培養 3 D 回転楕円体モデルでのマウス前立腺の葉の解剖組織学的特性及び

Summary

遺伝子改変マウスは、前立腺癌のメカニズムを調査するための有用なモデルです。識別とマウス泌尿生殖器から前立腺の丸い突出部を解剖、組織学に基づく区別と分離および下流解析の回転楕円体として体外主な前立腺細胞文化プロトコルをご紹介します。

Abstract

遺伝子組み換えマウス モデル (GEMMs) は、前立腺癌 (PCa) を含む、人間のがんのほとんどの種類を調査するため効果的な前臨床モデルとして機能します。マウス前立腺の解剖学を理解することは、効率的な利用と適切な特性そのような動物のモデルにとって重要です。マウス前立腺にはそれぞれ独自の特性を持つ葉の 4 つの別個のペア。この記事は、適切な郭清法および疾患解析にマウス前立腺の丸い突出部の同定を示します。後郭清術、前立腺細胞さらに培養できる体外機構の理解のためです。マウスから前立腺細胞は、彼らの通常の特性を失う傾向があるとき培養体外、我々 概要ここでセルを隔離し、生理学を維持するため有効である 3 D 回転楕円体文化としてそれらの成長法セルの特性。これらの 3 D の文化は細胞の形態と調査、近く生理の状態で動作が変更レベルとの主要なタンパク質と開発に関与する経路のローカライズと、病気の進行を分析し見て使用できます。薬物治療への応答。

Introduction

科学的なコミュニティを何十年も人間の癌の開発の複雑なメカニズムの解明を続けています。潜在的なキープレーヤーと創薬ターゲットの同定から始まる患者細胞・組織研究、前臨床動物モデルの使用多くの場合このような結果の並進アプリケーション必要があります。モデル (GEMMs) モデルの人間のがんにはマウス モデルの人間癌コンソーシアム (NCI MMHCC)、について説明し、マウスの癌の特性を統一しようとする委員会の設立以来着実に上昇している遺伝子改変マウスの使用科学者世界中^1,の²モデル。マウス モデルは、ほとんどの種類のがんは、開発の進行、治療への応答を理解するための前臨床研究で解明の必要性を満たすし、抵抗³を取得します。

前立腺がんは男性、毎年⁴160,000 以上の男性に影響を与える最も一般的に発生するがんです。病気の積極的な形態は、毎年の生活の数万人を主張します。しかし、病気の進行のメカニズムはまだよくわかっていません。進行性前立腺癌患者⁴で高死亡率からも明らかな転移・再発前立腺癌の効果的な治療オプションの深刻な不足でこの結果します。したがって、前立腺がんを研究する前臨床モデルの成長している必要性があります。しかし、おかげでマウスとひと前立腺の本質的な違い、GEMMs では前立腺癌のモデル化の利得していない人気バーハーバー分類導入 2004 年マウスの病理組織学的変化を説明するまで遺伝子操作、腫瘍性病変の同定と人間⁵癌の進行の段階の関係の時に前立腺。前立腺ジェム モデルを勉強しながら考慮する必要がありますマウス前立腺の重要な特性の 1 つの葉の 4 つの異なるペアの存在である: 前部、外側、腹側と背側。葉は、病理と遺伝子の発現パターン⁶に有意差を提示します。Probasin 蛋白質の表現パターンは、ポスト思春期の若いマウスで⁷Pb Cre4⁷と呼ばれる probasin ベースのプロモーターを使用のジェムの Cre ベース モデルは大抵設計されているのでを考慮する必要があります葉によって異なります。Cre 発現頻度の空間的および時間的な違いは、葉の間の腫瘍性病変の違いと同様、腫瘍の発生と進行のタイムラインの違いに します。したがって、GEMMs、前立腺の腫瘍の開発を勉強しながら、このような違いを考慮することが重要だし、個々 の葉は、再現可能な結果を達成するために個別に評価する必要があります。この記事の最初の部分では、マウス前立腺の解剖、識別、別の各葉と葉の組織の違いを認識する適切な方法について説明します。

腫瘍増殖と病理組織学的解析では、腫瘍の開発に貴重な洞察力を提供できますが、彼らは分子メカニズムについて多くの情報を与えない。腫瘍の開発そして進行のメカニズムを研究するには、では、腫瘍細胞の生体外の分析に便利です。長年にわたり培養、3 D 文化⁸を含むこれらの細胞培養に関連するいくつかの方法が提案されている. 最近では、通常の 2D 文化⁹これらのメソッドのほとんどは、良い細胞の生存・増殖率になります、一方、3 D の文化は生理的条件に最も近い環境を提供します。3 D または回転楕円体の文化が基底膜の細胞外マトリックス (ECM) で栽培、完全に分化した luminal セル通常ある非常に低い生存率;ただし、根元と中間細胞 (主幹細胞) が伝播し、¹⁰回転楕円体と呼ばれる細胞のクラスターを生成することができます。これにより、がん研究に適した上皮癌幹細胞 (一般、がん幹細胞として知られている)¹¹に由来すると考えられているので。このプロトコルの 2 番目の部分では、3 D 培養マウス前立腺の細胞を培養するための方法について説明します。Organoid 形態とイメージング、異なった蛋白質のための汚損蛍光抗体法による行動の研究と化学療法への応答の研究を含む下流の分析のいくつかの種類の結果球が使えるトリートメント。

全体的に、このプロトコルの目標はマウス前立腺の解剖および解剖技術と回転楕円体の文化との in vitro解析のための組織の処理を記述することによって前立腺癌のマウスモデルを使用して最適な方法を概説するには.

Protocol

ここで説明したすべてのマウスの実験は、SUNY アップステート医学大学で機関 IACUC 承認プロトコルで説明したガイドラインに従って行われました。

1、泌尿・生殖器 (UGS) 郭清

メモ: 回路図は、図 1に提示されます。

1. CO₂吸入安楽死法または別の承認手法を使用して 3 ヶ月歳の男性 c57bl/6 マウスを安楽死させます。
   注: マウス 3、12 ヶ月の年齢の間は、実験のため正常に使用できます。古いマウス (> 6 ヶ月) はほとんどクリアする必要がありますの UGS の周りより多くの脂肪をあります。葉の分離・同定マウス 3 ヶ月未満では困難です。他の系統は、実験では、同様に使用できます。
2. その裏にマウスを置き、動物の腹部の側面を露出するようにピンを使用して足を保護します。
3. マウスの腹部に 70% エタノールをスプレーし、拭きとってください。
   注: は、郭清は必須ではありません前に、腹部毛を剃る。
4. 中の鈍い鉗子のペアで筋層と共に、腹部から皮膚を持ち上げ、はさみを使用して腹部に逆 Y 字切開を行います。
   1. 直線切開をおきます (図 2 a) 胸骨に陰茎のすぐ上からはさみのペアを持つ。
   2. 太もも (図 2 b) までのそれぞれのつま先に向かって切開の根元からカットします。皮膚を両側、腹部領域全体 (図 2 ce) を表示する下部折り返し。
      注: カットのサイズは異なりますマウスの年齢やサイズによって異なります。初期のストレートの切開の大きさは、1.5 からマウスのサイズに応じて、4 cm まで及ぶかもしれない。
5. 他の臓器に移動、UGS を公開します。持ち上げ、移動茶色黄色腸 (図 2 f)。鉗子で腹部の脂肪パッド (不透明な白い海綿状組織) をピックアップし、側面 (図 2 g) に移動します。
   注: UGS は、精嚢、尿道、前立腺、精管 (精管) と膀胱の装備されています。ベースに接続されている膀胱の液体で満たされた嚢と不透明な白い半円形アーチ (精嚢腺である) の特性の組み合わせによって識別できます。精嚢の右下にある半透明の組織は前立腺です。
6. UGS を見つけて、しっかり膀胱を持つ鈍い鉗子とマウスの腹部から上向きに UGS の全体を持ち上げます。
   注: 膀胱がいっぱいの場合排水それ最初小さい注射器鉗子でよりよいグリップを提供し、膀胱を破裂のリスクを減らします。
7. 膀胱、スライド、背骨に膀胱と前立腺の下にはさみのペアを引き上げ、カットを作成し続けています。(図 2 hと2 i) 腹腔内に残りの接続をカットします。すべての前立腺組織を誤って切断を避けるために UGS を余りに近くを切らないように注意してください。
   注: UGS の下でカットしながら、ハサミを挿入するマウスの奥にカット スナップ脊柱だけでなく。このメソッドは、ほぼすべて、UGS とマウスから組織を抽出に必要な時間を短縮、1 つ切り取り領域で腹腔との間の接続の切断の結果します。
8. UGS を削除し、(十分な組織を被覆する) 2-6 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) またはダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM、高グルコース) 6 cm シャーレ (図 2 jと2 k) に、解剖顕微鏡 (10 X に移動倍率)。
   注: 必要に応じて残りの手順に解離性のメディアを変更します。

2. 前立腺の解剖

1. 微細鉗子と顕微解剖はさみ (図 3 a) のペアで背側と腹側の両方の側面からのすべての脂肪をオフにします。解剖のプロトコルの残りの部分のような手術器具を使用します。
   注: 脂肪はしばしば密接に絡んだ UGS (その白い海綿状の外観で識別することができます)。したがって、誤ってすべての前立腺組織を離れて切り取ることを避けるために慎重に、この手順を実行する必要があります。すべての脂肪をクリアするまで 10-15 分かかります。
2. 保持し、鉗子で膀胱を引き出します (図 3 b) ハサミ基地でそれを切り取る。
3. 残りの組織の腹側を上に置きます。鉗子で 1 つの精管を押したまま、ハサミでは、ベースにそれをトレースし (図 3 c)、それを切り取るし、反対側に繰り返します。今を残して前立腺 (半透明・ verminous)、精嚢、精管を削除 (不透明、白、半円形) と尿道 (ピンク、赤および不透明な管) (図 3 d ・ 3 e)。
4. 精嚢と前立腺組織前葉の内側のアーチの間に鉗子を挿入します。詮索離れて精嚢と前立腺と必要な (図 3 f) として任意の結合組織を切り取る。基地尿道に精嚢をトレースし、(図 3 gと3 h) それらを削除します。それらを穿刺しないように注意します。
5. 個々 の前立腺の丸い突出部を分析に進みます。

3. 前立腺と個々 の葉レーザーマイクロダイ セクション (図 4、3 i n の数字) の肉眼解剖学

1. 背側、背側の葉は、蝶の羽のようになりますを示す直面しているので、鈍い鉗子のペアを持つ組織を反転します。
2. 鉗子で耳たぶを押し (図 3j) ハサミ基部に snipping 背側葉を収集します。
3. 腹側に残りのティッシュを裏返します。
4. 小さい側の葉を収集し、通常前方、腹側、背側葉 (図 3 k) で挟まれた、側で、尿道をラップします。
5. 次に、外側の葉よりも大きいの尿道にうそを腹側腹葉を収集 (図 3 l)。
6. 最後に、前葉、切断し、尿道 (図 3 m) を破棄して、4 つの最大の収穫します。
7. 実験的ニーズに応じて組織部分を処理します。、組織学のためのセクション 4、または回転楕円体文化のセクション 5 に進んでください。

4. 葉同定とヘマトキシリンとエオシン染色スライドからの形態

1. 前立腺の組織を修正し、パラフィンに埋め込みます。ヘマトキシリンとエオシン (H & E) や、オリベイラらによって規定される特性を利用した、組織学に基づく前立腺の葉の違いを特定するとスライドを染色を続行します。¹² (図 5)。

5. 3次元培養¹⁰組織の処理

注: これは図 6の通りです。

1. 培養実験のニーズに従って全体前立腺または個々 の葉を続行します。前立腺の組織を含む DMEM の 2-3 mL 10 cm 皿に転送します。メスと細かくと解剖顕微鏡下で可能な限り均等に前立腺の尿細管をミンチします。
2. 無菌条件下でのティッシュ文化フードの下で残りの手順を続行します。
3. 15 mL チューブに、DMEM と共に組織部分を転送し、DMEM に 9 つの mL にボリュームを増やします。DMEM 組織の混合物と混合する渦に 10 x コラゲナーゼ原液 1 mL を追加します。
   注: は、コラゲナーゼ原液はロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 中 10 mg/mL と 15 mL チューブに最終濃度が 1 mg/mL。
4. 細胞外のマトリックスを低下させるコラゲナーゼの 37 ° C で 2 h の回転子をチューブまたはジャイレトリ ・ シェーカーでチューブを配置します。
5. 室温で 5 分間 400 x g でチューブを遠心します。
6. 上澄みを廃棄し、細胞間や細胞-マトリックス接着斑を切断する暖かい 0.05% トリプシン-EDTA の 2 mL で再懸濁します。チューブを 5 分の 37 ° C に転送します。
   注: 組織塊が大きすぎるため、よく混ぜる場合、より広い穴をするかみそりの刃でピペット チップをカットします。
7. 8 〜 10 倍、P1000 ピペットでピペッティングし、P200 ピペットを繰り返し、組織塊を破る。
8. 完全な DMEM の 3 mL のトリプシンを中和します。DNAase の 500 U を追加私とよくミックス。
9. 18 G 針で 5 〜 10 回を 5 mL のシリンジを通過します。20 G 針を 5 回を通過します。
10. ソリューションにはまだ大きな組織塊が含まれている場合は、もう一度手順 4-8 を繰り返します。
11. フィルター 40 μ m のフィルターを通して細胞懸濁液は、50 mL のチューブに配置されます。DMEM の 5 mL と 15 mL の管を洗い、同じフィルターを通過します。すすぎを繰り返します。
12. フィルターを破棄し、室温で 5 分間 400 x g で通過を含むチューブを遠心します。

6. めっきと、細胞を培養

1. 完全な前立腺上皮細胞成長培地 (PrEGM) の 0.5 mL にペレットを再懸濁します。細胞カウンターまたは検定を使用して細胞密度をカウントし、5 x 10⁵セル/ml に完全な PrEGM 細胞を希釈します。
   注: 3 月齢マウス全体前立腺からの収穫の 3 x 10 の⁵-10⁶セル範囲です。したがって、低収量とも、目的のセル密度を達成できますように (前述) に PrEGM の以上 0.5 mL にペレット再懸濁します最初に重要です。
2. ミックス 2:3 容積比 (60% 基底膜 ECM と 40% 細胞懸濁液) とウェル プレートや実験のニーズに従ってチェンバー スライド プレートで基底膜 ECM とセルの必要量。
   注: 免疫染色、ガラス底板やチャンバー スライド プレートの井戸や、井戸の中の全体をカバーします。結果オルガノイドを数える場合井戸の縁に板やプレートも中に数滴の高いボリュームをめっきする場合。厚すぎる、または薄すぎる広がっていないことに留意します。めっき技術分野; の 1 cm²あたりマトリックス セルの混合物の少なくとも 100 μ L をプレートします。などで 2 cm²とチェンバー スライド-よく表面積, 5 x 10 の⁴セルを含むマトリックス セルの混合物を 200 μ l 添加をメッキする必要があります。
3. プレート/スライドを基底膜を固めるための ECM を 30 分間 5% CO₂と 37 ° C のインキュベーターに転送します。まあ、基底膜 ECM プラグを邪魔しないように世話をカバーするために予め温めておいた完全な PrEGM を追加します。
4. メディアの半分を削除し、2 〜 3 日ごと新鮮なメディアを追加します。回転楕円体を成長すると、5-10 日間。
5. 収穫 (ステップ 7)、免疫染色 (手順 8)、および/または下流用イメージングを続行します。

7. 収穫球

1. 球を収穫、基底膜 ECM ゲル プラグイン乱すことがなくメディアを慎重に吸引し、基底膜 ECM の 100 μ L あたり PrEGM で 1 mg/mL 当期の溶液の 1 mL を追加します。
   注: 場合彼らは井戸や (代わりにカバー全体も)、縁の真ん中にメッキ、回転楕円体を収穫する簡単だ井戸に当期ソリューションの適切な量を追加できることを確認します。
2. Dispase PrEGM ソリューションに基底膜 ECM ゲルから持ち上げて細胞スクレーパーとプレートの底をこすり。
3. 1000 μ L ピペット チップまたはより小さい部分にゲル プラグを破る 5 mL ピペット ピペットが広く一度上下全体のソリューションを退屈させます。
   注: は、大口径のヒントにかみそりの刃で 1000 μ L ピペット チップの先端をカットします。
4. 基底膜 ECM が完全に溶けるまでに 1-2 時間 5% CO₂と 37 ° C のインキュベーターで孵化させなさい。
   注: これはゲルのチャンクがありませんが残ることを確認するためプレートをひねりながらウェル底面の目視検査で確保することができます。
5. 15 mL コニカル チューブに細胞懸濁液を収集します。
6. 室温で 5 分間 250 x g で球を遠心し、ダウン ストリーム アプリケーションを続行します。

8. 球¹³の免疫染色

注: 回転楕円体は、時間の必要な量の成長している後、基底膜 ECM を溶解することができます、Colicinoらで説明するように球を汚すことができます。¹³。

1. 簡単に言えば、PBS で文化を洗浄し、基底膜 ECM ゲル プラグに直接 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を追加します。基底膜 ECM が完全に解散した、新鮮な PFA 30 分毎の交換までゆっくり揺れ、室温で 30-90 分間インキュベートします。
   注: PFA がゲル プラグを溶解し、この過程で、回転楕円体を修正します。
2. 次に、PBS 3 回洗浄し、PFA から任意の蛍光をクエンチする 10 分の 50 mM 塩化アンモニウムを追加します。PBS の 3 洗浄を繰り返します。
3. 0.1% 非イオン性洗剤 5 分・ PBSAT とブロックを permeabilize (PBS、1% BSA 0.5% トリトン X-100) 30 分間。
4. 一晩で 4 ° C、PBSAT と PBSAT で部屋の温度で 2 時間の二次抗体 3 洗浄が続く PBSAT の一次抗体とインキュベートします。
5. 必要な場合は、製造元のプロトコルに従って PBSAT で洗浄と DAPI 染色を繰り返します。3 つ以上 PBS で洗浄します。
6. 200 mM 1, 4-diazabicyclo [2.2.2] オクタン (鎖置換 DABCO) antifade 試薬と PBS を追加し、画像に進みます。

Results

マウス前立腺の丸い突出部は識別でき、精嚢、尿道に関して彼らの場所を使用して解剖しました。マウス前立腺 4 対葉背側に位置するのと腹精嚢、尿道で構成されます。図 4 aおよび4 b (上) そのまま前立腺、精嚢、尿道の背側と腹側のビューを表示します。最下部のパネル (図 4 cおよび4 d) は、身分証明書に記載されている異なる葉を表示します。葉は、3 ヶ月ほど若いマウスから分離できます。

別の前立腺の丸い突出部は組織学 (図 5) で大幅に異なります。すべてマウス前立腺葉に囲まれて分泌上皮細胞内腔から成る複数の腺プロファイルで構成されます。しかし、葉の形、細胞、組織、分泌物の性質変わる葉から葉へ。H &...

Discussion

本稿は、マウス前立腺の解剖および個々 の葉の識別方法を紹介します。また説明マウスの in vitro解析のための 3次元培養における前立腺細胞を培養するためのプロトコルです。

解剖のプロトコルの重要なステップは、(1) マウスから全体の UGS を収穫と解剖顕微鏡の下で個々 の器官の分離です。前立腺の組織は非常に小さく、UGS; の残りの部分に囲まれてしたがって、そのまま葉のすべての 4 つのペアを調達しながら体内から直接臓器を収穫する実質的に不可能です。したがって、マウスから全体の UGS を収穫し、前立腺の抽出を続行することが重要です。また (2) このプロトコルに重要です適切なタイミングでの手順に従いますが、細心のまま。時間は解剖時に組織の劣化を最小限に抑えるための本質です。ここに記載したマウスから、UGS を抽出、特定の技術の選択肢に比べて高速と強くお勧め。全体の解離と葉の隔離プロシージャ通常分 35-40、もっと練習 25 分を下げることができます。解剖の最も困難な部分は、総解剖の時間の大部分を占める UGS を囲む脂肪を掃除です。脂肪は、前立腺はそれの...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
マウス手術器具(マウス解剖キット)	ワールド精密機器	MOUSEKIT
解剖顕微鏡
RPMI培地	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11875093
解剖培地(DMEM + 10%FBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11965-084
シ胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック
PBS(リン酸緩衝生理食塩水)	サーモフィッシャーサイエンティ	10010031
コラゲナーゼ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17018029	RPMIで10倍ストック(10mg / ml)を作り、ろ過滅菌し、分注し、-20°Cで保存します。C
トリプシン-EDTA (0.05%)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	サイエン
DNase I	Sigma-Aldrich	10104159001 ロシュ
シリンジ&ニードル	フィッシャー・サイエンティフィ
・フィッシャーブラン 滅菌セルストレーナー、40μm	フィッシャーサイエンティフィック	22-363-547
PrEGM BulletKit	ロンザ	CC-3166	コンポーネントを追加し、アリコートし、-20°Cで保存します。
マトリゲル膜マトリックス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	CB-40234
ディスパーゼ II パウダー	サーモフィッシャー サイエンティフィ	17105041	PrEGM に 10 倍のストック (10mg/ml) を入れ、フィルター滅菌、分注、-20 °C で保存します。ハ