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方法論記事

Ex Vivoセル固有カルシウム マウス ダイヤフラムの三者のシナプスでシグナル伝達のイメージング

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DOI:

10.3791/58347

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2018年10月4日

 ,  , 
1Department of Physiology and Cell Biology, School of Medicine, University of Nevada, 2Department of Pharmacology, Larner College of Medicine, University of Vermont

この記事について

サマリー

マウスの神経筋接合部で個々 のセル型の集団のイメージ カルシウムにプロトコルをご紹介します。

要約

電気生理学的手法による組織内の細胞の電気的活動を監視できますが、これらは通常個々 の細胞の分析に限られています。細胞のイメージングを搭載蛍光カルシウムに敏感な細胞内カルシウム (Ca2 +) 細胞質の増加は多くの場合電気的活動のため発生しますまたは、無数の他の刺激に応答して、このプロセスを監視できますので染料。 しかし、これらの染料は、組織内のすべてのセル型からとられるので全体の組織内の個々 のセル型のこの反応をイメージすることは困難です。対照的に、遺伝的コード化カルシウム指示薬 (GECIs) 個々 のセル型で表現できるので、細胞内 Ca2 +Ca2 +の全人口におけるシグナル伝達のイメージングが可能の増加への応答で蛍光を発する個々 のセルの種類。ここでは、マウス神経筋接合部に使用 GECIs GCaMP3/6 の適用、シュワン細胞の運動神経細胞、骨格筋、「ターミナル/間の三者のシナプス。古典的な前のヴィヴォティッシュの準備でこの手法の有用性を示す.光スプリッターを使用すると、我々 実行動的 Ca2 +シグナルのデュアル波長イメージングと神経筋接合部 (NMJ) の静的なラベル 2 つのセルに固有の GECI または遺伝的コード化の電圧監視に容易に適応させることができる方法で指標 (GEVI) 同時に。最後に、蛍光強度の空間マップをキャプチャするために使用されるルーチンをについて説明します。一緒に、さまざまなコンテキストで NMJ で明瞭な細胞の亜集団の生物活性を検討するこれらの光、トランスジェニック、分析技術を使用できます。

概要

NMJ は、すべてのシナプスのような 3 つの要素で構成されます: シナプス前終末に由来するニューロンは、シナプス後ニューロン/エフェクター細胞とグリア perisynaptic セル1,2。シナプス伝達の基本的な側面は、このシナプス3で披露された最初中、このプロセスの多くの側面のこのシナプスの異なる細胞要素によって同じ分子の発現のために部分、不明なまま。いずれかの解釈をこのように複雑運動ニューロン、シュワン細胞、筋肉、脊椎動物の略記で運動ニューロンによって解放共同、プリン アデニン ヌクレオチド ATP とアセチルコリン (ACh) の両方の受容体を表現するなどこれらの物質 (例えば伝達物質放出または応答の、筋力生成) の4によって加えられる機能に影響します。さらに、略記の三者のコンポーネントは単純な比較に、たとえば、複数のシナプス入力をよく表わす中枢神経系ニューロン運動神経細胞、筋細胞や Schwann 細胞による刺激に応じて変化するかどうか本質的な不均一性 (例えば、萌芽期の誘導、繊維のサブタイプ、形態) は明確ではないです。これらの各問題を対処するために有利なトラック、同時に、その他の個別の要素のいずれかでこのような反応と同様、1 つのシナプス要素内の多くの細胞の応答を同時に追跡することです。バス適用色素は組織に適用された後複数の細胞のタイプによってとらし、細胞内で読み込まれている色素は、視覚化するのみ使用できますのでカルシウム シグナルを測定する化学染料を使用して従来の戦略はこれら 2 つの目標を達成できません。セルの個人や小集団。ここでは、セル固有カルシウム シグナル、特定のイメージングとソフトウェア ツール5、これらの 2 つの全体的な目標の最初から、議論を測定するように設計 GECIs を発現するトランスジェニック マウスを用いた方法のまた新しいトランスジェニック ツールは、2 番目の達成を助けるでしょう。この手法はカルシウム動態や同時に複数のセル人口の遺伝子符号化光センサーを通してイベント観測可能なオブジェクトをシグナルその他の携帯電話の追跡に興味がある人の役に立つでしょう。

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プロトコル

動物飼育および実験はされたのケアおよび実験動物の使用とネバダ大学で IACUC 国立の機関健康ガイドに従って実行されます。

1. ダイヤフラムおよびトランスジェニック マウスからの横隔神経の準備

  1. トランスジェニック マウスおよびオリゴヌクレオチドのプライマー遺伝子型がこれらのマウスを購入します。
    注: プライマーは、これらのマウスのそれぞれの「情報」ページに表示されます。
    1. 適切な遺伝子/ノックアウトの Cre ドライバーの対立遺伝子の 1 つのコピーとGCaMP3 の条件の 1 つまたは 2 つのコピーを表現する同じ年齢の第 2 マウスで条件付きGCaMP3/6アレルのゼロのコピーを表現する 3-6 カ月齢のマウスを繁殖させる/6の対立遺伝子と Cre ドライバーの対立遺伝子のゼロのコピー。
    2. 遺伝子 Cre と条件付き GCaMP3/6 対立遺伝子の両方を持っている子犬とマークのもの-ダブル-トランスジェニック マウスを呼ばれる今後これら (例えば、 Myf5 Cre、条件付き GCaMP3)6。
      注: この方法では、すべてのデータは Cre と条件付き GCaMP3/6 対立遺伝子の両方のコピーを発現するマウスから派生させます。これらの交差する他の突然変異体のマウス (例えばノックアウト) に追加する場合、これは特に重要です。
  2. ダブル トランスジェニック マウスが適切な年齢のとき (例えば生後 0 または 5 [P0 または P5] または成人向け)、(マウス P10 より若い) 用ハサミでそれらを decapitating またはイソフルレン吸入室にそれらを配置することによって、マウスを安楽死させる-彼らは、鉗子のペアと尾をつまんにもはや対応、彼らは犠牲の準備ができています。
  3. はさみのペアで斬首で動物を犠牲に。
  4. 全体の動物の肝臓のすぐ下と心臓や肺虹彩ハサミの真上を横切る横断面。
  5. 肝臓、心臓、(すなわち1-2 cm) の吸引電極に引き込まれるに十分な長さは、横隔神経の長さを維持するように注意しながら、肺を解剖まで。
    メモ: 左の横隔神経は横隔膜の内側部に入る組織の白い部分として識別できます。肺を削除するときは、カットされませんする必要があります。右横隔神経は、上大静脈を含むまたより薄く、上大静脈よりも白く筋膜の部分の内で実行されます。一緒に、彼らは両方浸透内側右の横隔膜です。
  6. さらに、胸部と横隔膜の周りの細い畝を除いて脊柱を削除します。
  7. 1 μ G/ml 594-暗闇の中で 10 分間 αBTX とクレブス リンガー液管および microfuge の横隔膜と横隔神経のサンプルを置きます。
    注: 594-αBTX のこの集中機能 (個人観測) をブロックせず ACh 受容体 (AChRs) のラベルします。

2. 刺激と筋活動電位の記録

  1. ダイヤフラムを固定 minutien ピンを使用して、固定することによって 6 cm 皿にシリコーンゲル誘電体で被覆された ~ 8 ml の酸素のクレブス リンガー液と顕微鏡ステージ上に配置します。30 分以上のクレブス リンガー液 (8 mL/分) で絞りを灌流します。
    注: 非連結 594-αBTX、リンスし同様郭清後組織をあります。
  2. 確立された方法7によると吸引電極を作る。
    1. マニュピュレーターを使用して、4 倍の倍率で左横隔神経上に吸引電極を移動し、吸引電極に接続されているチューブに接続されている 5 mL シリンジのバレルを抜いて吸引を適用します。
      注: 吸引電極に正常に描画されると、横隔神経がピンと張ったです。刺激をオンにし、横隔膜を刺激する、手動反転による神経スイッチ × 1。
    2. 横隔膜が視覚的に明視野照明でそれを調べることによって 1 Hz の刺激への応答の契約を確認します。ない場合は、激のパルスは、筋収縮の目視検査で確認することができますを達成するために段階的電圧ノブを回して電圧を調整します。まだ表示されていない場合は、注射器で神経を吹き消す吸引を適用することによって再度描画しようとします。
  3. 灌流の電源を切り、最終濃度 100 μ M に特定の筋ミオシン阻害剤 BHC6または電位依存性ナトリウム チャネル拮抗薬 μ-コノトキシン8を追加します。
    1. 100 μ M の BHC をするためには、DMSO で 200 mM の在庫の 4 μ L をピペットし、クレブス リンガー液の 1 mL に predilute。
    2. お皿からクレブス リンガー液の 1 mL を削除します。
    3. Prediluted BHC を皿に追加します。
      注: この predilution は、GCaMP3 発現細胞の非一時的な蛍光応答の原液 DMSO による誘導を防ぐのに役立ちます。
    4. 30 分待って、別の 20-30 分のための新鮮なのクレブス リンガー液の灌流に入れます。
  4. 記録電極を準備します。
    1. 手袋を装着はマイクロ ピペットの引き手に 1 mm と 0.4 mm の内径 (ID) の外径 (OD) のホウケイ酸 filamented ガラスを配置、位置にそれをクランプするダイヤルを締めます。引き手のドアを閉じます。
    2. P-97 引き手を使用して次の設定をプログラム: 900 で熱、120 でプル、速度 75 で、250、500、およびない追加のループの圧力で時間。
      注: Resistance (R) は、増幅器のソフトウェア コントロールを使用して、測定: データ集録ソフトウェア V 式を解くことによって抵抗を確認 = 赤外線ソフトウェア コント ローラー電極を介して既知電流 (I) (通常 1 nA) を通過し、r. のために解決できる電圧 (V) の変化を測定
    3. 胚のダイヤフラムのため抵抗は 60 MΩ の近く、古いダイヤフラム、10-20 MΩ のことを確認します。3 M の KCl と記録電極をロードします。
  5. 10 倍の倍率で刺激電極としてステージの反対側に 2 番目のマイクロマニピュレーターを使用して筋肉に電極を下げます。
  6. 電気生理学的データ集録ソフトウェアを使用して、静止膜電位 0 からに変わったら-65 mV またはそれ以下。
  7. 1 Hz で刺激し、適度なオーバー シュートを示す大きな可能性をチェックして筋活動電位の存在を確認 (0 を超える可能性-65 で起動時に mV mV またはそれ以下)。活動電位刺激人工物を混同しないでください。
    注意: 電位が大幅に長い期間 (~ 5 ms) 刺激アイテムよりも。

3. サンプルの蛍光イメージング

  1. 20 倍の倍率で緑/黄色光励起下の NMJs の 594-αBTX-ラベルを探して筋終板帯中心を探します (550 nm)。青の光励起に切り替える (470 nm) 筋肉、運動ニューロン、シュワン細胞画像 Ca2 +応答します。
  2. 必要に応じて、設定画像分割バンドパス フィルターとデュアル波長イメージング用ダイクロイック シングル エッジ フィルター。
  3. GCaMP3/6 表現の組織によって示される最大蛍光 (Fmax) を計算するためにダイヤフラムの準備6に 12 μ L の 3 M 塩化カリウム (KCl) を追加します。
    1. GCaMP3/6 表現する組織が KCl に応えてビニングなし 20 倍の倍率で彩度を展示物レベルの 110% に設定参照テーブルのバーで明るさバーで実験を実行します。
  4. 高速イベントをお見逃しなくする 1 秒あたり 20 フレームで記録します。
  5. 吸引電極を用いたインパルスの鉄道を提供することにより神経刺激の 20-40 hz 1 45 s 刺激またはバス アプリケーションまたは灌流によって薬理学的アゴニストを追加し、1 つ細胞サブタイプの動的蛍光 Ca2 +応答を収集一緒に静的 594 αBTX NMJ 信号。
    注: 組織固有または遠赤 GECI または GEVI マウスは略記で使用可能になると場合、略記で 2 つの携帯電話の要素を反映した 2 つの動的信号を収集する彼ら使用できます。
  6. 画像や電気生理学的実験を終了するは、望ましい結果が達成されているため、灌流線を通して水を灌流し、水 2 倍 - 3 倍を介して、塩を構築しないように吸引電極を吸います。

4. エクスポートと蛍光強度 (SDiu16) の標準偏差マップによるデータの分析

  1. 16 ビット TIFF スタックとして記録映像を記録し、分析に必要な画像データ解析システムに読み込みます。
  2. ソフトウェアの 8 d ファイル] メニューの [選択対象の画像のスタックしロードするクリックします。
    1. ビデオが読み込まれると、一度細胞蛍光活性を持たないセクションを識別するために時間をスキャンできます。
      注: この領域は、背景のサンプルを作成する使用されます。
    2. Shift キーを押しし、背景サンプル領域として特定のエリアに関心 (ROI) ボックスの領域を描画するをクリックします。
    3. ボックスを作成すると、バック グラウンド活動変化のプロットを作成するスペースバーを押します。
    4. トレースを右クリックし、xy 座標テキストファイルとしてトレースするテキストとしてダンプ ROIにオプションを提示する各種のオプションを選択します。
  3. 関心のビデオに戻って動いて、関心のアクティビティが発生している領域を識別するために再びスキャンします。
    1. マウスの中央ボタンを使用して、黄色の時間ボックスでこの領域を選択します。
    2. ビデオを右クリックし、スタックの OPSと、 Stat マップオプション 5 を選択します。
      注: これは、左側のウィンドウで標準偏差マップ (SD マップ) が生成されます。
    3. SD 地図上をクリックして、次プレス]に適切な色のヒート マップを適用する 19 x。
    4. SD マップを右クリックし選択STM の読み込みし、保存、SD マップを保存するstm tiff として保存するオプションが表示されます。
    5. その後、プレス[キー 19 x グレースケール カラー マップに戻ります。
    6. 密度マッピング ツールを動作させるには、 Cその後、 Dキーを押します。マウスの左ボタンとマウスの中央ボタンを使用して、SD 地図に示すように蛍光灯のすべての活動を含むようにしきい値を調整します。
    7. しきい値設定を維持しながら、[密度] ツールを閉じるにCキーを押します。
    8. SD マップを右クリックし、 STM 粒子をクリックし、検索し、PTCLSを選択します。
      注: これは蛍光活動を表現する個々 のセルを識別します。
    9. SD マップをもう一度右クリックし、粒子・ ロワの作成を選択します。
      注: これは関心の元のビデオの選択したセルを重ね合わせます。
    10. シフトを押しながら元のビデオに今識別された粒子・ ロワのいずれかを右クリックします。
    11. 投資収益率のマーカーとROI の測定 Intを選択します。
      注: これは興味のビデオの各特定の投資収益率の蛍光の個々 の活動のプロットが生成されます。これらはこれらのいずれかを右クリックして保存し、テキストとしてダンプ ROIによって続いて盛り合わせを選択できます。
  4. これらの操作の基礎となる詳細なロジック、ソース コード ファイル9を参照してください。

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結果

蛍光強度の変化、細胞内 Ca2 +の略記には、定義済みのセル型内での増加を介するのいくつかの例では、このアプローチの有用性を示しています。これらの結果、応答細胞の場所だけでなく、どのように多くの細胞応答とどのくらいの各セルの特定応答評価することができます、その反応の強度を提供する空間の蛍光強度マップとして表示します。刺激。たとえば、図 1のように、私たちのビデオを取ったターミナル/perisynaptic シュワンの人口における Ca2 +反応の細胞 (TPSCs) P7 Wnt1 Cre; のダイヤフラムの NMJs で条件付き GCaMP3-横隔神経刺激によるマウスを表現し、空間の蛍光強度マップによって応答細胞の集団を識別します。熱マップ火カラー ルックアップ テーブル (CLUT 火) に従って色分けと、蛍光強度のこれらのマップが掲載されています。我々 と同時に横隔膜 (動画 1と

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ディスカッション

ここでは、Ca2 +応答 GECI 発現マウスを用いたそのままの筋組織の特定のセルを測定するいくつかの例を提供します。これらの実験を正常に実行するために横隔神経を傷つけないように解剖中が不可欠です。低または高電力 (すなわち20 X、60 X) でシュワン細胞の Ca2 +応答をイメージするには、BHC またはブロックの動きに μ-コノトキシンのいずれかを使用する必要です。低消費電力用筋細胞内 Ca2 +応答の中に長さの変化筋 Ca2 +非定常強度と筋の同時取得が可能、これらの薬の不在でそれらを測定することが可能です。高周波神経刺激6。同じサンプルの複数の実験を実行すると、サンプル中の時間潅流されたことが、少なくとも 15 分に各 1 つを分離する必要は。手順は、少なくとも 3-5 時間の刺激による Ca2 +応答同じサンプルのビューの同じフィールドからの繰り返されたイメージングできます。また、DMSO GCaMP 表現の組織に直接適用は不可逆的な刺激に依存しない...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この仕事は、資金の健康 (NIH) の GM103554 と GM110767 (T.W.G.) に国立衛生研究所国立研究資源 5P20RR018751 センターから国立総合医学研究所 8 P 20 GM103513 (G.W.H.) にも対応しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Myf5-Cre マウスJax#007893E136
Wnt1-Cre miceJax#003829すべてに発現を駆動します E13のシュワン細胞はP209
>Sox10-CreマウスJax#025807高齢でのシュワン細胞発現を促進
条件付きGCaMP3マウスJax#029043GCaMP3を細胞特異的に発現
条件付きGCaMP6fマウスJax#024105GCaMP6fを細胞特異的に発現
BHC (3-(N-ブチルエタニミドイル)-4-ヒドロキシ-2H-クロメン-2-オン)Hit2Lead#5102862骨格筋ミオシンをブロックしますが、神経伝達はブロックしません6
CF594-α-BTXBiotium#00007NMJのアセチルコリン受容体クラスターを標識
しますµ-コノトキシンGIIIbペプチドInt'l#CONO20-01000Nav1.4 電圧依存ナトリウムチャネルをブロックします8
Silicone Dielectric Gel; aka SylgardEllswoth Adhesives# Sil Dielec Gel .9KG 微細なピンによるダイヤフラムの固定化が可能
微細なピン(直径0.1mm)ファインサイエンスツール26002-10ヤフラムをシリコーン誘電体ゲル
EclipseFN1直立顕微鏡に固定します ニコンMBA74100標本のステージングと観察が可能
手動XY顕微鏡トランスレータ付き基本固定顕微鏡プラットフォーム Autom8MXMScr試料の移動が可能
手動マイクロマニピュレーター 成重M-152記録電極・刺激電極保持 
微小電極増幅器 Molecular DevicesAxoclamp 900Aシャープな電極、細胞内電気生理学的記録が可能
微小電極、低ノイズデータ収集システムMolecular DevicesDigidata 1550 電気生理学的データの取得が可能
微小電極データ解析システムMolecular DevicesPCLAMP 10 Standard電気生理学的データ分析を行う
矩形波刺激装置GrassS48神経を刺激して筋肉を興奮
刺激隔離ユニットGrassPSIU6減少  刺激アーティファクト
ホウケイ酸フィラメント、外径1.0mm、内径0.5mm SutterFG-GBF100-50-15誘発筋電位をImpalesおよび記録
ホウケイ酸フィラメント、外径1.5mm、内径1.17mm サッターBF150-117-15延長して吸引電極に使用
マイクロピペットプーラーサッターP-97 記録電極を引っ張って準備します
1200x1200ピクセル裏面照射型cMOSカメラ PhotometricsPrime 95b高解像度、高速イメージングを可能にする高感度カメラ
光源LumencorSpectra X蛍光観測のためのLEDからの照明を提供します
 無限遠補正蛍光水浸対物レンズ、W.D. 2mm ニコンCFI60、試料の視覚化のための長い作動距離を提供します
ハロゲンランプ付き光ファイバーイルミネータースミタLS-DWL-Nは、明視野観察のための照明を提供します
W-View Geminiイメージスプリッター 浜松A12801-01ダイクロイックで区切られた1組の2波長像を1対投影
バンドバンドパスフィルター (512/25-25および630/92-25) セムロックFF01-512 / 25-25;FF01-630/92-25デュアルバンドイメージングが可能
560nm シングルエッジダイクロイックビームスプリッターセムロックFF560-FDi01-25x36光線を分離してデュアル波長イメージングを可能にするダイクロイックミラー
イメージングデータ収集システムニコンNIS エレメント - MQS31000イメージングデータ収集が可能
波長制御モジュールニコンMQS41220イメージングデータ用モジュール買収
エミッションスプリッターハードウェアモジュール NikonMQS41410イメージングデータ取得用モジュール
イメージングデータ解析システムNAVolumetry 8D5, フィジー蛍光強度やその他のイメージングデータの解析が可能
ダイさせる 神経します は シングル

参考文献

  1. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
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