailable メカニズムを決定する際に非常に便利なツールです。ホストの有機体は Hg methylator ではないために、Hg がグラム陰性菌とない決定的な根拠を入力 Hg methylators が Hg を取得する方法をするための方法のためのモデルの開発にのみ使用があります。吸収の結果または質量バランス アプローチ10,15,20,45,46の使用として Hg バイオアベイラビリティ、メチル化などを確定するため他の方法が存在します。という、ここで紹介した方法は、実行可能なセルの準リアルタイム バイオアベイラビリティ データの利点を提供します。環境マトリックスで Hg または Cd の合計レベルが定量化されるこの方法はお勧めしません。ICP-MS、FAAS (Cd 分析用) (Hg の冷蒸気原子吸光法など多くのより容易に利用可能な標準的な方法があります36環境中微量金属濃度を決定するためのバイオ センサーの提案の使用にもかかわらず分析)。バイオ センサーはただし、かどうか特定環境の行列を拡張またはバイオアベイラビリティ; を妨げる可能性がありますを決定するために使用これを実現するには、標準の追加を実行します。

露出メディアの pH への変更は任意の場所 5 と 8.5 の範囲内で適切な pKa を持つバッファーの代替遊離酸とモップ無料酸 (バッファー) を交換提供 (適切なバッファー (フェレイラらのリストをご覧ください(2015)47)、露出メディアを作るとき、適切な pH に島で調整。さらに、メソッドは、他の転写制御因子を使用して他の金属を拡張することが Hg、Cd に限定されていません。

Hg または Cd のバイオアベイラビリティの O2とフマル酸など他の電子アクセプターの影響を探索する露出アッセイを変更可能性があります。電子アクセプターとして O2とフマル酸を利用する方法にマイナーな修正のリクエストも承ります。

要約すると次の点を強調したいと思います:私)これらはバイオ センサーのキャリブレーションに使用される Cd または Hg 株式の濃度が手順 2 であることが不可欠です。II) 0.6 (± 0.1) の外径600露出日に細胞の成長を停止し、その注意は、バイオ センサー、細胞培養を再はこの細胞の密度に調整されてとき。III)最後に、露出媒体は露出日で細かいところまで行われることが重要です。(成長障害の可能性を回避する) に同時にプロトコルの成功を確保するため複数の文化を成長させる必要があり、成長培地は (メディアと可能な汚染の準安定性を回避する) に週間リメイクする必要があります。また、信号を生産するとき、生物学的複製 (複数細胞培養) が変動を表現することに注意する必要があります。蛍光応答文化によって異なりますが、特定の変数への応答で蛍光の動向は依然と多数の生物的複製を通じて同じする必要があります。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

嫌気性バイオ センサーの開発に洞察力に富んだ議論のためアメリプーラン ラボのよくメンバーとして 2 つの匿名のレビューアーからのコメントに感謝したいと思います。オンタリオ州と発見グラントから初期賞と店に自然科学から工学研究評議会カナダのアクセラレータ サプリメント本研究を資金しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
7 mlの標準的なガラスびん、円形にされた内部デルタ科学200-007-2034 推薦
されたバイアル トレイ、21 mmの入り口デルタ科学730-20014 (4 x 8 grid)
のための24 mmの閉鎖デルタ科学600-024-0132 推薦
蓋の角 NOTCH BLK STR CS/50Corning3931
Corning 96-井戸クリアボトム非結合面マイクロプレートCorning Corning 3651
嫌気性チャンバー(グローブボックス)嫌気性チャンバー内の空気は(97 % N2 ± 2 % および 3 % H2 ± 2 %)
パラジウム触媒である必要があります。嫌気性チャンバー内でO2 をH2Oに変換します。必須ではありませんが、推奨されます。
マイクロプレートリーダー450
(±10) マイクロプレートリーダー500
(±10) マイクロプレートリーダー
嫌気性培養バイアル(バルチチューブ)+ゴム栓
分光光度計嫌気性培養チューブ用に改造
MA-3000(水銀分析装置)
pHプローブどのpHプローブでも
50mLの円錐形滅菌ポリプロピレン遠心分離管
0.22 以上mポリエーテルスルホンシリンジフィルター+シリンジ
滅菌済み/清潔なガラス瓶成長培地および標準用
滅菌済み/清潔なプラスチックまたはPTFEボトルアルカリ溶液用(NaOH/KOH)
試薬粉末:Na2MoO4、Na2SeO4、H3BO3、NaOH、KOH、MnSO4、ZnSO4、CoCl2、NiCl2、アンピシリンナトリウム塩、Difco M9 最小塩、グルコース、MgSO4、チアミンHCl、NaNO3、l-ロイシン、l-イソロイシンバリン、EDTAナトリウム塩、FeSO4、ベータジルセロリン酸ナトリウム、モップス遊離酸、(NH4)2SO4、Hg(NO3)2、CdCl2
Q水オートクレーブ滅菌またはフィルター滅菌済みで問題ありません。
リソジェニーブロス
分析グレード H2SO4
された用nMフィルター用nMフィルターを使用することができます。滅菌ミリ

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