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方法論記事

植物活性酸素種体内はアニオン性セリウム酸化物ナノ粒子の触媒の清掃

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DOI:

10.3791/58373

⸱

2018年8月26日

 ,  ,  , 
1Department of Botany and Plant Sciences, University of California, 2Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここ生体内で、生体内および共焦点顕微鏡による植物組織のイメージング nanoceria 清掃合成と ROS (活性酸素種) のセリウム酸化物ナノ粒子 (nanoceria) の特性のプロトコルを提案します。nanoceria ROS は、共焦点顕微鏡による清掃を監視します。

要約

活性酸素種 (ROS) の蓄積は、非生物的ストレスに対する反応の特徴です。ROS は、低レベルでの分子のシグナル伝達と高いレベルでの分子の損傷として植物デュアル役割を果たします。重点を置かれた植物における活性酸素の蓄積は、代謝、酵素、脂質、および植物生育・収量の減少を引き起こす DNA を損傷することが。触媒生体内で活性酸素を消去するセリウム酸化物ナノ粒子 (nanoceria) の能力を理解するユニークなツールと強酸工場非生物的ストレス耐性を提供します。ここでは、合成しポリ (アクリル) 酸コーティング nanoceria (PNC) を特徴付ける、植物葉葉身浸潤によるナノ粒子をインタ フェースし、その分布と活性酸素が生体内で共焦点を使用して清掃を監視するためのプロトコルを提案します。顕微鏡検査。ROS 集積植物の操作のため現在の分子ツールはモデル種に限定され、面倒な変換方法を必要とします。体内ROS が清掃のためこのプロトコルには、広い葉とシロイヌナズナのような葉の構造を持つ野生型植物に適用される可能性があります。

概要

セリウム酸化物ナノ粒子 (nanoceria) は、バイオ エンジニア リング、清掃能力1,2,3異なる触媒活性酸素種 (ROS) のために基礎的研究から、生物で活躍しています。Nanoceria 清掃能力を交互に 2 つ酸化状態 (Ce3 + Ce4 +) 4,5,6表面酸素空孔の数が多いためロスがあります。Ce の3 +ダングリングボンドは、ナノスケールでの格子ひずみが酸化還元反応7をサイクリングを介してこれらの欠陥サイトの再生を促進しながら効果的に ROS を清掃します。Nanoceria はまた最近使用された勉強のと工学植物機能8,9。非生物的ストレス下の植物は、活性酸素、脂質、蛋白質および DNA10への酸化ダメージの蓄積を経験します。シロイヌナズナ植物で高い光・熱・低温応力8の下で改良された植物の光合成につながる体内ROS の nanoceria 触媒の清掃します。土壌もコムギ (Triticum aestivum)11; 増加撮影バイオマスと子実収量に適用する nanoceriananoceria で治療 (ナタネ) のカノーラ植物塩ストレス12の下でより高い植物バイオマスがあります。

Nanoceria は、バイオ エンジニア リングを提供し、植物の生物学者非生物的ストレス反応を理解し、工場の非生物的ストレス耐性を高めるナノテクノロジー ベースのツール。Nanoceria の生体内ROS 清掃機能は植物種の独立して植物組織に安易な配信モデル有機体の外の幅広いアプリケーションを有効にする可能性があります。他の遺伝子ベースのメソッドとは異なり、nanoceria では清掃能力13高い ROS の抗酸化酵素の発現と植物の行を生成する必要はありません。植物に nanoceria の葉葉身浸潤は、研究室での研究のための実用的なアプローチです。

1) 合成負荷電ポリ (アクリル) 酸 nanoceria (PNC) の評価、2) 配信とリーフ セル全体 PNC の追跡との PNC が有効な ROS 清掃の 3) の監視を記述するこのプロトコルの全体的な目標は、します。vivo。このプロトコルでは、負荷電ポリ (アクリル) 酸 nanoceria (PNC) が合成、吸収スペクトル、流体力学的直径とゼータ電位が特徴します。葉植物に PNC を提供する単純な葉葉身溶浸法について述べる。葉肉細胞内で分布をナノ粒子の生体内イメージングのため蛍光染料 (DiI) は PNC (DiI PNC) にラベルを付けるし、共焦点蛍光顕微鏡によるナノ粒子の観察に使用されました。最後に、我々 は生体内でPNC ROS は、共焦点顕微鏡による清掃を監視する方法を説明します。

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プロトコル

1. aの植物の成長

  1. 標準的な土壌ミックス 5 cm x 5 cm 使い捨て鉢シロイヌナズナ種子をまきます。これらのポットの 32 を入れ水で満たされたプラスチック製のトレイ (〜 0.5 cm) と植物育成装置に植物とプラスチック製のトレイを転送。
    1. 次のように成長の部屋の設定: 200 µmol/ms 光合成有効放射 (PAR)、24 ± 1 ° C の日と 21 ± 1 ° C 夜、湿度 60%、14/10 h 昼/夜光政権、それぞれ。
  2. 発芽から 1 週間後 1 つだけの個々 の植物を残してそれぞれのポットを薄い。各ポットに同じようなサイズを持つ実生植物を保つために注意してください。
  3. 水は 2 日に一度プラスチック製のトレイに直接水道水を注いで鍋。4 週間以内に植物を育てます。シロイヌナズナ植物はそれ以上の使用の準備ができています。

2 PNC の合成とキャラクタリゼーション

  1. 硝酸セリウム (III) の 1.08 g の重量を量るし、分子生物学グレード水 50 mL の円錐管に 2.5 mL に溶かします。
  2. ポリ (アクリル) 酸の 4.5 グラムの重量を量るし、分子生物学グレード水 50 mL の円錐管に 5 mL に溶かします。
  3. デジタル渦のミキサーを使用して 15 分の 2,000 rpm で徹底的にこれらの 2 つのソリューションをミックスします。
  4. 水酸化アンモニウム溶液 (7.2 M) 15 mL を 50 mL のガラス製ビーカーに転送します。
  5. を 500 rpm で攪拌しながら水酸化アンモニウム溶液に滴下ステップ 2.3 から混合物を追加し、発煙のフード 24 時間室温で 500 rpm で攪拌します。
  6. 一晩反応中に解決策の大幅な損失を避けるために紙の部分でビーカーをカバーします。
  7. 24 h 後得られた溶液を 50 mL の円錐管に転送し、可能な破片と大きな塊を削除する 1 時間 3,900 × g で遠心。
  8. 3 15 mL 10 kDa フィルターにこの 22.5 mL の上澄み溶液を移すし、合計 45 mL の希釈を行う分子グレード水フィルターの残りを埋めます。
  9. 無料ポリマーから水相を浄化し、ベンチトップ遠心 15 mL 10 kDa フィルター 3,900 × g で 15 分間遠心し、上清を追加することによって、その他の試薬は、少なくとも 6 回この手順を繰り返します。
  10. 無料ポリマーがないように 220-700 nm の紫外可視分光光度計の各サイクルで溶離液の吸光度を測定、その他の試薬が PNC の最終的な解決策であります。
  11. 5 mL シリンジに収集した PNC ソリューションを取るし、20 nm 孔サイズのシリンジ フィルターに対してフィルター処理します。50 mL の円錐管にフィルタ リングの PNC ソリューションを収集します。
  12. プラスチック キュベットで最終 PNC 薄めたと 220-700 nm の紫外可視分光光度計での吸光度を測定します。PNC 吸光度のピークは、271 nm。
  13. ビール-ランバートの法則を使用してその濃度を計算する: A = εCL。A はある特定のサンプルのピーク値の吸光度、ɛ PNC (cm-1 M-1) のモルの吸収係数はある、L は光路長 (このメソッドで 1 cm キュベット幅) および C は測定されたナノ粒子のモル濃度。
  14. 流体力学的直径とアナライザーを使用して、粒子サイズとゼータ電位 (図 1) 合成 PNC のゼータ電位を測定します。
  15. さらに使用するまで冷蔵庫 (4 ° C) で最終の PNC ソリューションを格納します。
    注: は、呉らを参照してください。8 PNC の特性の詳細についてはプロトコルです。

3. DiI 蛍光染料との PNC のラベリング

  1. グレード水 20 mL ガラス瓶の分子生物学の 3.6 ml 5 mM (58 mg/L) PNC の 0.4 mL を混合し、500 rpm で攪拌します。
  2. 24 μ L 1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine 過塩素酸色素溶液を追加 (DiI、2.5 mg/mL の DMSO の希薄) 176 μ L DMSO (ジメチルスルホキシド) DiI 色素希釈するのに。
  3. PNC 溶液、周囲温度で 1 分間 1,000 rpm で攪拌する滴下 DiI 染料を追加します。
  4. 15 mL 10 kDa フィルターにこの得られた混合物を転送し、合計の希釈をする分子生物学グレード水で上に管を埋める 15 mL。
  5. ベンチトップ遠心分離によって DMSO や可能な無料 DiI 染料から PNC (DiI PNC) ソリューションを付け 5 分 3,900 × g で 15 mL 10 kDa フィルター DiI を浄化します。
    1. ステップ 3.5 を少なくとも 5 回繰り返します。
  6. 20 nm 孔サイズのシリンジ フィルターを通して DiI PNC 解をフィルターします。
  7. 紫外可視吸光光度法による最終 DiI PNC の吸光度を測定し、ビール ランベルトの法則 (図 2) によるとその濃度を計算します。詳細については、ステップ 2.13 を参照してください。
  8. それ以上の使用のための 4 ° C で冷蔵庫で保管してください。

4. 植物の浸透の PNC と葉します。

  1. 浸潤の 0.1 mL を追加し 0.9 mL 0.5 mM PNC または DiI PNC ソリューションと渦にそれ (100 mM TES は、100 mM の MgCl2、pH 7.5、HCl で調整) をバッファーします。ネガティブ コントロールとして 10 mM TES 浸潤バッファーのソリューションを使用します。
  2. PNC または DiI PNC 浸潤液 0.2 mL を 1 mL の滅菌無針注射器に転送します。可能な限り空気の泡を削除するをタップします。
  3. 直前に部屋の光条件下で可能な気孔の閉鎖を避けるためにナノ粒子を浸透成長室から工場を取得します。
  4. 浸潤前に葉緑素計を用いた同様のサイズとシロイヌナズナの葉のクロロフィル含量を測定します。測定の各葉 3 つのレプリケート (複製が少なくとも 3 つの測定から成る各)14。シロイヌナズナの葉ようなクロロフィル量と浸透実験を選択します。
  5. 葉の葉身 (中位) の底面に対して無針注射器の先端を軽く押す最近準備 PNC または DiI PNC ソリューションでゆっくりと葉に潜入し、ピストン (図 3A) を低下させます。
  6. 優しく繊細なタスク ワイパー (図 3C) を使用して葉葉身 (図 3B) の表面に残っている余分なソリューションを拭き取るし、植物にラベルを付けます。葉のグループごとに新しい繊細な作業のおしりふきを使用します。
  7. 浸透したシロイヌナズナの葉への適応と 3 h の PNC または DiI PNC と孵化のベンチに植物を維持します。
    注: 浸透したシロイヌナズナの植物は、さらに使用 (図 3D) の準備されます。

5. 共焦点の顕微鏡検査のための葉のサンプルの準備

  1. ロール観測量エンドウ豆サイズ 1 cm 半径 (図 4A) に関するへのゲルし、1 mm 薄いガラス スライド (図 4B) それまで広げています。
  2. コルクの穴あけ器を使用 (直径 0.3 cm) スライド ガラス (図 4C) 観察ゲルの中央に円形断面をカットします。
  3. 葉の組織のより深くより良い共焦点イメージング解像度 perfluorodecalin (PFD) も完全にカットを入力します。
  4. コルクの穴あけ器を使用 (直径 0.2 cm) 適応 DiI PNC からリーフ ディスクを収集するシロイヌナズナ植物 (図 4D) に潜入します。
  5. いっぱい PFD のリーフ ディスクをマウントします。葉の浸潤 (裏面) 側を表向きにします。
  6. リーフ ディスク上に正方形 coverslip を入れて軽く押して、スライド上に均等に、観測ゲルの井戸とそれを封印し、気泡に閉じ込められた (図 4E) 残っていないか確認します。

6. 共焦点顕微鏡による葉の組織の DiI PNC のイメージング

  1. 倒立レーザーを共焦点顕微鏡で 40 倍の対物レンズを使用します。
  2. 2 ~ 3 滴 ddH2O 40 X 対物レンズの上にドロップします。
  3. 倒立 40 × 対物レンズの上に準備された DiI PNC 潜入葉サンプル スライドを配置します。
    1. Coverslip 側がないレンズに ddH2O と直接の接触をスライド ガラスであることを確認します。
  4. レーザー光と明るいフィールド顕微鏡下でサンプルの興味の領域を見つけます。
  5. 顕微鏡のソフトウェアを起動し、(20% で設定) アルゴン レーザーをオンにします。
  6. 2 μ m と 4 のラインの平均よりも小さい光学的スライスを収集するためにピンホールを設定します。
  7. 共焦点顕微鏡の設定でサンプル画像: 514 nm レーザ励起 (30%)Z スタック セクション厚さ: 2 μ m;PMT1: 550 615 nm (DiI PNC 用);PMT2: 700-800 nm (葉緑体用)。
  8. 異なる個体が、3 つの生物学的複製の最小値からの葉のサンプルの代表の共焦点画像を取る。

7. PNC体内ROS 清掃共焦点顕微鏡によるイメージング

  1. 準備 25 の μ M 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein セルロースジ アセテート (H2DCFDA、一般的な ROS を示す色素) と 10 μ M dihydroethidium (dhe は、スーパーオキシドアニオンを示す色素) 1.5 mL 遠心チューブに TES 浸潤バッファー (pH 7.5) の染料別に。
  2. コルクの穴あけ器を使用 (直径 0.2 cm) の葉を収集する適応の PNC からディスク潜入シロイヌナズナ植物。
    1. 染料のローディング プロセスを加速するためのリーフ ディスク 3 に 4 穴を作るためには、鉗子の先端の鋭利なを使用します。
  3. 転送葉別途が DCFDA と DHE が H2マイクロ遠心チューブ用にディスクし、暗闇の中で 30 分間インキュベートします。
  4. インキュベーション後、リーフ ディスク ddH2O 3 回リンスと観察とスライド ガラスにマウント ゲル (プロトコルのセクション 5 を参照)。
  5. 共焦点顕微鏡のスライドを置くし、葉肉細胞の領域に手動で焦点を当てます。詳細については、プロトコルのセクション 6 を参照してください。
  6. UV にリーフ ディスクを公開 (405 nm) レーザー ROS を生成し、リーフ ディスクごとの時系列 (「xyt」) に ROS の信号強度の変化を記録する 3 分間。
  7. リーフ ディスク共焦点顕微鏡の設定を画像: 40 X 水目的;496 nm レーザー励起;PMT1: 500-600 nm (DHE と検出するため DCFDA 染料);PMT2: 700-800 nm (葉緑体を検知します。ネガティブ コントロールとしてのみ浸潤緩衝液を浸透させた植物を使用します。

8. PNC 清掃の H2O2体外

  1. 以前の出版物3,8,15の方法に従うことによって生体外で合成 PNC の猫 (カタラーゼ) 模倣活動を行う
  2. 追加 45.4 μ L 1 x TES 浸潤のバッファー (10 mM 10 mM MgCl2、TES pH 7.5、HCl で調整)、PNC (60 nM、3 μ L) と H2O2 (2 μ M、1 μ L) (白丸底 96 ウェル プレート)、井戸の中へと軽くピペッティングで混ぜます。
  3. 追加 10-アセチル-3, 7-dihydroxyphenoxazine (作業濃度 100 μ M、0.5 μ L) と西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP; 作業濃度 0.2 U/mL、0.1 μ L) 同様に軽くピペッティングで混ぜるし、30 分 10-アセチル-3, 7-dihydroxyphenoxazine の孵化H2O2と反応し、HRP の存在下でアセチルレゾルフィンに変換されます。
    1. 孵化の間に光を避けるためにアルミ箔でプレートをラップします。
    2. H2O2を置換する反応バッファーか水を用いたネガティブ コントロールを準備します。
    3. 原液を除いて周囲温度で他のすべてのソリューションを準備します。
  4. プレート リーダーで、孵化後 560 で吸光度を監視 H2O2のレベルを示すためらを使用する nm。0、2、5、10、20、および 30 分に時間体制を設定します。

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結果

PNC の合成とキャラクタリゼーション.
PNC 合成、精製し、次のプロトコル セクション 2 で説明されているメソッドの特徴します。図 1Aは、硝酸セリウム、PAA、PNC と PAA、硝酸セリウムの混合物溶液の呈色反応を示しています。白から淡い黄色の色の変化は、PNC は合成後に見られています。10 kDa フィルターで浄化後、PNC は紫外可視分光光度計で特徴付けられました。PNC の吸光度のピークが観測された 271 nm (図 1B)。最終的な溶離液は紫外-可視非反応した化学物質が浄化洗浄したことを確認するためにも測定しました。流体力学的直径と合成の PNC のゼータ電位は、粒子 sizer とゼータ電位分析 (図 1

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ディスカッション

このプロトコルでは、PNC 合成、キャラクタリゼーション、蛍光色素標識、および体内ROS 清掃活動を展示する植物葉肉細胞中のナノ粒子の共焦点レーザー顕微鏡について説明します。PNC は硝酸セリウムと PAA 溶液水酸化アンモニウムの混合物から合成されます。PNC は吸収 spectrophotomery とビール アンティーク法を用いて濃度によって特徴付けられます。ゼータ電位測定は、葉緑体8への配信に向けた PNC の負荷電の表面を確認しました。ナノ粒子が葉緑体をもつ共存の高レベルを示す葉肉細胞内共焦点顕微鏡による生体内イメージングを有効に DiI の蛍光染料との PNC の分類します。Dhe は、DCF の蛍光染料を使用すると、活性酸素と体内の活性酸素の強力なスカベン ジャーとして PNC 法を確認しました。

PNC を合成する方法は、コントロールのサイズ、負電荷と清掃機能16ROS とセリウム酸化物ナノ粒子を生成する単純なステップ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この仕事に支えられたカリフォルニア大学、リバーサイドおよび米国農務省国立食品研究所、農学部ハッチ プロジェクト 1009710 J.P.G.この材料は、J.P.G. に許可第 1817363 の下での国立科学財団によってサポートされる作業に基づいてください。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
硝酸セリウム(III)六水和物Sigma-Aldrich238538-100G
分子生物学グレード水、コーニングVWR45001-044 
ファルコン 50 mL コニカル遠心分離管VWR14-959-49A
ポリ (アクリル酸) 1,800 MWシグマ-アルドリッチ323667-100G
フィッシャーブランド デジタルボルテックスミキサーフィッシャーサイエンティフィ02-215-370
フィッシャーブランド デジタルボルテックスミキサーアクセサリー、インサートリテーナーフィッシャーサイエンティフィ02-215-391
フィッシャーブランドデジタルボルテックスミキサーアクセサリー:フォームインサートセットフィッシャーサイエンティフィック02-215-395
酸化アンモニウム溶液シグマアルドリッチ05002-1L
PYREXグリフィンビーカー、卒業、コーニングVWR13912-149 
RCT基本的なIKA3810001
エッペンドルフ微量遠心分離機5424VWR80094-126
ミコンウルトラ15遠心フィルターユニットミリポアシグマUFC901024
アレグラX-30シリーズベンチトップ遠心分離機ベックマンコールターB06314
UV-2600スペクロフォトメーター島津製作所UV-2600 120V
Whatman Anotop 10 シリンジ フィルターSigma-AldrichWHA68091102
BD 使い捨てシリンジ Luer-Lokチップ付きフィッシャー サイエンティフィック14-829-45
Zetasizer Nano SMalvern PanalyticalZen 1600
1,1′-ジオクタデシル-3,3,3′,3′-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩Sigma-Aldrich42364-100MG
ジメチルスルホキシド、ACSVWRBDH1115-1LP
サンシャイン ミックス #1 LC1グリーン アイランド ディストリビューターズ インク5212601.CFL080P
Adaptis 1000ConvironA1000
TES、>99% (滴定Sigma-AldrichT1375-100G
塩化マグネシウムSigma-AldrichM8266-1KG
エアタイト オールプラスチック ノーマルジェクト シリンジフィッシャー・サイエンティフィック14-817-25
キンバリー・クラーク プロフェッショナル キムテック・サイエンス キムワイプ デリケート・タスク・ワイパーフィッシャー・サイエンティフィ06-666A
カロライナ観察ジェルカロライナ132700
コーニング顕微鏡スライド、つや消し片面、一端シグマ・アルドリッチCLS294875X25-72EA
コルクボーラーハンドル付きセットフィッシャーサイエンティフィックS50166A
パーフルオロデカリンSigma-AldrichP9900-25G
マイクロカバーメガネ スクエア No. 1VWR48366-045
ライカ レーザー走査型共焦点顕微鏡 TCS SP5ライカ マイクロシステムズTCS SP5
2′,7′-ジクロロフルオレシン ジアセテートSigma-AldrichD6883-250MG
ジヒドロエチジウムSigma-AldrichD7008-10MG
フィッシャーブランド プレミアム微量遠心チューブ: 1.5 mLフィッシャーサイエンティフィック05-408-129
エッペンドルフ Uvette キュベットシグマ-アルドリッチZ605050-80EA
クロロフィルメーター コニカミノルタSPAD-502
ック ック 水アック

参考文献

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