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方法論記事

多嚢胞性卵巣症候群を研究するハイパーアンドロゲン マウス モデル

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DOI：

10.3791/58379

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2018年10月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Health, Beijing Military General Hospital, 3Southern Medical University, 4Department of Molecular and Cellular Physiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Gynecology and Obstetrics, Johns Hopkins University School of Medicine

この記事について

サマリー

PCOS とこれらの PCOS のようなダムから子孫の病態を検討するジヒドロテストステロン ペレット リーン PCOS のようなマウス モデルの開発について述べる.

要約

Hyperandrogenemia は女性の生殖、代謝機能に重要な役割を果たしているし、多嚢胞性卵巣症候群の特徴であります。PCOS をもつ女性を模したリーン PCOS のようなマウス モデルの開発は臨床的に意味があります。このプロトコルでは、このようなモデルについて述べる.DHT (ジヒドロテストステロン) 結晶粉末ペレットの 4 mm 長さを挿入することによって (ペレットの長さの合計は 8 mm)、それを毎月交換して血中 DHT レベル 2 倍ない DHT (いいえ DHT) で移植したマウスより高いと PCOS のようなマウスのモデルを生成することがおります。体重と体組成を変更することがなく生殖、代謝不全を見ました。不妊症の高度を示す、これらの PCOS のような雌マウスの小さなサブセットは妊娠して得ることができる、彼らの子孫は、大人として思春期遅発症、増加したテストステロンを表示します。PCOS のような無駄のないマウス PCOS とこれらの PCOS のようなダムから子孫の病態を検討する有用なツールです。

概要

検索は、NIH の基準に従って多嚢胞性卵巣症候群 (PCOS) とアンドロゲン過剰な PCOS (AE PCOS) 社会の特徴です。PCOS をもつ女性は妊娠しにくいがあるし、1妊娠合併症のリスクを増加しています。妊娠する場合でも、彼らの女性の子孫は、健康への悪影響成果2,3を持っています。動物モデルは、様々 な戦略4,5,6,7,8,9,10,11を使用して開発されています。,12 PCOS (無排卵、または障害者の血糖、インスリン耐性) の体重増加と肥満肥大脂肪細胞サイズと重量は増加した脂肪細胞に関連付けられている機能の多くを展示します。PCOS を研究に使用される動物のモデルを生産する 2 つの主要な方法があります。13出生後治療高レベルのアンドロゲン直接 (外因性アンドロゲン注射/挿入) または直接 (アンドロゲンへの変換エストロゲン アロマターゼ阻害剤をブロック) などであります。別は、アンドロゲンの胎児 hyperexposure 妊娠14,15中に子孫を勉強します。たとえば、アカゲザル16,17、羊18、および子宮内胎児期アンドロゲン男性レベルにさらされる齧歯動物からの女性の子孫は、人生の後半 PCOS のような形質を開発します。これらのモデルは大幅上昇アンドロゲン効果と胎児のプログラミングや子宮環境への影響の理解を強化しました。ただし、これらのモデルは独自の制限があります: 1) 動物が肥満を開発し、生殖性肥満や代謝不全; から hyperandrogenemia の効果を分離するは困難です2) 妊娠前に PCOS をもつ女性は既にアンドロゲンの高レベルを示す、従って卵子は受精; 前に過剰なアンドロゲンにさらされています。3) 薬理学的用量テストステロン (T) または出生後または妊娠の間に使用されるジヒドロテストステロン (DHT) は、多嚢胞卵巣のアンドロゲン環境を表さない場合があります。卵巣の卵胞液や血清テストステロンと DHT のレベルが測定され、テストステロンと DHT のレベルが 1.5 〜 3.9 倍 PCOS5,19,20,21 の女性で高い ,22,23影響を受けない女性と比較されました。我々 は、成体マウス モデル23,24,25の 4 mm のペレットの挿入から慢性の DHT 露出の開始の 2 週間以内生殖、代謝不全を開発作成クリスタル DHT パウダー (ペレットの長さの合計は 8 mm)。このモデルは、DHT 処置なしコントロール マウスの場合に比べて倍高い (2xDHT と呼ばれる) については、血中 DHT を生成します。2xDHT マウスが基底血清エストラジ オール、テストステロン、LH の変化を示さない、肥満を開発しないように、表示する同様の卵巣重量, 血清コレステロール、遊離脂肪酸、レプチンは、tnf α, il-623,24、 25相対的に制御する DHT 挿入23,24,25後さらに最大 3.5 ヶ月。また、PCOS の機能を既に開発している雌を交配による子孫15の代謝と生殖に関する健康にハイパーアンドロゲン母体環境の影響を学ぶことができます。

この新しいパラダイム (NIH と AE PCOS 社会基準に関連する) は、比較的同じようなレベルのこれらの女性にアンドロゲンで PCOS 2 ~ 3 倍より高いテストステロンまたは影響を受けない女性に比べて DHT レベルを生成することによって病気をモデル化します。ただし、このモデルが DHT を撤回したら、継続的な外因性 DHT によっておよびプログラムされた内因性検索からではなくが管理されます。この記事の全体的な目標は、1 に焦点を当てるには) どのように DHT ペレット;2) マウス モデルのようなリーン PCOS を生成する方法3) これらのダムから女性の子孫を評価する戦略。他の測定と表現型の評価、本稿では取り上げませんが、5,15,23,24,25,26で見つけることができます。

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プロトコル

詳しいプロトコル DHT ペレット作製と挿入、および生殖および代謝テストを紹介します。本研究で使用されるマウス混血 (C57/B6、CD1、129Sv) が維持された食糧とのジョンズホプキンス大学でブロードウェイ研究棟動物施設で 24 ° C で 14/10 h/明暗サイクルで水を自由医学。すべてのプロシージャは、ジョンズ ・ ホプキンス大学動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

1. PCOS のようなマウス ・ モデルを作成します。

  1. DHT ペレット作製
    1. 滅菌するオートクレーブ シラスティック チューブです。シラスティック チューブをかみそりの刃で 15 mm の長さにカットします。
    2. 3 mL の注射器に接続されている 20 G の鈍い針とチューブにメディカル粘着シリコンを注入することによって 1 つの側面をシールします。プランジャーは、注射器とし、貯水池に挿入接着剤から撤退する必要があります。プランジャーを挿入し、針から出現し始めるとそれまで粘着プッシュ ダウン。鈍い針は強力なハサミで 20 G 針の鋭い先端側を切断によって行われます。シリコン チューブの長さはポスト プロダクション トリミング; のように 2 mm 以上にする必要があります。
    3. 一晩乾燥;シール側の気泡を確認します。空気泡無しとのそれらは DHT ペレットに使用されます。他の人は、いいえ DHT 制御ペレットに使用できます。
    4. 皮膚に DHT の露出を避けるためにフードの DHT ペレットを作る前に手袋、マスク、ゴーグル、白衣を着用します。
    5. プラスチックに注ぐ DHT 粉ボートと接着剤の開放側が DHT 粉にチューブ (A1.1 で生産) を頂いたプレスの重量を量る。
    6. DHT の粉末が整えられる、大型のクリップとを押さえ込んだことができます。 DHT 4 mm (または長さ) の高さに達するまで続行します。チェック定規、シールとシリコン、開いている側と DHT の長さは一晩乾かします。
    7. それぞれのシール側シリコン長さ 2 mm の長さにカットします。ペレットの長さの合計は 8 mm になります。
    8. コントロール (いいえ DHT) ペレットとして空シラスティック チューブの両サイドをシールします。
    9. ペレットを使用するまで室温で (露光しないように) 箔巻き 50 mL の円錐管にしてください。DHT ペレットは、ストレージの少なくとも 3 ヶ月の完全性を維持します。
  2. DHT の挿入と置換
    1. 20 DHT までペレットまたはコントロールのペレットが、30 mL 滅菌 0.9% 生理食塩水 37 °C 挿入直前平衡の 24 h で 50 mL の円錐管に別々 に沈んでいます。
    2. 術前 clidox で表面と手袋を消毒、作業面がきれいなプラスチック バックアップ吸水紙 (外科パッド) で覆われています。 動物と接触するすべての楽器は、オートクレーブによる動物施設に入る前に浄化します。 ナショナルインスツル メンツは、乾燥して使用する前に冷却する許可されます。
    3. 2 ヶ月齢の雌マウスを使用 (マウス/ケージ 4-5)。マウスはキシラジンを腹腔内に注入される (3.5 mg/kg bw) とケタミン (78.8 mg/kg bw) インスリン注射器を使用しています。混合と麻酔を投与量の計算は、テーブル 1にあります。
    4. 適切な麻酔が達成される, つま先反射の消失によって測定される呼吸を減速した後、マウスは手術の準備中でしょう。
    5. 滅菌ガーゼを使用して betadine で領域の皮膚を消毒して、70% エタノールできれい. 地域は、betadine に再び塗装されます。
    6. 5 mm 程度で長さはさみ首付近の皮膚の下穴を開けます。10 G trochar を使用して、吻側方向に小さなトンネル (15 mm) を作る。ペレットは、trochar と背側に挿入されます。
    7. 開口部を接着剤で封印します。手動でおおよそ傷の端鉗子と近似の創傷部に液状接着剤の薄膜を適用する穏やかなブラシ ストローク。蓄積 3 接着剤を確実に接着剤の薄層は、傷に均等に分散されます。接着剤タンブレロ傷の端のそれぞれの側に 1 cm を拡張してください。穴を閉じるには縫合や手術クリップが使えます。マウスを個別に収容、回復のための熱パッド、ケージに戻します。アンドロゲン暴露の一定レベルを維持する 4 週間ごとのペレットを交換します。オリジナルのペレットが削除され、新しいペレットは A1.15 同様の立場で説明するように挿入されます。
    8. DHT 挿入の 3 日後に発情周期をテストします。発情周期のステージは、膣細胞診により評価されます。 膣の細胞は、16 日間連続 p10 pipettor を使用して膣腔に滅菌生理食塩水 (約 10 μ L) を噴出して同じ滅菌ピペット チップと生理食塩水の撤回によって収集されます。 膣壁から脱皮腟の細胞生理食塩水を混ぜて、収集しました。
    9. ラベル付きのスライド上に細胞を生理食塩水を拡散します。各スライドは、六つのサンプルを含めることができます。スライドは、六つの場所のそれぞれでどのサンプルを配置するラベルです。
    10. 生理食塩水の後が完全に乾いてスライドで、スライドを入れセルを修正し、100% エタノールが付いている容器。スライドは、少なくとも 5 分間固定する必要がありますが、定着剤でさらに使用されるまで無期限に残ることができます。
    11. バッファー B に 1 分間染色ソリューションと水道水、常温乾燥の C. 洗浄スライドにスライドを置きます。
    12. 10 X の客観的光顕微鏡下で細胞の形態を調べます。 参照27,28,29proestrus (P)、発情 (E)、metestrus (M)、発情 (D) を区別するために細胞の形態を説明します。
    13. 各日の段階し、各段階での時間の割合を計算する日数の合計数で割った値の数。
    14. DHT 挿入後 21 日目のマウスを一晩 (16 h) を断食と 20% ブドウ糖の 2 g/kg 体重を腹腔内に注入することによって耐糖能をテストします。たとえば、マウスの体重は 25 g、そのこのマウスを 20% ブドウ糖の 250 μ L で 50 cc (0.5 mL) インスリン注射器で挿入されます。ブドウ糖のレベルは、0、15、30、60、90 で尾静脈からの血液をサンプリングすることによって glucometer およびテスト ストリップによって評価されて 120 分。これについてはで詳細に他の場所で30。
  3. 血のコレクション
    1. 顎下腺静脈出血ランセット (ステロイドの 100 μ L、LH ・ FSH の試金のための 30ul コレクション ボリューム制限) DHT 挿入後様々 な日に 9 と 10 の間の血液を収集します。これは11で説明されます。
    2. 4 ̊C, 10 分間で 6,000 x gで血液を遠心分離し、アッセイまで-80 °C で保存することができます別の 1.5 mL チューブに血清層を収集します。

2. 生殖を評価する慢性的な DHT から女性の子孫のプロファイルは、ダムを挿入

  1. 交尾
    1. テストする雌マウスは、ペレット挿入後 15 日間で実績のある肥沃な男性 (つまり雌マウスの子犬が既に) とケージに移動されます。
    2. マウスが妊娠しているかどうかにダムの体重毎週を文書化します。ダム一週間で 3 g 以上の体重増加量は、妊娠を示します。
    3. 我々 は前に、の週から 3 g より大きいダムの体重増加を観察した後 2 週目ダムの血を収集します。
  2. 膣口と発情した思春期
    1. 目視検査後、子犬は引き離される毎日で膣口を確認 21 日に出生後 (PND)、肛門性器間距離を測定し、膣口の年齢を記録します。
    2. 膣が開いたらは、発情周期をチェックする 1.2.8–1.2.11 で説明したように膣に細胞を毎日収集しています。
    3. 説明 1.2.12 として細胞の形態を観察し、最初の発情は日付として定義されているすべての細胞が角化上皮細胞であります。
  3. 本体重量と耳パンチ
    1. ランセット先端を浸しタトゥー ペーストと参照12/7 PND で説明として爪先のタトゥーとそれぞれの子犬をマークし、70 日齢まで 7 日ごとマウスの重量を量る。
    2. 耳パンチ マウスそれらの番号は、図 1 12 に 16 の PND との間でシステムを使用してください。セックスを区別、体の腹側を調べて、女性に見える乳首があります。
    3. 21、26、70 の血を集める PND 1.3.1 で上記の出産後
  4. ホルモン測定
    1. 血清中の DHT レベル両方の酵素免疫測定法 (ELISA) により測定し、液体クロマトグラフィー ・ タンデム質量分析計 (LCMS)23,24,31,32。T は、LC-MS、またはラット/マウス再生23,24の研究センターでヴァージニアの大学リガンド アッセイ コアによって検証されている elisa 法によって測定されます。

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結果

血中 DHT 濃度とブドウ糖負荷試験

DHT のレベル測定した血清の収集から両方の elisa 法による LCMS によるプロトコル 1.24-1.25、2.9 3.0 によると.DHT の絶対値が異なる質量分析法と elisa 法、ただし、DHT 対なし DHT 挿入されます。 両方の試金からと全体実験15,23,24 (の相対倍 (約 2 倍)図 2 a)。 DHT のレベルが DHT となし DHT マウスの妊娠による先入観から大幅に増加、しかし、DHT のレベルが倍 (交尾の前に 1 日) pregestational 両方でなし DHT マウスに比べて DHT マウスで高いと妊娠 (およそ 14 日間)時...

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ディスカッション

検索は、PCOS の重要な機能です。このプロトコルで使用される (2 つの DHT マウスなし DHT マウスでより高い倍) 血清 DHT レベル前の研究で他の研究者によって報告されるそれらより低いし、比例して PCOS5,19、女性を模倣するように校正されています 20,21。他のモデルとは異なりこの 2 倍の DHT モデルは体重と DHT 挿入23,24後 3.5 ヶ月間なし DHT マウスと比較して全体の身体組成を変更しません。これら移植 DHT の成体は、継続的な外因性 DHT によって維持されます。全身体組成は変わらないがリーン PCOS 女性20構造の変化と脂肪細胞の機能を観察されています。異なる拠点の精査...

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謝辞

この仕事は健康の国民の協会 (南西に R00 HD068130 で補助金) とボルチモア糖尿病研究センターによって支持された: パイロットと可能性 (南西) に付与します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
結晶性5&-DHT粉末シグマ-アルドリッチA8380-1G
ダウコーニングシラスティックチューブフィッシャーサイエンティフィック11-189-15D0.04インチ/ 1ミリメートル内径x0.085インチ/ 2.15ミリメートル外径
接着剤シリコーン第II因子、InC。A-100
グル、白衣、手袋、マスク。
10 µフィルターなしLピペットチップUSA Scientific11113700
顕微鏡スライド 塗抹標本用Fisher Scientific12-550-003
細胞染色用 Diff QuikフィッシャーサイエンティフィNC9979740
ランセットフィッシャーサイエンティフィックNC9416572
3 mL シリングベクトン、ディキンソン・アンド・カンパニー (BD)、30985
付属の針:20GBD305176
定規:ミリメートルスケールで10cmより任意の長さ。
キシラジン獣医1 AnnSeA LA、MWI、ボイシNDC13985-704-10100 mg / mL
ケタミン塩酸塩Hospira、IncNDC 0409-2051-05100 mg / mL
外科用ステープルAutoClip®システム、ファインサイエンスツール12020-00
インスリン注射器BD3294611/2 CC、低用量 U-100 インスリン注射器
トロカール革新的な研究アメリカの MP-182
顕微鏡カールツァイス プリモスター415500-0010-001ドイツ
耳穿孔器フィッシャーサイエンティフィック13-812-201
テストステロンラット/マウス ELISAキットIBLB79174
DHT ELISA キットアルファ診断インターナショナル1940
ワンタッチウルトラグルコメーターライフスキャン株式会社
ワンタッチウルトラテストストライプライフスキャン株式会社
エッペンドルフチューブフィッシャーサイエンティフィ05-402-18
カミソリブレードフィッシャーサイエンティフィック12-640
ドックスフィッシャーサイエンティフィックNC0089321
外科用アンダーパッドフィッシャーサイエンティフィック50587953メーカー:アンドウィンサイエンティフィック56616018
ベタジン消毒液ウォルグリーン
3M Vetbond (n-ブチルシアノアクリレート)3M Science.人生
医療用ゴーック ッククリへの応用

参考文献

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