第三令キイロショウジョウバエの中枢神経活動の電気生理学的記録

サマリー

このプロトコルは、コスト効率的かつ便利な神経蛋白質の遺伝の突然変異の薬理学的エージェントのテストを有効にするショウジョウバエ中枢神経系の降下の電気的活動を記録する方法をについて説明しますや未踏の生理学的経路の役割。

要約

現在利用可能な殺虫剤の大半は神経系をターゲットし、無脊椎動物神経蛋白質の遺伝の突然変異はしばしば有害な結果は、まだ個々 の神経系の活動を記録するための現在の方法をもたらす動物は高価で手間のかかるです。この吸引ショウジョウバエ、 3 齢幼虫中枢神経系の電極作製は多様な神経の生理学的役割を決定する生理エージェントの生理効果をテストするため扱いやすいシステム神経機能の遺伝的変異の影響と同様、中枢神経系活動への経路。この前のヴィヴォ準備では、唯一の適度なスキルと電気生理学的専門知識を解剖昆虫の神経活動を再現可能な記録を生成する必要があります。さまざまなペプチドを含む化学物質の変調器は、中枢神経系活動に及ぼす影響を測定するための生理食塩水による溶液中の神経システムに直接適用できます。GAL4/UAS システムなど、さらに、遺伝の技術は、単独に又は特定のイオン チャネルやトランスポーター、節足動物の中枢神経系機能に受容体の役割を決定する薬理学的エージェントと並行に適用できます。このコンテキストの記載法、毒物殺虫剤、昆虫生理学者、キイロショウジョウバエ確立されたモデル有機体の発達生物学者に重要な関心です。このプロトコルの目的は科学の多様性をテストするために有用であるショウジョウバエ、モデル昆虫の中枢神経系の電気発生の測定を有効にする電気生理学的手法、します。仮説。

概要

このアプローチの全体的な目標は、キイロショウジョウバエモデル昆虫の中枢神経系 (CNS) のハクスリーをすばやく計測する研究者を有効にするのには。このメソッドは、信頼性の高い、迅速、かつコスト効率的生理学的及び毒性学的実験.を実行するには中枢神経系は、適切な神経機能は理解または神経機能を変更するために広範囲にわたって検討されている生活とそのため、重要な生理学的な細道のために不可欠です。節足動物の中枢神経系内の信号経路の特性評価は、オフのターゲットの結果を制限しながら死亡を誘発する無脊椎動物の神経機能を混乱させる殺虫剤の化学の授業をいくつかの検出を可能にしました。したがって、昆虫の神経活動を測定する能力は昆虫毒物学および生理学の分野に大きな関心神経システムは配置された殺虫剤¹の大多数のターゲット組織なので。昆虫の神経系に関する基礎・応用知識の成長可能性に限られているので現在の技術は労働集約的、高い費用を必要とする高度な神経生理学的手法が必要ですまだ、続けて昆虫神経細胞が限られているおよび/またはほとんどの節足動物の中央のシナプスへのアクセス制限があります。現在、ほとんどの昆虫神経蛋白の性状解析は昆虫内部整流器のカリウム チャネル^{2 について説明されたように、クローンとクローンの表現されたその後創と電気生理学的記録をで目標を必要とします。}、昆虫のリアノジン受容体³、蚊電圧敏感な K⁺チャンネル⁴、および他の人。異種発現の要件や低機能発現の可能性を軽減するには、・ ブルームクイストと同僚の神経表現型を誘発することを目的と培養ハスモンヨトウ frugiperda (Sf21) 細胞の手法として殺虫剤検出^5,6。これらのメソッドは新しい化学の開発のための有効なアプローチを提供まだ彼らはしばしば薬剤、殺虫剤抵抗性と評価の仕組み特定の特性のための乗り越えられないボトルネックを作成根本的な生理学的な原則。ここでは、可鍛遺伝学^7,8,9があるモデル虫から電気的活動の記録及び神経の正常発現パターンができる前のヴィヴォ手法について述べる錯体^10、11,12神経、新しく開発された薬の作用のモードや他の毒性学的研究のレベルでの抵抗機構の評価を有効にします。

ショウジョウバエ、キイロショウジョウバエ、昆虫の神経系または殺虫剤の作用機構を定義するための一般的なモデル有機体し、^{14 毒性13、薬理学的研究の最適モデル有機体として確立しています。 ,15}、¹⁶神経生理学的および病態生理学的^17,18,19,20脊椎動物のプロセス。D.melanogasterは、生殖の大人の段階に達する前に幼虫と蛹の段階を含む、完全な変貌を実行大人形昆虫です。発達過程を通して神経系が異なるライフ ステージで大幅な改造を受けるが、幼虫の中枢神経系は、この方法論の焦点になります。完全に開発された幼虫中枢神経系は解剖学的胸部および腹部のセグメントが融合し、繰り返されるとほぼ同じ neuromeric ユニット^21,22の配列を表す腹側神経節を形成すると簡単です。運動神経を降順蚕食大脳核の尾側に属します、体壁の筋肉と幼虫の内臓器官を支配するのに至ります。図 1では、幼虫のショウジョウバエ中枢神経系の解剖について説明します。

ショウジョウバエ血液脳関門 (BBB) は、胚発生の終わりに開発し、subperineurial グリア細胞 (SPG)²¹によって形成されます。SPG 細胞全体のショウジョウバエ中枢神経系²³をカバーする連続した、非常に平らな、内皮のようなシートを確立する広がる多数の糸状のようなプロセスを形成します。ショウジョウバエBBB が CNS²¹に栄養素や薬物動態のエントリを制御することにより神経の微小環境の恒常性を維持を含む脊椎動物の BBB との類似点です。BBB によって中枢神経系の保護を制限可能性を紹介その他薬物動態^24,25ほとんどペプチド合成麻薬の浸透はまだ、これは信頼性の高い神経伝達と機能のための前提条件小分子のポーテンシーを特性評価する際の問題。メソッドは、この障壁を混乱させると中央のシナプスへの薬理学的アクセスを提供する単純な断裂を使用します。
説明の方法論の最大の強みは、シンプルさ、再現性、および比較的高スループット容量このシステムに固有のものです。プロトコルは比較的簡単にマスター、セットアップは小さなスペースを必要とし、初期金融入力だけは必要な検査試薬や消耗を抑えるは。さらに、この方法はイエバエ、イエバエ²⁶.の中央の降順の神経活動を記録する完全に除去

プロトコル

1. 装置および材料

1. ショウジョウバエ中枢神経系の吸引電極録音を実行する電気生理学のリグの必要なコンポーネント (テーブルの材料に表示) を準備します。
   注: 実験前に必要はショウジョウバエ中枢神経系の解剖室を構築して録音中に生理食塩水で神経節を入浴に使用します。商工会議所建設の手順の概要を以下に示します。
2. 幼虫の部屋を準備します。
   1. ホット プレートを使用して黒のワックスを溶かします。
   2. 2 2.5 mL の最大ボリュームのある商工会議所に溶かされたワックスの 2 mL を注ぐ。
   3. ワックスを冷ます、約 2 h の強化します。
   4. 500 μ L、約 0.5 cm²の表面積と深さ約 0.25 cm のボリュームを保持する硬化のワックスで穴を彫るにかみそりの刃を使用します。

2. 機器およびソフトウェア構成

注: 細胞外記録の設定について簡単に説明します。

1. 郭清や録音用機器を準備します。
   1. ティッシュの準備、顕微鏡、吸引電極、マイクロマニピュレーター、ノイズを低減し、余分な電気フィールド (図 2) を排除するファラデーケージ内に光源を配置します。
   2. 接続 (できればはんだ) 地面と肯定的な配線にシールドそれぞれバス、電極ホルダーに接続されるワニ口クリップ。
      注: はんだ付けと露出のワイヤーは、ノイズを低減するアルミ箔でカバーできます。
   3. 地面と AC/DC の差動増幅回路.の 1 を入力する肯定的な配線を接続します。
   4. アンプのチャンネル 1 の出力にデータ集録システムの入力 1 から銃剣ニール Concelman (BNC) ケーブルを接続することによって、データ集録システムを AC/DC 差動増幅器に接続します。
      注: データ集録ソフトウェアとアンプの間の 50/60 Hz ノイズ除去装置を組み込むことをお勧めします。BNC T コネクタの使用が必要です。
   5. 必要な場合は、データ集録ソフトウェアの 1 を入力するオーディオ モニターの入力 1 を接続することにより、セットアップにオーディオ モニターを含んでいます。
   6. 生理食塩水で 10 mL のシリンジを埋めるし、電極ホルダーの圧力ポートに接続します。
      注: は、注射器、銀/塩化銀ペレットと電極開口部との間に気泡が存在しないことを確認します。
2. 郭清や録音用ソフトウェアを準備します。
   注: ソフトウェアのセットアップ方法の概要は、電気の未処理の出力をデジタル化し、周波数をスパイクにデータ変換材料表に掲げる集録/解析ソフトウェアに基づいています。その他のソフトウェアを使用することができ、複数の記録の変換を使用できます。
   1. 集録/解析ソフトウェアを開きます。
   2. メイン ツールバーから「セットアップ」をクリックし、ダイアログ ボックスが開き、「チャンネル設定」を選択します。
   3. 3 つのチャンネルの数を減らします。
   4. チャネル 1 の選択範囲が 100 の mV。
   5. チャネル 2 のドロップ ダウン メニューが表示されます「計算」タブをクリックしてします。「繰返し測定、」2 番目のダイアログ ボックスを開くを選択します。
   6. チャネル 1 をソースとして選択します。ドロップ ダウン メニューの測定で、イベントでユニットのスパイクを選択します。最後に、[検出設定] のドロップ ダウン メニューからシンプルなしきい値を選択します。
   7. ヘルツで表され率のプロットに、電気的活動を変換する 3^rdチャネルは、算術モードに設定する必要があります: 入力のウィンドウでは、"1000*smoothsec(ch2,2)"に入力します。ドロップ ・ ダウン ・ メニュー ヘルツ単位をオンします。
      メモ: 巧妙な録音は複数の別の記録セットアップを実行できますが、「イベントやシンプルなしきい値でユニットのスパイク」は最も簡単な各個人のバック グラウンド アクティビティしきい値の調整が可能記録します。「カスタム ソース入力」の設定で録音は、バック グラウンド アクティビティは録音の差ないと仮定するとデータの再現性を高めます。
   8. メイン画面に戻るには、ダイアログ ボックスを閉じます。時刻で Hz と x 軸の y 軸を表現する必要があります。

3. 解剖し、幼虫のショウジョウバエ中枢神経系

注: 幼虫中枢神経系解剖方法を Hafer と Schedl²⁷、明らかに示していますが、これらの以前に発行されたメソッドがスパイクの頻度を測定するために重要なは、降順のニューロンの長さを短きます。ここでは、保持長い間、そのまま下降ニューロン幼虫の中枢神経を切除の追加方法を説明します。

1. 生理食塩水の準備。
   1. 郭清と²⁸ミリメートルで、次に記録を生理食塩水の準備: 3 157 NaCl、KCl, 2 CaCl₂, 4 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 酸 (HEPES);7.25 に pH 滴定しなさい。
2. 幼虫のショウジョウバエ中枢神経系を解剖します。
   1. 識別し、生理食塩水 (図 3 a) 200 μ L に文化バイアルと場所から放浪 3 齢キイロショウジョウバエを抽出します。
   2. 微細鉗子のペアで口フックをつかんで鉗子 (図 3 b) の 2 番目のペアで蛆の腹部を把握します。
      注: 腹部蛆の薄いクチクラ層の引き裂くことでその結果としてあまりにも多くの圧力を与えないでください。
   3. 頭部領域からウジの尾側を分離し、ウジ (図 3) の内臓を公開して別の方向に口フックと腹部をゆっくり引き抜きます。
      注: 中枢神経系は、気管、消化管と連動されます。任意の組織から降順末梢神経の切断を防ぐために中枢神経系を切断しないでください。
   4. 鉗子 (図 3 D) 消化管、気管からの中枢神経系をいじめます。
   5. 必要に応じて、血液脳関門が Vannas 春ハサミで中枢神経系、大脳の後方を手動で transecting によって中断されます。
      注: このされるべきである使用されている化学物質の物理化学的特性に基づく。図 4 aの赤線は提案された断裂ポイントと図 4 bに示すようにそのままの降順の末梢神経の幹を切断の中枢神経系。切断の CNS は、3.2.5 のステップの完了の後の実験のため準備ができています。

4ショウジョウバエ中枢神経系の細胞外記録。

1. 記録のための中枢神経系を準備します。
   1. ガラスのピペット ホウケイ酸ガラス管 5-15 mΩ の抵抗に電極を引き出します。
   2. 食塩液 200 μ L を含むワックス チャンバー切断の中枢神経系に挿入します。ワニ口クリップをアース線に半田付けでコーティングされていない昆虫ピンをクランプし、回路を完成する生理食塩水にピンを挿入します。
   3. マニピュレーターを使用すると、切断の CNS の尾の端に電極を向けます。末梢神経幹を連絡する前に集録/解析ソフトウェアのしきい値レベルを調整することによってバック グラウンド ノイズの記録を排除します。
   4. 吸引電極に注射器でわずかな否定的な圧力を適用することによって任意の便利な末梢神経を描画します。
      注: 発火周波数基準電極引き込まれるより多くのニューロンがしばしば電極の抵抗の増加の結果のニューロンの数に相関しています。
2. 中枢神経系の神経活動を降順の細胞外記録を開始します。
   1. データ集録ソフトウェア録音を開始し、発火周波数基準を監視します。焼成率データのベースラインを収集する前に 5 分間平衡発火率を許可します。
   2. コントロール治療の発射のパターンが図 5 aに示すような破裂のパターンではない場合、準備と記録を破棄します。
      注: 発火のパターンの変化は、中枢パターン発生器は、神経機能を変更することができますの異常や不安定な活動を示唆しています。
   3. 5 分後に生理食塩水 + 発火率録音コントロールを開始する 400 μ L に商工会議所の総容積をもたらす車の 200 μ L を追加します。
   4. ベースラインには確立された (3-5 分) した後、生理食塩水を 200 μ l 添加を撤回し、生理食塩水で溶解実験的エージェントの 200 μ L を追加します。
      注: ジメチルスルホキシド (DMSO) は、脂溶性化合物の推奨溶剤 0.1% v/vを超えないようにする必要があります。
   5. (高濃度低) シリアル方法で薬物濃度を適用し、(薬²⁹の化学的性質に基づく調査官によって決まります) 時間の選択した期間の各濃度を記録します。この時点でポイント集録/解析ソフトウェアで新薬承認申請のラベルを付けるには、薬と最終濃度が含まれているコメントを含みます。
      注: は、剥離後 30-50 分後に約 10-20% 減少する中枢神経系の活動、それを適切な未処理のコントロールを実行する必要がありますとしたがって、薬物治療はこの期間を超えないようにしてください。。
3. データを分析します。
   注: 複数の解析は活動電位バースト²⁹、スパイク波形の振幅と時間のコースをおよび薬物治療^26,30以降後平均スパイク周波数の特定の変更など、収集されたデータに実行できます。^,31,32します。 最も一般的な薬物は、平均スパイク周波数は以下の時間の指定された期間にわたって影響の決定です。
   1. (すなわち、薬物治療期間) の関心の領域全体を選択することにより平均スパイク周波数を集計し、平均スパイク集録/解析のメイン ツールバーにある「データパッド」を通じて自動的周波数を決定します。ソフトウェア。
   2. 車両制御 (ベースライン) の平均スパイク周波数に薬物治療後中枢神経系の平均スパイクの頻度を決定します。数式によって薬物治療後発火率の変化率を計算する: (扱われる周波数/基準周波数) × 100。
   3. 各濃度の制御の平均スパイク周波数または % 発火を使用グラフ ソフトウェア標準濃度反応曲線を構築します。
   4. 統計分析を実行 (など、対になっていないt-テスト) 時点、濃度、薬物治療の意義を確認します。
      注意: 生成および濃度反応曲線を分析するための 2 つの主な方法があります。最初のメソッドは、個々 の準備あたり 1 つの濃度です。ここでは、単一濃度のスパイク率は基準スパイク レートごとの準備のために正規化されます。利点を減らすために準備の記録時間の短縮、落とし穴を増加している間解離時間のため、このメソッドから成っている 5-7 個々 中枢神経系製剤濃度あたりと大きな誤差が平均化されたデータに範囲設定します。2 番目のメソッドは、個々 の準備あたり複数の濃度です。ここでは、3-5 濃度各スパイク レートは同じ基準スパイク レートに正規化されます。メリット少ない解剖時、落とし穴が以降の化学療法の前の薬物濃度治療の速効性と未知の薬物影響の要件中薬物濃度の間より少ない可変性をレプリケートします。

結果

ショウジョウバエ中枢神経系から生じる降順末梢神経の自発活動は、一貫性のある再現性細胞外吸引電極を使用して記録できます。切除や切断ショウジョウバエ中枢神経の自発活動がはち切れんばかり、約 1 焼成の 1-2 秒の循環的なパターンを生成する s の近くの地震活動静穏化。たとえば、中枢神経系は 0.5 - 1 (1-2 Hz) の静止に近い s、続いて約 1 s、およびほぼ静止状態 (1-2 Hz) を返しますのバースト (100-400 Hz) 0.5 - 1 s (図 5 a)。この焼成パターンが繰り返されますすべての 2-3 s。ベースライン ノイズのすぐ上のしきい値の設定、3-5 分間で約 20-50 Hz からショウジョウバエ中枢神経系の平均スパイク放電周波数の範囲します。発火周波数基準電極に描かれた末梢神経と電極オリフィスと腹側神経節間に形成されたシールの数に相関しています。重要なは、最終濃度 0.1% で化学溶剤 DMSO のアプリケーションには、(<...

ディスカッション

詳細については関連のビデオで解説し、本文アクティビティとスパイクを記録するために重要なステップは放電前のヴィヴォショウジョウバエ中枢神経系の周波数を提供しています。短いまたは数降順ニューロン発火率レプリケートの大きな差異に起因するベースラインが減りますので、郭清の有効性はメソッドの最も重要な側面です。ただし、一度解剖技術を習得すると、この試験で収集されたデータは高い再現性でさまざまな分野の除去。記載されているメソッドを 1 つ変更 CNS 室にピペット生理食塩水および化学ソリューションの手動でする必要性を防ぐ自動咲き乱れるシステムの包含であります。咲き乱れるシステムの包含は録音で、時折手動ピペットと医薬品の適用中に発生する中枢神経系の障害を減らします。

この電気生理学的手法は、薬物/殺虫剤の探索研究への導入のための準備の有用性を悪用します。さらに、この準備は神経生理学の基本的な概念のデモンストレーション用教室を受けやすいです。メソッドが比較的控えめな財政投資を必要し、最小限の準備時間の関数に薬物の影響を説明するために用いることができる堅牢で安定し...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Drosophila melanogaster (strain OR)	Bloomington Drosophila Stock Center	2376
振動分離テーブル	キネティックシステム	9200シリーズ
ファラデーケージ	キネティックシステム	N/A
ブーム上の解剖顕微鏡	ニコン	SMZ800N	複数のスコープが使用可能で、ブームスタンドは重要です
AC/DC差動アンプ	ADInstruments	AM3000H	モデル3000オーディオモニタの代わりにモデル1700を使用することができます
	ADInstruments	AM3300
ハムバグノイズエリミネーター	A-M Systems	726300
データ収集システム(PowerLab)	ADInstruments	PL3504	複数のPowerLabモデルが使用できます。
Lab Chart Pro Software	ADInstruments	N/A - Online Download
光ファイバーライト	Edmund Optics	89-740	異なる光源を使用することができますが、光ファイバーは最も適応性の高い
マイクロマニピュレーター	です 世界の精密機器	M325
マイクロ電極ホルダー	世界の精密機器	MEH715	異なるモデルは許容されます
BNCケーブル	ワールド精密機器	複数のサイズ
ガラス毛細血管	ワールド精密機器	PG52151-4
マイクロ電極プーラー	サッター機器	P-1000	また、ナラシゲPC-100
ブラックワックス	カロライナバイオロジカルサプライ	974228
ノンコーティング昆虫ピン、サイズ#2	Bioquip	1208S2
フィンス鉗子	ファインサイエンスツール	11254-20
バンナススプリングはさみ	ファインサイエンスツール	15000-03