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方法論記事

陰イオン交換器 (ジエチルアミノエチル セルロース列) による血中からのアフリカを含む細胞外の Trypanosomes の精製

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DOI：

10.3791/58415

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2019年4月6日

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1Univ. Bordeaux UMR INTERTRYP 177 IRD CIRAD, 2IRD UMR 177 INTERTRYP CIRAD, 3CNRS, UMR 5234, Microbiologie Fondamentale et Pathogénicité, Univ. Bordeaux, 4Centre Hospitalier Université Bordeaux

この記事について

サマリー

トリパノソーマ血から分離のこの方法は、哺乳類の血液細胞よりも小さい負となりその表面電荷に依存します。感染した血は配置し、陰イオン交換カラムに扱われます。このメソッド、アフリカ睡眠病の最もフィッティング診断は、免疫学的、生物学的、生化学的、薬学・分子生物調査のため精製の寄生虫を提供します。

要約

このメソッドでは、trypanosomes、寄生虫感染した血液から動物と人間アフリカ トリパノソーマ症 (帽子)、責任の分離をことができます。これは第一段階の帽子の診断のための最善の方法とさらにこの寄生虫の浄化方法により、血清学的調査研究します。

帽子はツェツェ バエ送信トリパノソーマ原虫 gambienseによって引き起こされるとt. b. rhodesiense.関連 trypanosomes ナガナ病の病原であります。トリパノソーマの検出は、帽子の診断、治療、フォロー アップに不可欠です。ここで説明する手法はt. b. gambiense帽子の診断のための圃場条件に合わせ、最も敏感な寄生虫検出手法を 1 時間以内に完了することができます。血液は ph 8、以前調整陰イオン交換カラム (DEAE セルロース) に階層化され溶出バッファーが追加されます。少ない負荷電の trypanosomes を通過するのに対し、高負荷電の血液細胞が列に吸着しました。収集した trypanosomes は、遠心分離によってペレットし、顕微鏡で観察。また、寄生虫は感染性を維持しながら、細胞損傷せずに用意しています。

精製 trypanosomes、免疫学的検査に必要です彼らは、trypanolysis のアッセイ帽子血清のゴールド スタンダードで使用されます。ステンド グラスの寄生虫は、フィールド血清カード凝集反応 (CATT) で利用されています。Exoantigens、バリアント表面糖などの精製された trypanosomes からの抗原は様々 なイムノアッセイでも使用されます。ここで説明した手順は、アフリカトリパノソーマ;その結果、クロマトグラフィー条件は、それぞれの種のホストの哺乳類の血をトリパノソーマ菌株、およびもっと一般を合わせられなければなりません。

これらの病原体を魅力的な簡単に精製されで使用する生化学的な分子と細胞膜受容体、シグナル伝達、遺伝子のレベルでホスト寄生虫の関係を調査するための宿主細胞との共培養を含む生物学研究式です。薬物テスト体外;遺伝子の削除、突然変異、または代謝プロセス、細胞骨格の生合成および寄生虫生存に過剰発現の調査。

概要

手法説明ここで trypanosomes、寄生虫血から動物と人間アフリカ トリパノソーマ症 (帽子)、責任の分離を可能します。最初の段階の帽子の診断のための最善の方法で、さらにこの寄生虫の浄化方法により、堅牢な血清学の調査。

帽子はツェツェ バエ送信トリパノソーマ属 gambienseとt. b. rhodesiense1.によって引き起こされるこれらの原虫疾患 (hemolymphatic 展開ステージ) の最初の段階の間に、血流、リンパ、間質液細胞外を乗算します。第二期 (meningoencephalitic 期) 寄生虫クロス血液脳関門; ときに開始します。この病気はその名「睡眠病」を与えている、睡眠障害などの神経学的徴候はこの第 2 段階2の典型的であります。関連 trypanosomes (t. エバンシーいる、t. の vivax、t. b. グリコシルホスファチジルイノシトール) は、動物アフリカトリパノソーマ (AAT)3の病原です。

世界保健機関 (WHO) は、2020 年までに公衆衛生問題として帽子を排除して 20304伝送を停止するを目指します。迅速診断テストの最近の導入は、改善された血清学的診断1,4,5を持っています。いくつかの分子診断テストが開発されているが、フィールド診断におけるそれらの役割の確立5されていません。グリコシルホスファチジルイノシトールグループ、動物トリパノソ6担当の寄生虫によって引き起こされる非定型の治療法のサブ種を識別するために使用されます。

血清反応偽陽性と残念なことに偽陰性の結果1を与えることができる寄生虫の検出は診断・治療・ フォロー アップは欠かせません。これらの hemoflagellate の原生生物の直接顕微鏡観察によって引き起こされるt. b. gambiense、(95% 以上) 低 parasitemias ルールは、一方、 t. b. rhodesiense、大規模なによる帽子の帽子の場合はむずかしい寄生虫の数は頻繁に血の存在です。厚いドロップやキャピラリー チューブ遠心分離 (CTC) といった様々 な濃度の技術も使用されているが、寄生虫の陰イオン交換体 (DEAE セルロース) の列によって血液からの分離遠心分離して顕微鏡観察、ペレット、最も敏感な方法です (約 50 寄生虫/ミリリットルの血液を検出できる)1,7。その結果、この陰イオン交換器 (DEAE セルロース) 法による trypanosomes の浄化は最高とまでは、可視化および帽子の診断のための血液の寄生虫を分離するための参照方法。、フィールド条件で DEAE セルロースのミニ列が使用されています、いくつかの改善は、顕微鏡観察7、8を促進しました。

下記の血液からトリパノソーマ分離法は、寄生虫の表面電荷は、哺乳類の血液細胞9より小さい負に依存します。興味深いことに、このメソッドは、50 年前、博士シーラ ランハムによって 1968 年に開発された、検出と血流 trypanosomes の準備のためのゴールド スタンダードのまま。高速、両方の動物と人間のトリパノソーマ症10の診断を許可する哺乳類の広い範囲から salivarian trypanosomes の再現です。

生活、精製された寄生虫を得るためには、感染した血液が陰イオン交換カラムに追加されます。クロマトグラフィー条件 (主に pH、イオン強度のバッファー/メディア) は、哺乳類の血液細胞と trypanosomes10の各組み合わせに各トリパノソーマ種およびもっと一般を合わせられなければならないと。溶出バッファーは、ほとんどのアフリカの trypanosomes10の pH 8 に正確に調整されます。Parasitemias は単独で顕微鏡観察によって検出するのには低すぎるので、このメソッドが寄生、患者の血液中の濃度を優先し、検査することもできます。新鮮単離 trypanosomes とこのテクニックを使用して、感染した動物から血の上の作業は無期限研究室で無菌状態で培養されている寄生虫の研究よりも様々 な調査のより適切です。

宿主-寄生生物関係は最高、寄生虫、したがって、その自然なホストに感染するt. 筋、細胞外 trypanosomes の代表である、多くの利点は、マウスの感染に伴う自然マウス寄生虫に師事、実験小動物バイオハザード安全レベル (BSL) 条件を必要としません。T. 筋は人間の病原体を含む他の多くのトリパノソーマ種とは異なり、免疫マウスを殺さない。T. 筋がないマウスの T 細胞を奪われた排除され、食品や栄養素の摂取量の11を変更することにより感染したマウスの parasitemias を増やすことができます。この寄生虫は、12の他の病原体による共同感染の免疫応答を調節します。T. 筋培養t. 筋から感染したマウス展違いからたとえば、膜 Fc 受容体の発現t. 筋無菌共生栽培、感染マウス13から精製した寄生虫に比較で失われます,14. Excreted 分泌因子 (ESF) も定性的・定量的無菌トリパノソーマ文化小さい単位、流行地域15で分離された株の間で異なります。ESF は、宿主の免疫系に表示しのでの再生ホストの初期に重要な役割免疫応答16最初の抗原です。

実験室調査のための実験感染動物でこのプロトコルは寄生虫、特に免疫抑制動物を使用するときに必要なマウスの数を最小限に抑えることのより多くの実験を促進します。マス ・ スクリーニングのトリパノソーマ症 (CATT) のためにカード凝集テストで使用されるバリアント表面糖 (Vsg) はまだラットでは反映され trypanosomes から浄化されます。フィールドで使用可能な 2 つ迅速診断テスト (個別にラップされたカセット) はまだネイティブ Vsg およびない trypanosomesの in vitro培養1,ので4,の感染モデル ソースを使用して5. これら DEAE セルロースを精製した寄生虫は、特に齧歯動物、自然または実験的感染ホストから大量に簡単に取得できるので、トリパノソーマ免疫学と生物学の研究の進歩が促進されています。

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プロトコル

調査は、ケアと実験動物の使用 (NIH 出版番号 85±23、1996 の改正) のガイドラインに適合。プロトコルはローカル倫理委員会によって承認されました。

1. 動物

  1. 8 から 10 週古い、20-25 g は、住宅設備各実験の前に 15 日間動物を高齢者女性のスイス (の 1) マウスを保持します。保護、温度 (22 ° C) と湿度 (50%) に保持する換気ボックスに収容します。ルーム、12 時間ライト サイクルのオン/オフを制御します。
  2. 食べ物と水に動物無料のアクセスを与えます。痛み、苦しみや悩みを最小化し、豊かな環境を提供します。
  3. 住宅、クリア壁ケージ、豊かな木の棒とダン ボールのトンネルを使用します。やさしく、手のひらの上にケージから転送するトンネルに動物を描きましょう。
  4. 日常の虚脱、社会的孤立、身体傷害、波立たせられた髪の毛や手入れの不足の徴候を評価するために監視を実行します。
  5. 週 1 回各動物の重量を量る。獣医による定期的な検査を実行します。
  6. 自然な寄生虫は、動物の死を引き起こす寄生虫の寄生率のピーク時に採血、推定死の前日に採血します。
    注: 感染性病原体とすべての実験を大学承認ガイドラインによると専用の部屋で行います。

2. バッファー、メディアの準備

  1. 各物質を量り、次のバッファー用蒸留水を追加します。
    1. 濃リン酸緩衝生理食塩水を準備 (2 x)。
      Na2HPO4 (無水) (MW 141.96 g) 10.14 g
      NaH2PO4∙2H2O (MW 156.01 g) 0.62 g
      塩化ナトリウム (MW 58.44 g) 2.55 g
      H2O に 1 L の蒸留
    2. リン酸緩衝生理食塩水-グルコースを準備します。
      Na2HPO4 (無水) (MW 141.96 g) 5.39 g
      NaH2PO4∙2H2O (MW 156.01 g) 0.31 g
      塩化ナトリウム (MW 58.44 g) 1.70 g
      グルコース (MW 180 g) 10 g
      H2O に 1 L の蒸留
    3. 1 M KH2PO4を準備します。
    4. リン酸緩衝生理食塩水-グルコースを補う溶出バッファーを準備します。
      ペニシリン (100 U/mL)、ストレプトマイシン (100 μ g/mL) とフェノール赤 (5 μ g/mL)。

3. DEAE セルロースの調製

  1. DEAE セルロース準備のため 5 時間程度を予定します。
  2. DEAE セルロースの細い首にフラスコに蒸留水 100 g を洗って、解決し、微粒子を破棄することができます。上清が明確になるまで、洗浄を繰り返します。
  3. Phosphate-Buffered 生理食塩水と攪拌 x 集中 2 の 3 L を追加します。
  4. 1 M KH2PO4 8.0 pH を調整し、上澄みを廃棄します。
  5. 蒸留水で 2 回洗うし、解決に任せます。
  6. 洗って、2 回で 3 リットル Phosphate-Buffered 生理食塩水-グルコースを解決し、培養上清を破棄することができます。
  7. セルロースの量を測定し、Phosphate-Buffered 生理食塩水-ブドウ糖の等量を追加、ペットボトルに配布、-20 ° C で保存

4. 寄生虫

  1. 人間と動物のトリパノソーマ症流行エリアのトリパノソーマ系統を収集します。液体窒素で凍結の寄生虫を維持します。
    注:トリパノソーマ筋ヒトへの病原性は、さまざまな実験によって病原性 trypanosomes を安全に置換するために使用細胞外トリパノソーマ。
  2. 実験室の調査は人間の病原体を必要とするの場合処理実験専用の適切なバイオハザード安全レベル (BSL) 条件および注意事項;T. b. gambiense t. b. rhodesienseの BSL3 BSL2。標準的な微生物学的方法の確立、フィールド条件で: サンプリング レート、機械的ピペッティング、表面、頻繁に除染と廃棄物の滅菌をセキュリティで保護します。

5. マウス感染

  1. 37 ° C の水浴中で寄生虫を急速に解凍します。
  2. 顕微鏡で解凍感染した血の滴を観察します。運動フォーム17の割合を測定することによって寄生虫の実行可能性を評価します。
  3. 寄生虫をマウス (マウスあたり 0.5 mL) 腹腔内注入します。毎日、感染後は穿刺によって尾血 20 μ L を収集し、顕微鏡で観察。いくつかの顕微鏡の分野で寄生虫を数えることによってまたは、haemocytometer を使用して、ハーバート、ラムズデン18によると寄生率を評価します。
  4. 寄生率各ひずみに対して定義されているしきい値に達したとき、ヘパリン (10 U/mL) を含む溶出バッファー (5 mL/マウス) に血 (1 mL/マウス) を収集します。
    注: オリジナル小説仕事ランハム ゴッドフリー報告リン酸塩の最適なイオン強度バッファー pH 8.0 の原液からホスト/寄生虫数種の食塩ブドウ糖。

6. 寄生虫分離

注: この時点からすべての実験は、手袋を身に着けているティッシュ文化フードの行う必要があります。部屋の温度と使用される実験室で湿度がそれぞれ 22 ° C と 45% だった。寄生虫の分離、フィールド条件で 34 ° C で正常に実行されています。

  1. 垂直方向のサポートで 10 mL の注射器を置き、以前カット円形ろ紙、グラスウールやセルロース スポンジの部分を追加します。
  2. 8 mL のレベルに達すると 25 mL の溶出バッファーで洗浄し、DEAE セルロースを注射器に注ぐ。
  3. 列の上部に希釈血液 2 mL を慎重に追加し、溶出媒体を追加します。定期的に、trypanosomes の通過によると溶出バッファーを追加します。
  4. 遠心管中列から排水滴を収集し、定期的に寄生虫の存在を顕微鏡で確認します。
  5. 列排水には、寄生虫が検出されなく、遠心チューブ (1,800 × g、10 分、研究所の 4 ° C で、圃場条件における常温下) を分離します。
  6. 上澄みを除去し、次の調査のステップに必要な関連する媒体の 1 つの mL で寄生虫を中断します。
  7. 診断と寄生虫をカウントし、必要に応じて適切な培地でそれらを希釈します。

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結果

浄化された trypanosomes は、医薬品のテストで使用されています。寄生虫は、特定の薬物、単独または混合19のシリアル希薄を含む文化井戸に転送されます。顕微鏡観察、運動を評価性マーカーである、のみいくつかの薬剤をテストするときに実行できる、AlamarBlue セル実行可能性の試金に対し創薬スクリーニング20中大運動アッセイの優秀な方法であります。ペンタミジン、帽子療法で使用される参照薬剤の効果は、図 1に表示されます。

マクロファージは、フィーダー細胞としての文化で非常に便利です。In vitro で開始およびトリパノソーマの開発は文化21許可します。我々 は、彼らを支持する寄生虫成長22...

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ディスカッション

浄化された trypanosomes は、免疫学、生化学、細胞および分子生物学を研究するための強力な手段を表しています。データと結果の大きい広がりは他の真核細胞の30から情報を取得するために貢献してきましたし、trypanosomes から得られています。彼らは存続し、2 つの非常に異なる環境で育つことを可能にする多数のメカニズムを考案しているので trypanosomes がまた重要で興味深い研究テーマ: ツェツェ バエ ベクトルと哺乳類のホスト23, 31. trypanosomes を分離するためのさまざまな手法が報告されているとマイクロ ベースのアプローチについてのレビューは公開された32を最近します。したがって、原虫分離の再現性と堅牢な手段は不可欠です。

DEAE セルロース準備この寄生虫の準備のプロトコルで必要不可欠なステップであります。洗浄の条件は、細かい粒...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

私たち UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD ユニヴェルシテ ・ ド ・ ボルドーのすべてのメンバーに感謝します。この研究は、ボルドー大学から内部の資金によって支えられた、サポート LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024、ANR と協会から注ぐル開発銀行 de la recherche en parasitologie et médecine トロピカルとサービス deためら助成カンボジア ・ デ ・たいしかん・ ド ・ フランス アラカルト バンギ (Centrafrique)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10mLピペット ファルコン357,551
2 mL ピペット Falcon352,507
遠心分離管 50 mLFalcon352,070
遠心分離機Sigma Aldrich4K15
DEAE セルロースSanta Cruzs/c- 211213100 G
濾紙 Whatman1,001,125
平底フラスコ ナローネックデュラン21 711 766000 mL
グルコース VWR101174Y500 G
ヘパリンシグマ アルドリッチH3149-50KU5 000 U
KH2PO4VWR120 26936.260500 G
顕微鏡オリンパスCH-20
顕微鏡カバースリップモフィッシャー 科学CB00100RA020MNT0
顕微鏡スライドサーモフィッシャー科学AGAA000001
Na2HPO4 VWR100 28026;260500 G
NaClVWR27800.2911 KG
NaH2PO4 VWR110 33616;262500 G
Nalgene プラスチック メディア ボトル サイズ 125 mLサーモフィッシャー scientific342024-0125
Nalgene プラスチック メディア ボトル サイズ 500 mLサーモフィッシャー scientific342024-0500
パスツールピペットVWRBRND125400
ペニシリン 10,000 UI/ストレプトマイシン 10,000 & マイクロ;gEUROBIOCABPES01 OU100 mL
フェノールレッドSigma AldrichP0290100 mL
シリンゲ DutscherSS+10S21381
組織培養フードThermoelectro CorporationMSC-12
Trypanosoma brucei bruceiInstitute of Tropical Medicine (ベルギー、アントワープ)。ANTAT 1.1
Trypanosoma brucei gambienseInstitute of Tropical Medicine(ベルギー、アントワープ)。ITMAP 1893
Trypanosoma musculiLondon School of Hygiene and Tropical Medicine (UK)Partinico II
サー

参考文献

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