チミジン アナログ エドゥと線虫の生殖における細胞周期解析

サマリー

イメージング手法の説明 S 相を識別し、チミジンを使用して線虫の両性生殖における細胞周期ダイナミクスの分析に使用できるアナログ教育。このメソッドは、遺伝子を必要とせず、免疫蛍光染色と互換性のあります。

要約

真核生物における細胞周期解析はよく染色体形態、式および/または細胞サイクルのさまざまな段階やヌクレオシド アナログの取り込みに必要な遺伝子産物の局在を利用しています。S 期には、DNA ポリメラーゼはマーキング解析のための細胞の染色体 DNA に EdU など BrdU チミジン類似体を組み込みます。線虫 c. エレガンスのヌクレオシド アナログ エドゥ規則的な文化の中にワームに送られ、蛍光技術と互換性のあります。線虫 c. エレガンスの生殖細胞は透明、遺伝子、減数分裂前期や細胞分化/配偶子形成で発生するので、経路、幹細胞、減数分裂、および細胞周期をシグナル伝達の研究の強力なモデル系、線形アセンブリのようなファッション。これらの機能は、エドゥ サイクリング有糸分裂細胞と生殖細胞の発生の動的側面を勉強する素晴らしいツールを確認します。このプロトコルが正常に野生型に餌をエドゥ細菌を準備する方法をについて説明しますc. の elegansの両性具有、両性の生殖腺を解剖、エドゥの DNA 混入のため様々 な細胞周期を検出する抗体で染色し、発達のマーカーは生殖腺をイメージし、結果を分析します。プロトコルでは、さまざまなメソッドおよび S 相インデックス、M フェーズ インデックス、G2 期間、細胞周期期間、減数分裂のエントリの率および減数分裂前期の進行の率の測定のための分析について説明します。このメソッドは、細胞周期や他の組織、段階、遺伝的背景、および生理的条件でセルの歴史を研究する合わせることができます。

概要

動物の開発、数百、数千、百万、十億、または細胞の分裂も兆は、大人の有機体を形成する必要があります。細胞周期細胞イベントのセットから成る G1 (ギャップ)、S (合成)、G2 (ギャップ)、M (有糸分裂) 定義のシリーズと、イベントは各細胞分裂を実行します。細胞周期は、ダイナミックで技術的に難しいことができますリアルタイムで最高評価です。このプロトコルで説明する技法は、段階の測定を行い、静止画像からの細胞周期のタイミングに 1 つを許可します。

線虫(C. elegans) 大人の細胞周期ダイナミクスの研究で S 相を識別するゴールド スタンダードは、ヌクレオシド アナログ 5-エチニル-2'-デオキシウリジン (EdU) など 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン (BrdU) 標識両性生殖^1,2,3,4,5。彼らはどのような遺伝子構成に依存しないと、エドゥと BrdU をほぼすべての遺伝的背景に使用できます。BrdU を可視化、染色、しばしば共同の追加抗体の汚損によって視覚化他細胞マーカーの評価と互換性がない抗 BrdU 抗体の抗原を公開する過酷な化学治療が必要です。対照的に、エドゥを可視化するクリックケミストリー温和な条件下で発生し、従って抗体染色^6,7と互換性のあります。

核のみ S 段階で DNA にチミジン (5-エチニル-2'-デオキシウリジン) 類縁体を組み込むので、ラベルの特異性は、はっきり。可視化は、固定組織で行われます。アジ化物を含む色素までひとりでにエドゥのラベルが表示されていないまたは fluorophore クリックの銅触媒を用いた化学⁸でエドゥのアルキンと反応して共有結合。エドゥのラベリングの核は、S 期、ラベリングの短いパルスを用いた即時情報を提供できます。エドゥも情報を提供できます動的パルス追跡または連続の分類; を使用してたとえば、パルス追跡実験ラベルは細胞分裂のたびに希釈または開発を経て、非分裂細胞進行を反映します。

線虫の両性生殖は、シグナリング細道、幹細胞、減数分裂、および細胞周期の研究の強力なモデル システムです。大人の生殖は、エントリと減数分裂前期、配偶子形成の段階より近位のコーディネート (図 1) の進行に続いて遠位端見られる幹細胞と偏光の流れ作業です。近位端に卵母細胞は成熟、排卵し受精し、子宮^9,10,11の胚発生を開始します。細胞直径 20 〜 長い減数分裂前期のセルではなく、減数分裂期の S 期細胞前駆細胞有糸分裂サイクリングの生殖細胞系幹が含まれています、先端のセル付近と呼びます前駆ゾーン^2,4,9,12. 細胞膜遠位の生殖細胞の核間の不完全な分離を提供しますが、前駆細胞のゾーンを経る有糸分裂細胞主として独立していないサイクリングします。若い大人の両性具有の生殖細胞のゾーンの中央の有糸分裂細胞周期期間は ~6.5 h;G1 期は簡単なまたは欠席、静穏化を^1,2,13守らないと。生殖細胞系幹細胞の分化本質的に直接分化が発生し、こうしてトランジット増幅部門⁴を欠いています。Pachytene 段階の分化、約 5 のうち 4 核卵母細胞を形成しないが、アポトーシス、発展途上卵母細胞^12,14細胞内容を寄贈ナース細胞として機能を代わりに受ける^,15。

ヌクレオシド アナログ S 相の標識細胞に加えて、1 つは有糸分裂と減数分裂抗体の汚損を使用してセルを識別できます。有糸分裂の核は反リン酸化ヒストン H3 に陽性 (Ser10) (pH3 と呼出される) 抗体^7,16。減数分裂の核は反彼 3 抗体 (減数分裂期染色体軸蛋白質)¹⁷に陽性です。前駆ゾーンの核は、彼 3、核質 REC 8¹⁸の存在や WAPL 1¹⁹の存在の有無によって識別できます。WAPL 1 強度、前駆ゾーンで高体生殖腺における最高低初期減数分裂 prophases¹⁹の間。プロトコルのいくつかのバリエーションを持ついくつかの細胞周期測定が可能な: 私) S 相の核を識別し、S 期のインデックスを測定II) M 段階で核を識別し、M フェーズ インデックスを測定III) 原子核は、有糸分裂または減数分裂 S 相; かどうかを決定します。IV) G2; 時間を測定します。V) G2 + M + G1 フェーズの duartion を測定します。VI) 減数分裂の入力の速度を測定します。VII) 減数分裂の進行の率を推定します。

1 つは、ウェット実験の種類から複数の細胞周期測定を行うことができます。以下のプロトコルは、エドゥ アンチ pH3 抗体と前駆ゾーン細胞アンチ WAPL 1 抗体の染色による染色による細菌や共同ラベリング M 期の細胞をラベルにc. の elegans大人の両性具有を供給することにより 30 分パルス ラベルについて説明します。エドゥのフィード (ステップ 2.5)、抗体の種類の期間の変更の採用 (手順 5)、追加の計測に必要な解析 (ステップ 8.3)。

プロトコル

1. 細菌のエドゥ ラベルの準備

1. MG1693 のスターター文化を育てます。大腸菌(エシェリヒア属大腸菌) MG1693 は、thyA の突然変異を運ぶ。
   1. 120 mm ホストゲノム スープ (LB) 寒天シャーレの上に冷凍のグリセロール ストックから大腸菌MG1693 を連勝。37 ° c 一晩文化。
   2. 2 つの個々 のエシェリヒア属大腸菌から接種する二つに MG1693 植民地複製 ~ 16 h の 37 ° C で液体ポンド文化 4 mL の管。
      注: MG1693 成長するチミン、チミジンを継ぎ足すことがなく LB の罰金。
2. 大腸菌MG1693 エドゥを添加した最小限のメディアに成長します。
   1. オートクレーブ 500 mL の三角フラスコ。
   2. 生殖不能の技術を使用して、20% ブドウ糖の 5 mL、チアミン 10 mg/mL、5 mM チミジンの 120 μ L、100 μ L 1 M MgSO₄、10 mM エドゥ、M9 バッファーの 100 mL、4 mL 一晩 MG1693 文化の直売の 200 μ L の 50 μ L を追加します。
      注: エドゥの最終濃度はこの文化^1,7で 20 μ M です。文化²⁰の哺乳類セルに直接適用されている場合、この濃度は DNA の損傷および細胞周期の停止に します。しかし、大腸菌と線虫従って利用できるこのエドゥのほんの一部が組み込まれています。若い大人の両性具有のエドゥ治療後前駆ゾーンまたは M 相インデックスのサイズに変更はなく、細胞周期の停止の証拠はありません。
   3. 一夜にして、しかし、もはや 200 rpm で振とうしながら 37 ° C で 24 時間以上の文化.
3. エドゥ ラベル大腸菌を集中し、M9 寒天培地のシャーレに適用します。
   1. 事前冷却卓上遠心 4 ° C に
   2. 生殖不能の技術を使用して 2-4 滅菌 50 mL の円錐管に文化を転送します。
   3. 3,000 x gエドゥ ラベル大腸菌を餌に 30 分間の 4 ° c で文化を遠心します。
      注: は、ローカルおよび制度のガイドラインに従って教育を含む上清の処分します。
   4. 新鮮な M9 の 4 mL にペレットを再懸濁します。1 mL の滅菌ピペット先端部または滅菌 5 mL の血清ピペットを使用します。ペレットを再は数分をかかる場合があります。
   5. 同じピペットを使用して適用し、再懸濁エドゥ ラベル大腸菌〜 8 滴を広める室温 60 mm M9 寒天培地シャーレの中央に MG1693。1 つのバッチには、16 〜 料理が得られます。
   6. いくつかの時間のための乾燥、常温で一晩または研究所フィルムのストリップの各料理をシールし料理を許可します。〜 2 ヶ月のための 4 ° C、15 ° C ~ 2 週間で、料理を格納できます。実験の各セットのエドゥの料理の同じバッチを使用します。

2.線虫にエドゥを供給

1. コレステロールと S 中に孵化することによって適切なステージ²¹を選ぶタイミング卵置く、アルカリ性の次亜塩素酸治療によって人口を同期します。目的のステージ (ここで 24 h ポスト L4) 20 ° C のエシェリヒア属大腸菌OP50 でシード線虫成長培地の動物を育てる
   注: 準備 50-100 の動物実験では、いくつか可能性がありますまあ、解剖しないと他の人が洗濯と転送の過程で失われます。
2. 20 ° C (または実験に必要な温度) を暖めるエドゥ料理を許可します。
3. 1.5 mL チューブに M9 またはリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を使用した NGM 料理から動物を洗います。重力や遠心機の簡単なスピンによって簡単に解決する動物を許可します。
4. 上澄みを除去し、1-2 回 〜 1 mL の M9 の PBS で動物を洗います。上澄みを除去します。
5. エドゥ芝生の中央に M9 または PBS の小さなドロップで動物を譲渡するのにガラス パスツール ピペットを使用します。吸収されるし、(S 期の歴史を測定) に 20 の ° C (直接 S 位相測定) のため 30 分以上インキュベートする液体のため数分待ってから、必要に応じて。
   注: エドゥ信号は餌¹エドゥの 15 分ほど後生殖核の検出です。
6. ワームを解剖皿グラスに M9 または PBS の ~ 2 mL でエドゥ皿に洗い落とします。

3. 郭清と線虫の生殖の固定

注: 郭清、固定および線虫の両性生殖の抗体の汚損のためのこのプロトコルはほぼ同じ 1 mL ガラス管をスピードアップする遠心分離しことができることを除いて (2016)²²ジェルベーズや Arur で公開されて洗濯の手順、Pasteur のピペットより効果的に 1 mL ガラス管から液体を削除する使用ことができます描画アウト ガラス。

1. 洗浄そして線虫germlines を解剖します。
   1. 解剖皿、センターで動物を収集するために渦の底に解決する動物ができ長いパスツール ピペットを使用して PBS を削除します。1-2 回 〜 2 mL の PBS で洗浄します。
   2. 2 mL の PBS と動物を固定する 100 mM レバミゾールの 4 μ L を追加します。皿の中央に動物を収集するために再び料理を旋回します。
      注: 固定は数秒、数分間かかります。完全な固定は、成功の郭清の必要はありません。何人かの人々 動物を固定化した不完全を解剖するときより良い成功があります。
   3. (約 2 つの咽頭電球) の間に頭を切断することによって 25 5/8"針のペアを持つ動物を解剖または尾。生殖細胞のループを切らないように注意してください。腸および生殖細胞系が体腔内部圧力のための「飛び出す」が接続されたまま。このプロトコルは、以前に発行されたジェルベーズと Arur に似て (2016)²²。
      〜 5 分に解離時の注意、確かに 15 分以上郭清術時間が長い抗体染色信号 (スディール ・ ナーヤカ、パーソナル通信) の損失につながる、PBS の飢餓は動物の生理に影響を与えます。迅速かつ正確に分析する学習と、いくつかの練習がかかることがあります。
   4. 必要に応じて、センターで切り裂かれた動物を収集するために旋回し、長いパスツール ピペットを使用して可能な限り多くの PBS を削除します。
2. 修正し、組織の脱水
   1. PBS 溶液 2 mL 3% パラホルムアルデヒド (PFA) を追加します。緩く研究所映画とストアのベンチまたは 10 分の引き出しの中に料理をカバーしてください。
      注: 雪解け 37 ° C で PFA ソリューション水槽し、germlines を解剖する前に室温に冷却してから。
      注意: PFA ソリューションは適度に有毒物質、ありそうな発癌物質と催奇形物質。パラホルムアルデヒド溶液から発光蒸気は可燃性です。ニトリル手袋を着用します。化学の発煙のフード 3% 16% から PFA を希釈します。ドラフト外で働く、覆われてすべてのコンテナーを維持します。
   2. きれいな 5 mL ガラス遠心管に生殖腺を慎重に転送します。
   3. PBSTw 〜 3 mL を追加 (0.1% と PBS トゥイーン 20) 生殖腺は PFA ソリューションを希釈するなど残りの生殖腺を取得できるように含まれている料理。
   4. スピン ・ ダウン 〜 1 分若い 870 × gで遠心する臨床でまたはより小さい動物古いまたは大きい動物よりも長いスピン時間が必要です。
   5. 長いガラス ピペットを使用して、化学のフードで不要な素材ボトルに最終的な廃棄の不要な材料ビーカーに上澄みを転送します。
   6. -20 ° C に冷やして中古高級メタノール 2 mL を追加します。研究室のフィルムでしっかり遠心管をカバーしてください。
      注: 新鮮な高級「ゴールド ラベル」メタノール使用は特定抗体を持つ適切な形態のために不可欠です。
      注意: メタノールは引火性の高い液体および蒸気は有毒であること飲み込んだ場合、吸入または皮膚に連絡する許可。手袋や適切な個人用保護具を着用します。燃えやすいものの量が少ないため適切な冷凍庫を使用します。
   7. 一晩、1 時間-20 ° C の冷凍庫に保管またはも数ヶ月。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。

4. 水分補給 Germlines

1. PBSTw メタノールを希釈と生殖腺を水分補給でトップにガラス遠心管を埋めます。〜 1 分 870 × gで遠心する臨床でスピンダウンします。
2. 長いガラス パスツール ピペットを使用して化学のフードで不要な素材ボトルに最終的な廃棄の不要な材料ビーカーに上澄みを転送します。
3. 3 回 〜 5 mL 〜 1 分 870 × gで遠心する臨床回転ダウンするたびに、PBSTw を使用して生殖腺を洗います。上澄みを除去します。
4. 小さな 1 mL ホウケイ酸ガラス チューブと長いガラス PBSTw にパスツール ピペットをすすいでください。
5. 〜 700 μ PBSTw を追加し、長いガラス パスツール ピペットを使用して小さなチューブに生殖腺を転送します。すべての生殖腺が転送されることを確認するのに PBSTw のいくつかの追加滴を使用します。
6. 長引く長いガラス パスツール ピペットを使用して 〜 1 分 870 x gで臨床遠心分離機のスピンダウン、生殖腺を乱すことがなく、できるだけ多くの液体としてを削除します。以上 50 μ L をまま。
   注: 抗体の検出が必要ではない場合は、手順 6 に進みます。

5. 抗体と抗原を検出します。

1. PBS で 30% 血清中一次抗体を希釈します。現在の例で抗 WAPL 1 抗体希釈 1:2,000、アンチ pH3 抗体希釈 1: 500。および microfuge の微粒子を削除する 4 ° C で 20,000 × gで 10 分解凍新鮮な血清を遠心します。数日間 4 ° C で保存できる培養上清を使用します。(ここでヤギ血清を使用) 二次抗体のホストの有機体に合わせて適切な血清を使用します。省略可能なブロッキングは、一次抗体の添加前に加えられるかもしれない。
2. 希釈した一次抗体 100 μ L をそれぞれ小さいガラス管に適用します。4 時間室温で孵化させなさい。
   注: インキュベーション時間は抗体によって異なります。いくつかの抗体室温で 2 時間で十分です。長い孵化 (e.g。、一晩) 可能ですが、背景を高める可能性があります。
3. 〜 1 分 870 × gで遠心する臨床でスピンダウンして PBSTw トップ チューブをご記入ください。
4. 3 回洗浄あたり 〜 5 分間洗浄に拡散して余分な一次抗体を許可する PBSTw 加温 〜 1 mL を使用して生殖腺を洗います。描画を使用する長いガラス パスツール ピペット、生殖腺を乱すことがなく、できるだけ多くの液体としてを削除します。以上 50 μ L をまま。
5. PBS で 30% ヤギ血清で二次抗体を希釈します。現在の例では、ヤギ抗-ウサギ 594 とヤギ-反-マウス-647 はそれぞれ 1: 400 で希釈しました。
   注: は、染料がエドゥ キットの染付とは異なる確認する慎重に二次抗体を選択します。現在の例では、エドゥのキットには、488 nm 励起色素が含まれています。
6. 希釈した二次抗体の 100 μ L をそれぞれ小さいガラス管に適用します。室温 2 時間暗闇の中で孵化させなさい。
   注: インキュベーション時間は抗体によって異なります。いくつかの二次抗体、常温で 1 h で十分です。長い孵化 (e.g。、一晩) 可能ですが、背景を高める可能性があります。
7. 3 回洗浄あたり 〜 5 分間洗浄に拡散して余分な二次抗体を許可する PBSTw 加温 〜 1 mL を使用して生殖腺を洗います。描画を使用する長いガラス パスツール ピペット、生殖腺を乱すことがなく、できるだけ多くの液体としてを削除します。以上 50 μ L をまま。
   注: 生殖腺に格納できる 100 μ L の PBS のこのステップの後必要に応じて、これは信号を減らすことができます。先に進む前に PBS を削除します。

6. エドゥを検出するエドゥ クリック反応を実行します。

注: 実行、エドゥ抗体染色手順 (手順 5 の前にステップ 6 を実行) する前にクリック反応が抗体⁷によって可能です。ただし、クリック試薬は、ある特定の抗原と干渉するかもしれない (e.g。、REC 8 抗体は固定と透過に敏感)。ここで示した順序生成明るい抗体染色 REC-8 WAPL-1、彼 3、pH3、フラグ、および CYE 1 抗体を使用すると、他の中で。

1. クリック エドゥ カクテル⁸新鮮なを準備するには、きれいな 1.5 mL チューブに以下を追加します。追加の順序は重要です。光から保護し、氷の上のすべての試薬を維持します。このレシピをもたらす十分な 1 つのサンプル (100 μ L);必要に応じてレシピを乗算します。
   1. 純水 2 mL を添加物のバッファーに追加します。これは 10 x 1 倍に希釈する必要がありますバッファーの添加剤を使用する前にすぐになります。
   2. 超純水の 76.5 μ L に 10 x バッファーの 8.5 μ L を追加します。よく混ぜます。
   3. 100 mM CuSO₄ (コンポーネント E としてラベル) の 4 μ L を追加します。よく混ぜます。
   4. 488 nm の色素アジの 0.25 μ L を追加します。溶剤、ジメチルスルホキシド、4 ° C で固体として、室温で解凍する必要があります。よく混合し、光から保護します。
   5. チューブのキャップの添加物のバッファーの 1 μ L の純水のミックス 9 μ L は。残りのカクテルを追加し、上下にピペッティングでよく混ぜるキャップからピペットで移しなさい。
2. エドゥ クリック反応を実行します。
   1. 細管内の生殖腺にクリック エドゥ カクテルの ~ 100 μ L を追加します。研究室フィルムでカバーし、室温で 30-60 分間インキュベートします。
   2. リンスの反作用バッファーの 100 μ L で 1 回洗浄します。
   3. 余分なエドゥ カクテル コンポーネント洗浄に拡散するため洗浄あたり 〜 15 分 〜 1 mL PBSTw 加温を使用して 4 回生殖腺を洗います。描画を使用する長いガラス パスツール ピペット、生殖腺を乱すことがなく、できるだけ多くの液体としてを削除します。以上 50 μ L をまま。

7. DNA の染色し、スライドを作成します。

1. 生殖腺に 1 滴 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI、DNA を可視化するために使用) でメディアを antifade マウント (〜 25 μ L) を追加します。解決し、生殖腺とミックスできるように数分を待ちます。
   注: 代わりに、PBS で (0.1 mg/mL 在庫) から DAPI の縮尺希釈可能性があります適用 5 分、1, 4-diazabicyclo [2.2.2] オクタン (鎖置換 DABCO) 90% グリセロールまたはメディアを別の antifade マウントでの 20 μ L に続いています。
2. 標準的なガラス顕微鏡スライドの大きな 2.5% アガロース パッドを準備します。
3. ほこり無料のクリーンに新しい使用長いガラス パスツール ピペット agarose パッドに生殖腺を転送します。生殖腺の損失を最小限にピペットの狭い下のすべての液体と生殖腺を維持します。
   注: 生殖腺は小さいガラス管に立ち往生または長いガラスのパスツール ピペット救えることができる""PBSTw で洗浄し解剖皿の液体を収集、まつげを使用してスライド上に個々 の動物を選ぶします。
4. まつげを使用する (または薄い髪の毛のループ) agarose パッドに生殖腺を配布し、ほこりの粒子を除去するつまようじに接着します。
5. 長方形のガラス基盤を適用します。空気の泡を避けるために 1 つの側面からゆっくりと低い。ティッシュを使用、coverslip が自由に移動することを防ぐ余分なソリューションを削除します。
   注: coverslips に使用する顕微鏡に一致するを選択します。#1 と #1.5 coverslips はうまく動作します。
6. 解決し、部屋の温度や 4 ° C で乾燥一晩わずかにスライドを許可します。これにより、生殖腺を少し平らにします。スライドは 4 ° C で保存する必要があります。
7. オプション: は、マニキュア、または別のスライドのシーラーを使用してスライドのエッジをシールします。コーナー シール最初に、側面で、coverslip のシフトを防ぐことができます。

8. 共焦点レーザー顕微鏡および分析

1. 画像回転のディスク共焦点蛍光顕微鏡と遠位性腺には高エネルギー光源、計画アポクロマート対物レンズ、高性能顕微鏡カメラが備わります。1 μ m または緊密な z スタック間隔で画像をキャプチャします。すべてのチャンネルのレーザー パワー、感度と露出時間の注意してください。
   1. 次を使用して: 405 nm レーザー線励起フィルター排出 485 nm (W60) DAPI、488 nm レーザー線励起フィルター排出 527 nm (W55) エドゥ、561 nm レーザー線励起, - 1, 615 nm (W70) 排出フィルターと 640 nm レーザー ライン excitapH3 の 705 nm (W90) 排出フィルターのグローバリゼ-ション。
      メモ: 輝度と背景輝度が変動します。同様に、必要な露光時間から最大 10 倍異なります。
2. フィジー^24,25で核を手動でカウントするのにセル カウンター プラグイン²³を使用します。WAPL 1、エドゥ、pH3 の有無によるとそれぞれの個々 の核にラベルを付けます。これらはすべて下記の計算を容易にするには、表 1と図 2で説明した核のクラスを使用します。
   注: 熟練したこんなものは正確に、ダブル カウントまたは行方不明の核なし 3 D イメージにすべての核をカウントできます。代わりに、1 つはすべての z 平面上にすべての核をカウント可能性があり、マークのセル R スクリプト³を使用して乗算カウント核を削除可能性があります。
3. 携帯電話番号と必要な細胞周期測定の種類に応じて上記のカウントから周波数を計算します。核の種類は、表 1 と図 2で定義されます。計算は、表 2 にまとめます。
   1. (変化私)S 相の核を識別するために 30 分のエドゥの動物を飼料します。エドゥのラベルを表示する任意の核は、S 期核です。計算するには、合計の A と C の核を取る、表 1と図 2を参照してください。
      注: 30 分野生タイプ大人の両性具有のエドゥ パルスで核を標識すべてのエドゥは前駆ゾーン マーカー¹共同ラベル。
   2. 前駆ゾーンを測定するには、REC-8 または WAPL 1 抗体など前駆ゾーン マーカーで染色します。前駆ゾーンが定義されてここではすべての核質の REC 8¹⁸または WAPL 1 陽性生殖核として。すべて, 1 陽性核の合計を計算するため (A + B + C + D表 1および図 2を参照)。
      注: WAPL 1 もラベル DTC とカウントすべきではない生殖腺体細胞核。体細胞核が、生殖細胞と核の「目玉焼き」の形態の少しだけ外側の位置、非常に強烈な WAPL 1 信号によって識別.
   3. S 相インデックスを測定するには、30 分教育実験を行い共同 REC-8 または WAPL 1 抗体でラベルを付けます。S 相インデックスは、S 期にある前駆ゾーンの割合として定義されます。計算するすべての S 相の核をカウントし、前駆ゾーン核数の合計で割ります (A + C/A + B + C + D表 1および図 2を参照)。
   4. (変動 II)M 段階で核を識別するために pH3 抗体で染色します。任意の pH3 陽性核は、M 期核です。これはフィード エドゥの期間に関係なく動作します。計算、A の合計を取ると B の核は、表 1と図 2を参照してください。
      注: WAPL 1 もラベル DTC とカウントすべきではない生殖腺体細胞核。体細胞核が、生殖細胞と核の「目玉焼き」の形態の少しだけ外側の位置、非常に強烈な WAPL 1 信号によって識別.
   5. M 相インデックスを測定するには、共同 pH3 と REC 8, 1 抗体とラベルします。M 相インデックスは、M フェーズにある前駆ゾーンの割合として定義されます。計算するすべて M 相核をカウントし、前駆ゾーン核数の合計で割ります (A + B/A + B + C + D表 1および図 2を参照)。
   6. (バリエーション III)有糸分裂と減数分裂の S 相の核両方はエドゥとラベルを付けます。言うと 2 つの集団を離れて、S 期は有糸分裂または減数分裂によって続いたかどうかを決定します。有糸分裂または減数分裂期の S 期に核がかどうかを調べるには、4 h の pH3 の共同ラベル エドゥのフィード (M フェーズ マーカー) と抗体の汚損によって HIM-3 (減数分裂期染色体軸蛋白質)。エドゥと pH3 表示核を記録 (A タイプ、表 1と図 2を参照) エドゥと HIM 3 表示核ながら分裂 S 期として (タイプ E、表 1と図 2を参照してください) 減数分裂 S 段階として。
   7. (変化 IV)G2 フェーズの所要時間を計算します。
      注: G2 段階は、M フェーズから S 相を分離します。線虫の生殖で G2 ラベル マーカーは報告されてない、1 つはラベル (郭清の時) M 相、S 相 (いくつか前に h から始まるいくつかの実験からのデータを組み合わせることで G2 フェーズの期間を計算できます。郭清)。M 期と S 期のマーカーが表示されるセルは、実験の過程で G2 フェーズを完了しました。M フェーズ マーカーだけとない S 段階のマーカーが表示されるセルは、実験中に S 期でした。
      1. G2 フェーズの所要時間を計算、2 h と pH3 抗体共同ラベル エドゥをフィードします。PH3 はエドゥ (これらは解剖前に 2 h エドゥのラベルの中に S 期にいた) が存在する (これらは、M-段階解離の時) のラベルのみの核を確認します。G2 期完成 M 相核の割合の計算 (A/A + B、表 1と図 2を参照)。
      2. 3 h エドゥ ラベルと再び 4 h エドゥ ラベル (および必要に応じて 5 h エドゥ ラベル) でこの実験を繰り返します。図 3 aに示すように、エドゥ、x 軸のラベルの期間とエドゥの y 軸の正は、pH3 陽性核の割合をプロットします。
      3. グラフ上の点を結ぶと図 3 aに示すように 50% を越えた線を決定して G2 段階の期間の中央値を計算します。
      4. グラフ上の点を結ぶと図 3Aに示すように、行が 99% を越える決定して G2 フェーズの最大期間を計算します。
   8. (変化 V)G2 + M + G1 の終了を計算します。
      注:線虫の生殖の G1 期は異常に短いです。線虫の生殖で G1 をラベルするマーカーは報告されてない、G2、M、そして G1 相の合計期間を見積もる、上述 G2 段階の時間でこの時間を比較できます。G2 + M + G1 の最大期間は、エドゥのラベル数時間後 (S 期を受けていない) EdU 負のまますべて前駆ゾーン核 (WAPL 1 陽性) の割合から推定されます。
      1. G1 + G2 + M の実行時間を計算、2 h と REC-8 または WAPL 1 抗体と共同ラベル エドゥをフィードします。この時間の間に S 期を受けた前駆ゾーンの割合を決定する (A + C/A + B + C + D表 1および図 2を参照)。
      2. 3 h エドゥ ラベルと再び 4 h エドゥ ラベル (および必要に応じて 5 h エドゥ ラベル) でこの実験を繰り返します。図 3 bに示すように、REC-8 または、エドゥ、y 軸に正, 1 肯定的な核の割合とエドゥ ラベル、x 軸に時間をプロットします。
      3. グラフ上の点を結ぶと図 3 bに示すように、行が 99% を越える見つけることによって G1 + G2 + M の最大持続時間を計算します。
         注: それはウサギ抗-, 1, マウス抗 pH3 抗体と共同の分類によって 2、3、4 の単一のセットとして G2 および G2 + M + G1 の期間を判断するための実験と 5 h 教育実験を行うことが可能です。
   9. (変化 VI)入力した減数分裂以来核前駆ゾーンにレプリケートを識別するが、REC-8 または WAPL 1 抗体と 10 h と共同のラベルのための動物エドゥをフィードします。エドゥのラベルを表示する任意の核はそれらの 10 h 間 S 期であった。核質 REC 8 または WAPL 1 汚損を表示しない任意の核は減数分裂にあった。単に前駆ゾーン マーカーと標識を表示しないエドゥ付け核をカウント (E、表 1を参照)。
      注: 逆に、生殖腺、減数分裂前期マーカー彼 3 反彼 3 抗体染色、エドゥをラベリングした核の数かも彼 3 の肯定的です。
   10. 減数分裂の率を計算、エドゥの 5 h、10 h、15 h ラベルに上記の実験を実行します。図 3に示すように、y 軸と x 軸にエドゥ ラベルの期間に減数分裂に入った核数をプロットします。Y の斜面 (h あたりに入った核減数分裂) を計算する単純な線形回帰を使用して = mx+b と。
       注: 減数分裂の率を計算する線形回帰を使用するが重要です。それは単に分割エドゥ ラベルの期間が減数分裂を入力した核の数を y 切片が 0 ではないので正しいでしょう。
   11. (バリエーション VII)減数分裂の進行の速度を測定します。
       注: エドゥは共有結合 DNA に組み込まれ、以来、差別化による細胞の集団を追跡するそれ使用できます。前駆ゾーンにおける S 期を受けた細胞は、減数分裂減数分裂、を経て進行に入るし、卵形成を受けるエドゥのラベルを保持します。エドゥとパルス追跡実験を使用して、減数分裂の進行の率を測定できます。
       1. エドゥ ラベル細菌を 4 h (「パルス」) のための動物にフィードします。48 h (以下、「チェイス」) のラベル OP50 細菌、動物を譲渡し解剖し、共同 REC 8 など, 1 前駆ゾーン マーカー (または彼 3 など減数分裂前期マーカー) とラベルの必要な場合。
       2. イメージング、最も近位エドゥ ラベル核の位置を探します。(前駆ゾーンの端からセルの直径) の距離で減数分裂の進行の率をもっとも近位のエドゥ 48 時間追跡中に核を標識によって伝わった

結果

DNA 合成はエドゥを組み込む必要があるので 1 つはエドゥ ラベル核がエドゥ ラベル時間ウィンドウの中に S 期を受けたと判断できます。1 つは解剖の時に S 段階の核として細菌というラベルの付いたエドゥと 30 分授乳のラベル核を解釈かもしれません。もはや連続教育実験を給餌、ラベル核早く時間ウィンドウで、左の S 期以降に可能性がありますが、ラベル付けや教育期間の後半部分にラベルが場合があります。エドゥの信号を共同 DAPI 信号をローカライズします。他の核エドゥ信号を 1-2 明るい点 (図 4) にローカライズいくつか核エドゥ信号すべての染色体、カバーします。おそらく、これらの点が S 段階¹³後半複製 x 染色体です。

ここでは、動物がいた 30 分間継続的にエドゥにうんざりし、解剖、上記と図 5で説明したよう。成功した教育は、...

ディスカッション

エドゥ ラベル細菌 (ステップ 1) の準備は、このプロトコルのトラブルシューティングの最初の点が重要です。4 h エドゥ パルス、エドゥ ラベル細菌の新しいバッチごとに便利なコントロールを作ってこれに非常に確実に野生型若い大人の両性具有のラベルです。さらに、(より古い動物または特定の咽頭/グラインダー欠陥変異) 腸を入力そのままのエドゥ ラベル細菌はクリックケミストリーにラベルを付けて、腸内で明るい長方形の点として表示されます。両性具有の分類のための代替技術は、EdU³の高濃度 (1 mM) で「浸漬」を使用します。この手法は、ラベルの持続期間のための動物を餓死、固定のトラブルシューティングを行うときに作るエドゥ ラベル細菌をバイパスし、クリックケミストリーする便利な方法を提供します。エドゥのフィードはありませんエドゥ「浸漬」実験が成功した場合は、新鮮なエドゥ ラベル細菌を準備します。また高い教育コンテンツを達成しながら十分な細菌の密度に達すると、1 つはエドゥとチミジンの濃度を調整する必要があります。

S 期のラベリング法の主な制...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
大腸菌 MG1693	Coli Genetic Stock Center	6411	は、標準的な未補充のLB
em>E. coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center	OP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 イメージングキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C10337
5-エチニル-2&プライム;-デオキシウリジン	Sigma	900584-50MG	または、キットで提供されているEdUグル
コース	グマ	D9434-500G	D-(+)-デキストロース
チアミン(ビタミンB1)	シグマ	T4625-5G	試薬グレード
チミジン	シグマ	T1895-1G	バイオ試薬
硫酸マグネシウム七水和物	シグマ	M1880-1KG	MgSO4、試薬グレード
リン酸ナトリウム、二塩基性、無水	フィッシャー	BP332-500G	Na2HPO4
リン酸カリウム、一塩基性	シグマ	P5379-500G	KH2PO4
アンモニウム	シグマ	A4514-500G	NH4Cl、試薬プラス
細菌寒天	米国生物	C13071058
塩化カルシウム二水和物	シグマ	C3881-500G	CaCl
LBブロス(ミラー)	シグマ	L3522-1KG	25g/L レ
バミゾール	シグマ	L9756-5G	0.241g/10ml
リン酸緩衝生理食塩水	Calbiochem Omnipur	6506	自家製 PBS も同様に機能します
Tween-20	Sigma	P1379-500ML
16% パラホルムアルデヒド、EM グレードのアンプル	電子顕微鏡科学	15710	10ml アンプル
100% メタノール	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A454-1L	金標識メタノールは、特定の抗体による適切な形態に不可欠です
ヤギ血清	Gibco	16210-072	Lot 1671330
rabbit-anti-WAPL-1	Novus biologicals	49300002	Lot G3048-179A02, used at 1:2000
mouse-anti-pH3 clone 3H10	Millipore	05-806	Lot#2680533, used at 1:500
ヤギ抗ウサギ IgG 標識 Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11012	ロット 1256147、1:400
ヤギ抗マウス IgG標識 Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	ロット 1511347、4
',6-ジアミディノ-2-フェニルインドール二塩酸塩 (DAPI) を含む 1:400 Vectashield 退色防止封入剤	Vector Laboratories	H-1200	DAPIなしの封入培地は、別のDAPIインキュベーション
マニキュア	nワイルド	DTC450B	任意の透明なマニキュアが動作する必要があります
S-medium	の様々な
M9寒天	様々な	M9バッファと同じレシピ
線虫成長媒体、	さまざまな		プロトコル解
剖時計ガラス	カロライナバイオロジカル	42300
パラフィルム実験室フィルム	ペチニープラスチック包装	PM-996	4インチ幅の実験室フィルム
ペトリ皿			直径60ミリメートル
長いガラスパスツールピペットのための
1ml遠心分離管	MidSci Avant	2926
ヒント
セロロジカルピペット
500 mL 三角フラスコ
アルミホイル
25G 5/8インチ針	BD PrecisionGlide
5mlガラス遠心分離管	パイレックス
ホウケイ酸ガラス管1ml
ガラススライド
No1カバーガラス22 x 40 mm			いいえ1.5は、また
37 °で動作する可能性があります。Cシェーカーインキュベーター
卓上遠心分離
臨床遠心分離	IEC	428	、6スイングバケットローター付き
遠心分離
20 °Cインキュベーター4
°C冷蔵庫
-20°C;C冷凍庫
Observer Z1顕微鏡	Zeiss
Plan Apo 63X 1.4 油浸対物レンズ	Zeiss
Ultraview Vox スピニングディスク共焦点システム	PerkinElmer		ニコンのスピニングディスク共焦点システムも非常にうまく機能しますが、ここで説明しているように http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy