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方法論記事

イメージング 2 光子生体顕微鏡を用いたインフルエンザ ウイルス感染症の中に気管粘膜の細胞相互作用

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DOI：

10.3791/58355

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2018年8月17日

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical Sciences, Institute for Research in Biomedicine, Università della Svizzera italiana (USI), 2Graduate School of Cellular and Molecular Sciences, Faculty of Medicine, University of Bern, 3Institute of Computational Science, Università della Svizzera italiana (USI)

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究ではマウスの気管粘膜のインフルエンザ ウイルスに感染後 2 光子生体イメージングと細胞の相互作用の解析を実行するためのプロトコルを提案する.このプロトコルは、呼吸器感染症の中に免疫細胞動態を調査している研究に関連するされます。

要約

細胞または細胞病原体相互作用体内の分析は、感染に対する免疫応答のダイナミクスを理解する重要なツールです。2 光子生体顕微鏡 (2 P IVM) は、画像集録中に生成された退色を最小限に抑えながら生きている動物、深部組織の細胞の相互作用の観察することができます。日には、リンパ系および非リンパ系臓器の 2 P IVM のさまざまなモデルが記載されています。ただし、呼吸器官のイメージングは、動物の呼吸サイクルに伴う動きのための挑戦を残ります。

ここでは、体内の免疫細胞の相互作用気管内 2 P IVM を使用してインフルエンザ ウイルス感染マウスを視覚化するプロトコルについて述べる.この目的に、手術手技と好中球と粘膜上皮における樹状細胞 (DC) の動的な画像の取得に続いて、気管挿管が含まれてカスタム画像処理プラットフォームを開発しました。また、気管内のインフルエンザ経鼻感染と流れフローサイトメトリー解析免疫細胞の実行に必要な手順を詳しく説明します。最後に、映画のコースの中に好中球 DC 運動との相互作用を分析しました。このプロトコルは、気管の細胞間相互作用の評価に必要な安定性と明るい 4 D 画像の生成のためできます。

概要

光子生体顕微鏡 (2 P IVM) は、彼らがその自然環境1で発生すると、リアルタイム イメージング細胞間相互作用のための効果的な手法です。この方法の主な利点の 1 つは他は従来のイメージング技術2と比較して試料の深さ (1 mm 500 μ m) で細胞プロセスの研究をできるということです。同時に 2 光子レーザーによって生成された 2 つの低エネルギー光子の使用は、画像集録プロセス2に通常関連付けられている組織の写真-損傷を最小限に抑えます。最後の十年の間にいくつかの分野3,4、5の細胞間相互作用の種類を勉強する 2 P IVM を適用されています。これらの研究は、特に彼らの高いダイナミズムと著名な連絡先の他の細胞と環境によって生成された信号を次の形成によって特徴付けられる免疫細胞を調査に関連するされています。2 P IVM は病原体とホストの6間の相互作用の研究にも適用されています。確かに、種類と、その結果、免疫応答7を妨げて免疫細胞間接触の期間、いくつかの病原体を変更できますは以前示されています。

気道粘膜は空輸の病原体に対する免疫応答が、最初のサイトは、8を生成されます。したがって、生体内でこの組織でホスト病原体の相互作用の解析は伝染の間にホストの防衛メカニズムの開始を理解する重要です。しかし、気道の 2 P IVM は主に画像の取得のプロセスを妥協する動物の呼吸サイクルによって生成される成果物のために挑戦。最近では、手術の異なるモデルは、イメージング マウスの気管9,10、11,12と肺13,14,15、について記載されています。 16。気管の 2 P IVM モデル肺肺胞 2 P IVM モデルが感染の後期の勉強するより適切な上気道における免疫反応の初期段階を視覚化するための優秀な設定を表します。肺を開発モデルを提示するレーザーの光の透過を制限し、肺の気道の粘膜を生体内でイメージ投射17 にアクセスできなくなる空気で満たされた肺胞の存在に関連付けられている制限.逆に、連続上皮によって形成された気管の構造は、画像の取得を促進します。

ここでは、インフルエンザの感染、動物の手術の準備、気管の 2 P IVM を実行に必要な手順の詳細な説明が含まれているプロトコルを提案します。さらに、好中球、樹状細胞 (DC) インフルエンザ ウイルス18,19 に対する防御機構の仲介人として重要な役割を果たす 2 つの免疫細胞の種類の可視化の特定の実験の設定を述べる.最後に、好中球 DC の相互作用を分析する手順をについて説明します。これらの連絡先は、DC の活性化を調節するために示されていると、その後20病原体に対する免疫応答に影響を与える。

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プロトコル

含むマウスはスイス連邦獣医局のガイドラインと動物のプロトコルに従って行われた動物のすべての手続きは、ローカル獣医当局によって承認されました。

1. CD11c YFP マウスのインフルエンザ

  1. バイオ セーフティ
    注:、(PR8) A/Puerto リコ/8/34 新型インフルエンザ a/h1n1 のマウス適応ひずみが受精卵の成長は、精製し、前述21として滴定します。すべての感染した動物や生物学的サンプルに関連する手順は 2 つの条件バイオ バイオ セーフティー レベル (BSL) によると内閣の下で実施。
    1. 感染症プロシージャの前後には、70% エタノール溶液による安全キャビネットをきれいに。
    2. 次適切な人にバイオ セーフティ指針 (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf) この手順中に生成される全ての廃棄物を破棄します。オートクレーブ容器の固形廃棄物および 70% エタノール溶液または医療消毒液で満たされたビニール袋に汚液を破棄します。
  2. インフルエンザの鼻腔内感染
    注: B6。Cg Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/J (CD11c YFP)22 c57bl/6 j の背景には、この研究で使用されました。マウスは、生物医学の研究所特定病原体無料施設で維持されました。
    1. 1 檻あたり最大 5 歳- と性別をマッチさせた (8 週齢に 6) CD11c YFP マウスを配置します。感染手順の前に住宅事情にマウス順化、少なくとも 2 日間待ちます。
    2. PR8 株式を解凍し、続けるウイルス希釈 30 μ L。 ダルベッコ リン酸バッファー生理食塩水は、200 のプラーク形成単位 (PFU) の最終的な集中を取得する塩化カルシウムと塩化マグネシウム (PBS) なし変更冷たいの 1 x を使用して対応する希釈を準備全体の手順中に氷の上
      注:使用前にインフルエンザ ウイルスのあらゆるバッチの滴定は正確な感染用量を確保するためお勧めします。
    3. ケタミン (100 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) の投与量を腹腔内に注入 (i. p.) 26 G 針 1 mL 注射器を使用しています。
    4. マウスが完全に麻酔 (立ち直りとペダルの逃避反射の完全な損失) まで待ちます。深い麻酔は、ない完全に麻酔下マウスが飲み込むか、または伝染の線量の変動につながるウイルスの接種材料を追放から最適な伝染に必要です。
    5. 仰臥位で, 麻酔下のマウスを置きます。ウイルスの接種材料の 15 μ L を収集します。マウスの左の鼻孔に近いピペット チップを置き、滴ずつ接種ウイルスを分配します。水滴を吸入する必要があります、鼻の空洞の中に直接それらのピペットはないです。
    6. 2-5 分を待ってから、ピペット チップを右の鼻にウイルスの接種材料の残りの 15 μ L を含みます。
      注: 窒息を避けるためには、小型滴を約 20 秒間隔で済ます。
    7. マウスが正しく呼吸は確認し、横褥瘡でケージに。マウスの呼吸と麻酔の回復 (誘導後約 60 分) を監視します。
      注: それは同時に 1 以上のマウスに感染する可能です。この場合、シーケンス内のすべてのマウスの左の鼻孔で接種ウイルスを管理、2-5 分待つし、右の鼻にウイルスを管理します。個体間のばらつきを避けるためには、同時に 3 つ以上のマウスに感染します。
    8. 動物の健康状態や体重減少を毎日監視します。
    9. 機関のガイドラインの定める人道的エンドポイントに従ってマウスを安楽死させます。安楽死法は動物実験当局によって承認されなければならないし、ローカル倫理規程を尊重する必要があります。2 光子の実験の後に、頚部転位続いてケタミン ・ キシラジンの過量投与によるマウスを安楽死させます。他の実験では、安楽死の方法として CO2吸入を使用します。
      注: 感染した気管、50% 組織培養感染量 (TCID50) アッセイまたは実質の時間のポリメラーゼの連鎖反応のウイルス抗体価を測定するには、(RT-PCR) 法は前述23として実行できます。
  3. フローサイトメトリーによる気管で好中球動員の評価
    注: プロトコルのこの部分はオプションです。それは評価気管粘膜インフルエンザ感染における好中球の動員を目指しています。
    1. CO2吸入することによって感染後 3 日目 (探偵) に感染し、感染していないコントロール マウスを安楽死させます。
      注: 気管の損傷を防止するためには、動物の安楽死頚部転位を使用しないでください。また、安楽死させたマウスの灌流血好中球からの汚染を避けるためにお勧めします。
    2. マウスの首を 70% エタノール溶液にスプレーし、胸から外科はさみを使用してあごに皮膚切開を行います。
    3. 鉗子を使用して唾液腺を分離し、, 気管を公開します。
    4. 鉗子、はさみを使用して気管の周りの筋肉を解剖します。
      注: この手順は、気管はプロシージャの間に簡単に破損している可能性がありますので慎重に実行する必要があります。
    5. 鉗子で気管を押しながら慎重に解剖して食道をデタッチします。
    6. 鉗子で気管の胸腔内の一部を保持して、気管支の初めに切開を行います。喉頭から気管をデタッチし、左の筋肉を注意深く取り外します。
    7. RPMI 1640 + HEPES 媒体 (RPMI) 氷の上を含む 1.5 mL チューブに器官を配置します。
    8. コラゲナーゼ (I および II) の 0.26 ユニット/mL と DNase の 0.2 mg/mL を含む気管消化酵素混合物を準備 RPMI で。
    9. 1 mL の酵素の混合を含む 6 ウェル プレートに切り裂かれた気管を配置します。
    10. 鉗子、はさみの助けを借りて、小さな断片に器官をカットします。このステップの間に氷の上プレートを保ちます。
    11. 45 分の 37 ° C で孵化させなさい。この時、プレート 15 分毎を振る。
    12. PBS で 1 mL の FACS 洗浄バッファー (2 mM EDTA および 2% 熱不活化フィルター滅菌ウシ胎児血清 (FBS)) を追加することによって酵素の消化力を停止します。
    13. 組織の部分的に未消化の部分の関連付けを解除するために 1 mL ピペットでソリューションを再懸濁します。
    14. 40 μ m ストレーナーを介してコンテンツを渡すことによって、また一つにソリューションを転送します。その後、優しくスマッシュ 2 mL シリンジのプランジャーを使用するストレーナーの上に閉じ込められた器官の残りの部分。
      注: こし器を気管の部分的に未消化の部分を破りフローサイトメトリー解析中に最適な細胞数を取得する重要なステップであります。
    15. 洗浄バッファーと転送氷で保たれる懸濁液 5 mL チューブ FACS で井戸とストレーナーを洗浄します。
    16. 4 ° C で 5 分間 166 x gでチューブを遠心分離します。上澄みを廃棄し、FACS 洗浄液を 100 μ l 添加の細胞を再懸濁します。
    17. フローサイトメトリー用抗体の表面汚損を続行します。簡単に言えば、CD16/32 表面の汚損に続いて抗体を用いた単離細胞の Fc 受容体をブロックします。好中球を正しく識別するには、流れの cytometry パネルは次の抗体を含める必要があります。 生存率と同様に、αLy6G、αCD11b、αCD45、死んだ細胞を除外する染料します。
    18. 流れの cytometer でサンプルの全体の内容を実行し、データを分析します。
      1. 免疫細胞の最適な数を取得するには、ない 3,000 イベント/秒以上の速度で単一細胞懸濁液を実行します。これは買収時に除外されたイベントの数を減らすでしょう。このプロトコルを使用して、それは 1 に 200 万気管あたりのセルを取得することが可能する必要があります。

2. 分離と好中球の注入

注: この手順では、B6.129 (ICR) の-Tg (CAG 生さ) CK6Nagy/J マウス (CK6 生さ) が使用されている24。これらの動物は、ヒト β-アクチン プロモーターの下のすべてのセル型で CFP を表現します。また、それも c57bl/6 j マウスを使用してセルを隔離して 2.6 の手順で説明されているプロトコルによると、それらを染色可能です。浄化および好中球の操作、活性化状態、潜在的、渡り鳥や機能のプロパティの変更が増加します。

  1. CO2吸入によって、動物を安楽死させます。
  2. 大腿骨と脛骨の両方を削除し、それらをきれいにやさしく鉗子を使用します。
  3. 骨骨を切り、氷で保たれる 50 mL のチューブで、滅菌冷 PBS でいっぱい 1 mL 注射器を使用して骨髄をフラッシュします。
  4. 18 G 針を用いて細胞を再懸濁し、40 μ m ストレーナー付け細胞懸濁液をフィルターします。4 ° C で 5 分間 110 x gで PBS で 1 回洗浄し、2 mL の冷 PBS で細胞を再懸濁します。
  5. 希釈 100% Percoll 9:1 10 x PBS で percoll 72%, 64%, 52 %1x PBS を使用してのグラデーションのソリューションを準備。慎重に 2 mL の各 15 mL チューブで 3 つのグラデーションをレイヤー、1 つを集中してから開始。
    1. 1,100 × g室温 (RT) 加速とブレーキなしで 30 分で 2 mL を慎重にグラデーションと遠心分離機の上に骨髄細胞懸濁液を追加します。
  6. 慎重に 64%、72% 間のインターフェイスでバンドを削除、200 x g冷 PBS の 4 ° C で 5 分間で一度洗います。Pbs 100 μ L のボリュームで細胞を再懸濁します、氷の上にそれらを保ちます。好中球の純度は 90% よりも高くなる予定です。
  7. 必要に応じて、ラベル好中球と製造元のプロトコルを使用して細胞増殖キット。最終濃度 1 mL の量で 10 μ M の細胞懸濁液に染料を追加、37 ° C、30 分インキュベート (166 x g、5 分) を洗います。
  8. 診断を用いた細胞濃度を推定し、26 G 針 1 mL 注射器、イメージングの前に 12 h を使用して以前の感染 CD11c YFP+マウスの 100 μ L の最大音量で静脈内 5 x 10 の6セルを挿入します。

3. イメージング用マウスを準備

  1. 麻酔
    1. 1.2.3 のステップによると接種後 3 日で感染した CD11c YFP+マウスを麻酔します。
    2. マウスは麻酔が深く、一度カテーテルが、麻酔は再投与することを備えることができます。
      1. 30 G 針を注射器鉗子を使用してから削除します。
      2. PE 10 医療シリコン チューブの 20 cm の部分に針を挿入します。
      3. チューブの反対側にケタミン ・ キシラジンの混合物でいっぱい 30 G 針の注射器を挿入します。
      4. チューブ内の空気を除去します。
    3. (図 1 a私) 自動換気を維持するために酸素 insufflating マシンからチューブに接続して 20 G カテーテルを準備します。100% 酸素ガス供給を使用して 0.2 mL の一回換気量を 130 ビート/分 (b.p.m。) の息比率を設定します。
  2. 手術のためマウスを準備します。
    1. 加熱平板または温水手術ベンチ 37 ° C で手術のすべての時間の設定上特定のカスタマイズされた手術ボード (図 1 aii-iii) 上でマウスを維持します。
    2. 電気かみそりや脱毛クリームを使ってマウスの首から髪の毛を剃る (図 1 b私).
    3. プラスチック マウス上のマウス位置を配置 (図 1 aii で)、位置情報の外部動物の頭部を維持する (図 1 bii) 気管挿管を容易にする角度を作成します。
    4. 前肢、足と尾、サージカル テープ固定、濃縮ビタミン A ゲルでマウスの目を湿らし、マウス首 (図 1 bii) を消毒します。
  3. 手術
    1. 正しくオートクレーブ項目、すなわち、はさみ、顕微鏡のハサミ、鉗子を準備します。
    2. 首、胸の上部と下顎骨 (図 1 biii) の低い点を通る線の間の中流域で約 1 cm 長い、長い内側の軸に小切開を実行します。
    3. 皮膚パッチや唾液腺横移動し、筋肉で覆われて、気管を視覚化します。その後、鉗子 (図 1 biii) を慎重に使用する気管の筋肉を解剖します。
    4. カテーテルでマウスを挿管し、人工換気 (図 1 biv) を開始します。
      注: カテーテルは、気管の粘膜と内側の鉄針保護外部プラスチック部分で構成されます。針のプレゼンスを拡張して気管を安定させると、博覧会を規制するための理想的なソリューションを表します。カテーテルによる人工換気は、マウスの適切な呼吸が保証されます。
    5. すぐに呼吸モニター マウスに人工換気を開始します。
    6. カテーテルの高さと手術の基板 (図 1 aii b) 特定のロッドに接続されている手術フック (図 1 bv) を使用して方向を修正します。あごの同じ高さで気管を公開します。
    7. ワセリンと気管を囲み、臓器 (図 1 bvi) に適切な水分補給を保証する事前に加熱された PBS を数滴でそれをカバーします。
    8. Coverslip の準備の上にマウントします。この手順では、XYZ の翻訳者 (図 1 aii c) にねじ込み、金属ホルダー (図 1Bvii) の coverslip を接着します。手術の準備の上に coverslip を配置する XYZ 翻訳を調整します。
    9. 腹腔内麻酔の管理のためのカテーテルを置く (図 1Bviii)。
    10. ケタミン ・ キシラジン混合物 30 分毎の初期投与量の 50% を挿入します。
      注: 最初のケタミン ・ キシラジンの混合物の 25% から 50% 再投与は安全で有効な代替25です。ただし、このプロトコルは、端末全体の手順中に動物の厳格な固定が必要なので、麻酔の深い外科平面を維持するために高用量を使用します。

4.体内タイムラプス イメージング

注: 画像の取得は 25 X、恒温培養室、2 つの Ti:Sa レーザーを装備、直立二光子励起顕微鏡で行った/NA 1.1 水浸対物レンズです。フォトマル (PMT) 画像の取得に使用されたハイブリッド検出器または高感度 GaAsP。

  1. (37-38 ° C に予熱) 顕微鏡培養チャンバー内麻酔下のマウスを使って手術のボードを配置し、上、水の滴を追加します。
  2. 気管の組織にフォーカスをセンターと検索。
  3. 520 × 520 ピクセル、440 × 440 μ m2のビューのフィールドでスキャン周波数を 800 Hz に設定し、線の平均 1。
    1. 曲 Ti:Sa レーザー 830 nm からコラーゲン、150 のソースで電力の指示と第二高調波発生 (SHG) を励起する mW。920 で 2 番目の Ti:Sa レーザーをチューニング 94 nm mW CFP と YFP の両方を刺激するソース。
    2. 設定 3 D と同時励振タイムラプス アクイジション ・ モード
      注: は、退色と光毒性を最小限に抑えるため可能な限り低レーザー力を保持します。
  4. 560 でマスター ダイクロイック ミラーとの非 descanned モードで 2 つのチャネルを使用してレコードの蛍光 nm。このプロトコルで使用され、セットアップの 2 番目のダイクロイック ミラー分割 495 で信号分離する nm チャンネル チャンネル 2 (排出フィルター 525/50) から 1 (排出フィルター 475/50) (図 2 a)。この構成収集 SHG 光の最初のチャネルのコラーゲンから CFP 排出が両方のチャンネル 1 と 2 で収集され、YFP チャンネル 2 でのみ収集されます。
  5. Z 軸は、3 μ m (ボクセル サイズ 0.86 μ x 3 μ m) のステップ サイズの範囲 50 μ m を定義します。記録画像すべて 30 秒 30 分の合計時間。
  6. 必要な場合は、複数の領域を取得します。さらなる買収を実行する前にバイタル サインをチェックし、(手順 3.3.10 参照) 必要な場合はカテーテルを麻酔を膨らませてください。
  7. イメージング プロセスの最後に、頚部転位続いてケタミン ・ キシラジンの過剰摂取によるマウスを安楽死させます。

5. 画像好中球 DC 運動との相互作用の処理と定量解析

注: このプロトコル専門イメージング ソフトウェアが顕微鏡データの分析に使用されました。

  1. 4 D 画像集録が完了すると、十分な計算リソースを持つワークステーションにファイル (データおよびメタデータ) を転送 (推奨最小システム要件: 32 GB の RAM、高速固体-国家-ドライブ、最近の CPU 専用の GPU に基づいて、大規模な並列アーキテクチャ)。
  2. イメージング ソフトウェアでファイルを開きます。
  3. ビデオを再生し、興味のセルが明確に表示されている画像のアーティファクトが存在しないことを確認します。
    注: このため、サンプルの動きに輝度変化が十分に限られていることを確認します。確かに、これらは自動解析26のための課題を表しています。隣接するフレーム間のサンプルの動きが過剰な場合は、固定基準として例えば SHG チャネルを使用してドリフト補正法を適用します。これにより、セルの動きではなく、サンプルの動きより測定。さらに、明るい背景や破片、選択パラメーターとしてボリュームを使用して再建されたサーフェスを切り取る。
  4. CFP とコラーゲン (SHG) の間の信号を分離するために CFP+のセルに特定の共局在チャネルを生成します。このため、緑のチャネルと青のチャンネルの両方に肯定的な強度を有するボクセルのみを選択する (図 2 b私) ゲート ポリゴンを示します。
    注: この手順は、顕微鏡のフィルター セットと細胞の染色によると異なる場合があります。グリーンとブルーのチャンネルの両方に十分な強度を持つボクセルのみを選択することによって実現できます。使用可能なツールの中で強度閾値に基づく共存チャネルを自動的に計算する「coloc」機能を使用できます。 されますさらに、機械学習に基づく手法は、専門家の27の監督でこの手順を使用できます。
  5. 検出し、CFP+セル、自動表面再構成と共局在を適切なチャネルでトラッキング (表面ツール) を追跡します。
    メモ: 最終的なトラッキング エラーの手動のキュレーションと定義されたしきい値 (すなわち150 s) よりも短い期間でのトラックの除外必要があります。
  6. CFP と YFP の信号を分離するために CD11c YFP+のセルに特定の共局在チャネルを生成します。このため、ゲート多角形 (図 2 bii) 緑のチャンネルで肯定的な強度が、青チャンネルの低強度を有するボクセルのみを選択するを示します。
    注: チャンネル 1、チャンネル 2、CFP の共局在チャネル、YFP のための共局在のチャネルすべてのチャンネルの組み合わせからの信号を示す代表的な顕微鏡写真を図 2 biiiで見つけることができます。
  7. CD11c YFP+細胞の表面を再構築し、時間 (サーフェス ツール) をかけて自分の位置を追跡します。
    メモ: 最終的なトラッキング エラーの手動補正はこのステップの必要はありません。確かに、DC の複雑の時空間的ダイナミクスによる 2 P IVM データから正確な表面を再構築は利用できる分割ソフトウェアでは実現できないやりがいのある作業です。挑戦的なこの作業を行う理由の間で細長い突起明るさ変化できないと平滑化フィルターまたは静的しきい値など、特定の画像処理技術の利用のため。さらに、DC のネットワークでは、2 P IVM データの外見だけに基づいて単一の細胞を分離することは困難です。これらの理由はソフトウェアのパラメーターをチューニングすることによって正確な分割をしようとするのではなく、DC の非正確なサーフェスを再構築する提案します。5.8 で説明されているよう、堅牢な指標による可能性のあるエラーを処理します。
  8. 細胞の移動を測定します。
    1. CFP+と CD11c YFP+細胞の古典的な移行措置をエクスポートします。、これらの中で「トラック速度平均」は、セルの方向性を示す「真直度」を追跡しながらセル平均移動速度を示します。これらの措置は、イメージング ソフトウェアからスプレッドシート ファイルとしてエクスポートできます。
    2. エクスポートされたスプレッドシート ファイルの計算 (修正された閉じ込め比とも呼ばれる)」修正トラック直」「トラック直」の平方根で乗算として定義されている CFP+と CD11c YFP+細胞では、「実行期間を追跡"ビデオ デュレーションの平方根で割った値。この対策は、28、トラッキング エラー由来のインスタンスを追跡短いの存在下で「真直度を追跡する」よりも堅牢です。
      注: 同じ長さの動画だけは、このメジャーと比較できます。
  9. 細胞間相互作用を測定します。
    1. (最も近いボクセル) の距離がしきい値 (すなわち2 μ m) よりもより小さいか等しい場合は、CFP+ 、CD11c YFP+セル間の接触を定義します。
      注: このしきい値は十分に厳密な近接セルが場合にのみ、連絡先を検出するはずです。しかし、我々 はこのしきい値を N ボクセル半径よりも大きい回理想的には 0 より大きい値に保つためにお勧め (N > 2)、境界線が平滑化ことができる細胞の再構築を実際のセル サイズよりも小さいので。
    2. CFP+と CD11c YFP+細胞間の接触の期間との数をカウントします。イメージング ソフトウェアにこの行うことができます例えば「キスと実行」プラグインを実行することによって。これらの措置は、[統計] タブからスプレッドシート ファイルとしてエクスポートできます。
  10. 統計ソフトウェアで以前に計算されたメジャーをインポート、プロットを生成し、統計的検定を実行します。

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結果

この作品で述べるvivoにおける詳細なプロトコル運動と好中球と DC の間の相互作用マウスの気管 (図 3 a) でインフルエンザ感染中。この目的を分離 CFP+好中球 (純度 92%;図 3 b)CK6 生さからマウスと我々 に対してそれらに転送 CD11c YFP マウスではインフルエンザに感染します。その後、我々 は接種後 3 日で気管の 2 P IVM を実行フローサイトメトリーによる解析 (図 3) で示すように、この時点では、感染部位に好中球の明確な募集を観察しました。2 P IVM プロトコル齧歯動物 (図 1 a) の特定の手術ボードと酸素供給器の使用が必要です。呼吸、気管の博覧会を促進し、制御する器官の動き (図 1 b...

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ディスカッション

この作業は、マウスの気管にインフルエンザ感染に対して転送された好中球と DC との相互作用の移行を示す 4 D 画像の生成のための詳しいプロトコルを示します。説明 2 P IVM モデルは気道感染症における免疫細胞動態に関連します。

最近では、気道の細胞動態の可視化に基づくいくつかのモデルは先進9,10、11,12,13,14,15 をされています。 ,16。ただし、肺の生体内イメージングはまだやりがいのある、このオルガンと呼吸サイクル...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、スイス国民基金 (SNF) 補助金 (176124、145038, 148183)、欧州委員会マリー キュリー復帰グラント (612742) や D.U.P. への交付金の SystemsX.ch によって支えられた (2013/124)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Gigasept instru AFSchülke &Mayr GmbH4% solution
CD11c-YFP マウスジャクソン研究所008829マウスを自社で飼育
CK6-ECFP マウスジャクソン研究所004218マウスを自社で飼育
1x ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 Choride と塩化マグネシウムを使わずに修飾SigmaD8537-500ML
10x ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水は、チョライドカルシウムと塩化マグネシウムなしで修飾SigmaD1408-500ML
Percoll PLUSSigmaE0414-1L4°C で保存します。C
ケタミン ラバテックラバテック ファーマ7680632310024RT で保管、4 °C で保管。C ケット/キシル混合物の溶液中
ロンプン 2% (キシラジン)バイエル6293841.00.00RT で保存、4 °で保存;C ket/キシル混合物
26 G 1 mL Sub-Q BD PlastipakBD Plastipak BD Plastipak305501
30 G, 0.3 mL BD Micro-Fine Insulin SyringesBD324826
Falcon 40 µm Cell StrainerCorning352340
2 mL シリンジBD Plastipak300185
Microlance 3x 18 G ニードルBD304622
Introcan Safety 20 G (カテーテル)Braun4251652.01
6 Well Cell Culture ClusterCostar 3516
RPMI medium 1640 + HEPES (1x)ThermoFisher Scientific42401-0184°Cで保管。C
リベラーゼ TL 研究用グレードロシュ5401020001-20 °C;C /コラゲナーゼ(IおよびII)混合物
DNAse IAmresco(VWR)0649-50KU-20°Cで保存。C
CellTrace バイオレット染色ThermoFisher ScientificC34557-20°C;C
EDTAシグマEDS-500G
ウシ胎児血清Gibco10270-106-20 °C で保管。C
PE-10マイクロ医療用チューブ2生物学的機器SNC#BB31695-PE / 1
外科用プラスチックテープMプラスト
ビスコティアーズボシュ&RT
粘土Ohropax
高許容ガラスカバースリップ15ミリメートルラウンドワーナーインスツルメンツ64-0733
SomnoSuiteポータブル動物麻酔システムケントサイエンティフィックSS-01
Nuvoライトマーク5GCEメドライン14111211
MiniTag(ガス状麻酔と加熱ベンチ)テムセガ
サージカルボードベルン
トリムスコープII 2光子顕微鏡LaVision Biotec
Chameleon Vision Ti:SaレーザーCoherent Inc.
25X NA 1.05水浸対物レンズリンパスXLPLN25XWMP2
キューブ&ボックスインキュベーションチャンバーと温度コントローラーライフイメージングサービス
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