方法論記事

チミジン アナログ エドゥと線虫の生殖における細胞周期解析

DOI：

10.3791/58339

⸱

2018年10月22日

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1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

この記事について

サマリー

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イメージング手法の説明 S 相を識別し、チミジンを使用して線虫の両性生殖における細胞周期ダイナミクスの分析に使用できるアナログ教育。このメソッドは、遺伝子を必要とせず、免疫蛍光染色と互換性のあります。

要約

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真核生物における細胞周期解析はよく染色体形態、式および/または細胞サイクルのさまざまな段階やヌクレオシド アナログの取り込みに必要な遺伝子産物の局在を利用しています。S 期には、DNA ポリメラーゼはマーキング解析のための細胞の染色体 DNA に EdU など BrdU チミジン類似体を組み込みます。線虫 c. エレガンスのヌクレオシド アナログ エドゥ規則的な文化の中にワームに送られ、蛍光技術と互換性のあります。線虫 c. エレガンスの生殖細胞は透明、遺伝子、減数分裂前期や細胞分化/配偶子形成で発生するので、経路、幹細胞、減数分裂、および細胞周期をシグナル伝達の研究の強力なモデル系、線形アセンブリのようなファッション。これらの機能は、エドゥ サイクリング有糸分裂細胞と生殖細胞の発生の動的側面を勉強する素晴らしいツールを確認します。このプロトコルが正常に野生型に餌をエドゥ細菌を準備する方法をについて説明しますc. の elegansの両性具有、両性の生殖腺を解剖、エドゥの DNA 混入のため様々 な細胞周期を検出する抗体で染色し、発達のマーカーは生殖腺をイメージし、結果を分析します。プロトコルでは、さまざまなメソッドおよび S 相インデックス、M フェーズ インデックス、G2 期間、細胞周期期間、減数分裂のエントリの率および減数分裂前期の進行の率の測定のための分析について説明します。このメソッドは、細胞周期や他の組織、段階、遺伝的背景、および生理的条件でセルの歴史を研究する合わせることができます。

概要

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動物の開発、数百、数千、百万、十億、または細胞の分裂も兆は、大人の有機体を形成する必要があります。細胞周期細胞イベントのセットから成る G1 (ギャップ)、S (合成)、G2 (ギャップ)、M (有糸分裂) 定義のシリーズと、イベントは各細胞分裂を実行します。細胞周期は、ダイナミックで技術的に難しいことができますリアルタイムで最高評価です。このプロトコルで説明する技法は、段階の測定を行い、静止画像からの細胞周期のタイミングに 1 つを許可します。

線虫(C. elegans) 大人の細胞周期ダイナミクスの研究で S 相を識別するゴールド スタンダードは、ヌクレオシド アナログ 5-エチニル-2'-デオキシウリジン (EdU) など 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン (BrdU) 標識両性生殖1,2,3,4,5。彼らはどのような遺伝子構成に依存しないと、エドゥと BrdU をほぼすべての遺伝的背景に使用できます。BrdU を可視化、染色、しばしば共同の追加抗体の汚損によって視覚化他細胞マーカーの評価と互換性がない抗 B....

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プロトコル

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1. 細菌のエドゥ ラベルの準備

  1. MG1693 のスターター文化を育てます。大腸菌(エシェリヒア属大腸菌) MG1693 は、thyA の突然変異を運ぶ。
    1. 120 mm ホストゲノム スープ (LB) 寒天シャーレの上に冷凍のグリセロール ストックから大腸菌MG1693 を連勝。37 ° c 一晩文化。
    2. 2 つの個々 のエシェリヒア属大腸菌から接種する二つに MG1693 植民地複製 ~ 16 h の 37 ° C で液体ポンド文化 4 mL の管。
      注: MG1693 成長するチミン、チミジンを継ぎ足すことがなく LB の罰金。
  2. 大腸菌MG1693 エドゥを添加した最小限のメディアに成長します。
    1. オートクレーブ 500 mL の三角フラスコ。
    2. 生殖不能の技術を使用して、20% ブドウ糖の 5 mL、チアミン 10 mg/mL、5 mM チミジンの 120 μ L、100 μ L 1 M MgSO4、10 mM エドゥ、M9 バッファーの 100 mL、4 mL 一晩 MG1693 文化の直売の 200 μ L の 50 μ L を追加します。
      注: エドゥの最終濃度はこの文化

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結果

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DNA 合成はエドゥを組み込む必要があるので 1 つはエドゥ ラベル核がエドゥ ラベル時間ウィンドウの中に S 期を受けたと判断できます。1 つは解剖の時に S 段階の核として細菌というラベルの付いたエドゥと 30 分授乳のラベル核を解釈かもしれません。もはや連続教育実験を給餌、ラベル核早く時間ウィンドウで、左の S 期以降に可能性がありますが、ラベル付けや教育期間の後半部分にラベルが場合があります。エドゥの信号を共同 DAPI 信号をローカライズします。他の核エドゥ信号を 1-2 明るい点 (図 4) にローカライズいくつか核エドゥ信号すべての染色体、カバーします。おそらく、これらの点が S 段階13後半複製 x 染色体です。

ここでは、動物がいた 30 分間継続的にエドゥにうんざりし、解剖、上記と図 5で説明したよう。成功した教育は、.......

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ディスカッション

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エドゥ ラベル細菌 (ステップ 1) の準備は、このプロトコルのトラブルシューティングの最初の点が重要です。4 h エドゥ パルス、エドゥ ラベル細菌の新しいバッチごとに便利なコントロールを作ってこれに非常に確実に野生型若い大人の両性具有のラベルです。さらに、(より古い動物または特定の咽頭/グラインダー欠陥変異) 腸を入力そのままのエドゥ ラベル細菌はクリックケミストリーにラベルを付けて、腸内で明るい長方形の点として表示されます。両性具有の分類のための代替技術は、EdU3の高濃度 (1 mM) で「浸漬」を使用します。この手法は、ラベルの持続期間のための動物を餓死、固定のトラブルシューティングを行うときに作るエドゥ ラベル細菌をバイパスし、クリックケミストリーする便利な方法を提供します。エドゥのフィードはありませんエドゥ「浸漬」実験が成功した場合は、新鮮なエドゥ ラベル細菌を準備します。また高い教育コンテンツを達成しながら十分な細菌の密度に達すると、1 つはエドゥとチミジンの濃度を調整する必要があります。

S 期のラベリング法の主な制.......

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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MG1693; のエシェリヒア属大腸菌のストック センターに感謝しておりますWormbase;国家機関の健康オフィスの研究インフラストラクチャのプログラム (P40OD010440) 系統; によって資金が供給される線虫の遺伝学センターザック ピンカス統計的アドバイス;愛平公使風水の試薬;ルーク ・ シュナイダー、アンドレア ・ シャーフ、サンディープ クマー、トレーニング、アドバイス、サポート、および有用な議論; のジョン ・フィードバックのために本稿では Kornfeld と Schedl ラボ。この作品は一部で健康の国民の協会によって支えられた [R01 AG02656106A1 株式会社、TS に R01 GM100756 へ] と全米科学財団を経て交わり [DGE 1143954 と ZK を DGE 1745038]。健康の国民の協会、全米科学財団、研究、収集、分析、およびデータの解釈のデザインにも原稿を書くに任意の役割を持っていた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
大腸菌 MG1693Coli Genetic Stock Center6411は、標準的な未補充のLB
em>E. coli OP50Caenorhabditis Genetics CenterOP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 イメージングキットサーモフィッシャーサイエンティフィックC10337
5-エチニル-2&プライム;-デオキシウリジンSigma900584-50MGまたは、キットで提供されているEdUグル
コースグマD9434-500GD-(+)-デキストロース
チアミン(ビタミンB1)シグマT4625-5G試薬グレード
チミジンシグマT1895-1Gバイオ試薬
硫酸マグネシウム七水和物シグマM1880-1KGMgSO4、試薬グレード
リン酸ナトリウム、二塩基性、無水フィッシャーBP332-500GNa2HPO4
リン酸カリウム、一塩基性シグマP5379-500GKH2PO4
アンモニウムシグマA4514-500GNH4Cl、試薬プラス
細菌寒天米国生物C13071058
塩化カルシウム二水和物シグマC3881-500GCaCl
LBブロス(ミラー)シグマL3522-1KG25g/L レ
バミゾールシグマL9756-5G0.241g/10ml
リン酸緩衝生理食塩水Calbiochem Omnipur6506自家製 PBS も同様に機能します
Tween-20SigmaP1379-500ML
16% パラホルムアルデヒド、EM グレードのアンプル電子顕微鏡科学1571010ml アンプル
100% メタノールサーモフィッシャーサイエンティフィックA454-1L金標識メタノールは、特定の抗体による適切な形態に不可欠です
ヤギ血清Gibco16210-072Lot 1671330
rabbit-anti-WAPL-1Novus biologicals49300002Lot G3048-179A02, used at 1:2000
mouse-anti-pH3 clone 3H10Millipore05-806Lot#2680533, used at 1:500
ヤギ抗ウサギ IgG 標識 Alexa Fluor 594InvitrogenA11012ロット 1256147、1:400
ヤギ抗マウス IgG標識 Alexa Fluor 647InvitrogenA21236ロット 1511347、4
',6-ジアミディノ-2-フェニルインドール二塩酸塩 (DAPI) を含む 1:400 Vectashield 退色防止封入剤Vector LaboratoriesH-1200DAPIなしの封入培地は、別のDAPIインキュベーション
マニキュアnワイルドDTC450B任意の透明なマニキュアが動作する必要があります
S-mediumの様々な
M9寒天様々なM9バッファと同じレシピ
線虫成長媒体、さまざまなプロトコル解
剖時計ガラスカロライナバイオロジカル42300
パラフィルム実験室フィルムペチニープラスチック包装PM-9964インチ幅の実験室フィルム
ペトリ皿直径60ミリメートル
長いガラスパスツールピペットのための
1ml遠心分離管MidSci Avant2926
ヒント
セロロジカルピペット
500 mL 三角フラスコ
アルミホイル
25G 5/8インチ針BD PrecisionGlide 
5mlガラス遠心分離管パイレックス 
ホウケイ酸ガラス管1ml
ガラススライド
No1カバーガラス22 x 40 mmいいえ1.5は、また
37 °で動作する可能性があります。Cシェーカーインキュベーター
卓上遠心分離
臨床遠心分離IEC428、6スイングバケットローター付き
遠心分離
20 °Cインキュベーター4
°C冷蔵庫
-20°C;C冷凍庫
Observer Z1顕微鏡Zeiss
Plan Apo 63X 1.4 油浸対物レンズZeiss
Ultraview Vox スピニングディスク共焦点システムPerkinElmer ニコンのスピニングディスク共焦点システムも非常にうまく機能しますが、ここで説明しているように http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 
<シ塩化で使用)ウェットプロトコルM9バッファの wormbook.org を参照してくださいプロトコルのの wormbook.org を参照してくださいが、1.7%寒天を追加しますwormbook.org を参照してください305122機機ミニ機

参考文献

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  1. Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), Cambridge, England. 2223-2234 (2011).
  2. Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J.

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