ナフィオン被覆の製造、削減グラフェン酸化物/ポリアニリン Chemiresistive 微生物発酵中にリアルタイムでモニター ph センサー

サマリー

ナフィオン被覆、ポリアニリン修飾、電気化学還元したグラフェン酸化物 chemiresistive のマイクロ pH センサーの作製のためのプロトコルを報告する.この chemiresistor ベース、固体のマイクロ pH センサーの pH 変化を検出できるラクトコッカス乳酸菌発酵プロセス中にリアルタイム。

要約

ポリアニリン修飾、電気化学還元したグラフェン酸化物 (ERGO PA) に基づく固体のマイクロ pH センサーの技術を報告する.電気化学還元したグラフェン酸化物は導電性層として機能し、ポリアニリンは pH に敏感な層として機能します。ポリアニリンの pH 依存性伝導率には、プロトンの間に穴のドーピング、脱プロトン化の中に穴の挿入が発生します。エルゴ PA 固体電極は発酵プロセスのようなものを機能的ではなかったことがわかった。細菌が発酵過程で生成する電気化学的活性種は、電極反応を妨げます。我々 は正常にプロトン伝導性層としてエルゴ ペンシルバニア州上にナフィオンを適用Nafion 被覆電極 (ERGO-PA-NA) 1.71 Ω/pH (ペーハー 4-9) chemiresistive センサー計測のための良好な感度を表示します。我々 はテストでエルゴ PA NA 電極ラクトコッカス乳酸菌の発酵におけるリアルタイム。L. 乳酸菌の成長における培地の pH pH 7.2 からに変わった pH 4.8 とさ 294.5 Ω から 288.6 Ω (2.4 pH 単位あたり 5.9 Ω) に変更されたエルゴ PA NA 固体電極の抵抗従来のガラス製 pH 電極の応答と比較してエルゴ PA NA 電極の pH 応答は、参照レス固体マイクロ アレイは微生物発酵で正常に動作を示しています。

概要

pH は、多くの化学と生物学的プロセスに重要な役割を果たしています。PH 値の些細な変化プロセスを変更し、プロセスの結果に悪影響を与えます。したがって、監視および実験のすべての段階で pH 値を制御する必要があります。PH のガラス電極は、ガラス電極 pH を測定するいくつかの制限のポーズが、多くの化学および生物的プロセスで pH を監視する正常に使用されています。PH のガラス電極が比較的大きい、壊れやすい、小さなサンプルに電解質漏出があります。さらに、電極とエレクトロニクスは、96 ウェル スクリーニングに適した比較的高価な発酵システム。さらに、電気化学センサーは侵襲的であり、サンプルを消費します。したがって、非侵襲的、参照レスのセンサーを使用するほうが有利です。

今日では、これら・ マイクロシス テムズ提供そのマクロを他の多くの利点に加えて、強化されたプロセス コントロール システムの類縁体として多くの化学工学とバイオ テクノロジーの小型反応系が好まれているが。監視および小型システムのパラメーターを制御するやりがいのある仕事、例えば測定するセンサー、pH および O₂のサイズとして、同様に最小化される必要があります。生物学的システムのためのマイクロリアクターの成功した生産プロセスを監視するための分析ツールのさまざまな種類が必要です。したがって、スマート マイクロ センサーの開発は、マイクロリアクターの生物学的プロセスの遂行に重要な役割を果たしています。

最近では、単層カーボンナノ チューブのような材料をセンシングし、ポリマー¹chemiresistive を用いたスマート pH センサーを開発するいくつかの試みがあった。これらの chemiresistive センサーは参照電極を必要としない、簡単に電子回路を統合します。成功した chemiresistive センサーは、費用対効果と製造、テストの小さいボリュームを必要とする簡単なスマート センサーを生成することが可能、非侵襲的です。

ポリアニリン修飾、電気化学還元したグラフェン酸化物の電極を開発する手法を報告する.Chemiresistive 電極は、 L. 乳酸菌発酵中に pH センサーとして動作します。L. 乳酸菌は食品発酵と食品防腐剤のプロセスで使用されている乳酸酸生産菌です。発酵、乳酸の生産は、pH を低下させ、細菌は低 pH^2,3,4で成長が止まります。

発酵中は、ペプチド、塩、およびセンサー表面^5,6,7,8,9を妨害する傾向があるレドックスの分子が含まれている複雑な化学環境です。本研究は、このような複雑な発酵培地の pH を測定する chemiresistive 適切な表面保護層材料に基づく pH センサーがされる可能性がありますを示しています。この研究では、正常にナフィオンとして用いてポリアニリン被覆、電気化学還元したグラフェン酸化物の保護層の pH を測定するl. 乳酸菌発酵中にリアルタイム。

プロトコル

1. 酸化黒鉛の準備

注: グラファイトの酸化物は、ハンマーの方法^10,11によると用意しています。

1. ₄攪拌グラファイトまでソリューションが完全に分散した濃縮 H₂の 69 mL へのグラファイトの 3 g を追加します。亜硝酸ナトリウム 1.5 g を追加し、攪拌しながら 1 時間放置します。その後、氷浴に容器を置きます。
2. 分散液に過マンガン酸カリウムの 9 g を追加し、氷浴からコンテナーを削除します。部屋の温度にウォーム アップするソリューションを許可します。
3. まず、滴下 138 mL の蒸留水を追加します。その後、420 mL の蒸留水を追加していきます。ホット プレートを使用して 15 分の 90 ° C の温度を維持します。分散に 30% 過酸化水素 7.5 mL を追加します。
4. 20 分間 10,000 × g で遠心分離によって製品を収集し、上澄み液を捨てください。4 ペレットを洗って暖かい二重蒸留水と 2 倍の 10% 塩酸 (v/v) で x。最後に、それを洗ってエタノールと 2 倍、50 ° c のオーブンで乾燥します。

2. 電極移動準備

1. 10 mL の水に酸化グラファイトの 10 mg を分散させるし、6 h 用の超音波洗浄槽の超音波。
2. 遠心分離後固体粒子 2,700 x g. 破棄で 30 分間遠心分離によって unexfoliated グラファイト酸化物フレークを削除し、さらに実験の上清を使用します。
   注意: 原液としてこの剥離行くフレークの分散液を使用しました。
3. 移動 2 倍原液を希釈します。原液から新鮮な移動作業ソリューションを常に準備します。
4. 露出の櫛型の金電極 (図 1 a 図 2) の上に移動作業溶液 2 μ L を追加します。ドロップ キャスト後、12 時間室温で電極を乾かしてください。これは、移動電極です。

3. 電気化学還元した酸化グラフェンへの削減

1. ポリジメチルシロキサン (PDMS) 電極ホルダー (下の部分) に電極を挿入します。1 C図 1 aのように示すように、電極の上に、ソリューションの貯水池として機能する電極ホルダーの他の部分を配置します。一緒に 2 つのペーパー クリップを使用して 2 つの部分をクリップして、ホルダーを組み立てます。PDMS ホルダーが移動電極部分をカバーしていないことを確認します。
2. ピペット 300 μ L 0.2 M リン酸緩衝液 (7) 貯留層内の。図 1に示すように、電極が行くフィルムの表面近くに配置されるそのような方法でソリューションの参照と対向電極を配置します。このセットアップは、ポリアニリン蒸着、移動の電気化学的還元を実行する電気化学セルとして機能します。
3. データ集録のためのコンピューターに接続されているポテンショスタットと電極を接続します。電気化学的還元用サイクリックボルタンメトリー: 潜在的な範囲とスキャン率として 50 mV/s-1.2 V に 0 を選択します。電極に電圧を切り替える-1.2 V 10 0 × (図 3)。
4. 実験の後電極ホルダーから取り外して二重蒸留水で洗って繰り返し。12 h 101 ° C のオーブンで電極を乾かします。
5. 電極が乾燥しているとき電極をオーブンから取り出し、部屋の温度に冷却するようにし、なさい。その後、マルチメータと電極の導電率を測定します。電極を今電気化学還元したグラフェン酸化物 (エルゴ) 電極と呼ぶ。

4. ポリアニリン機能化、エルゴ電極

1. ポリアニリン機能化を 10 mM アニリン単量体を準備します。だから 10 mM 1 M H₂の 5 mL のアニリンの 5 μ L を溶解₄。
2. ポリアニリン機能化ソリューション貯水池にアニリン単量体の 300 μ L を追加します。移動削減の手順の説明に従って、電極ホルダーに ERGO 蒸着電極を配置します。
3. アニリン電解重合のエルゴ エルガ ポリアニリン (ERGO PA) に匹敵するサイクリックボルタンメトリーを使用: 潜在的な範囲とスキャン率として 50 mV/s 0 から 0.9 V を選択。電極に電圧を切り替える 50 0 から 0.9 V × (図 4)。
4. ポリアニリン堆積後電極を取り外して繰り返し二重蒸留水で洗います。12 h のオーブンで 80 ° C で電極を乾かします。
5. 電極をオーブンから取り出し、マルチメータと電極の導電率を測定する前に室温に冷却するようにし、なさい。
6. Britton ロビンソン緩衝液 pH 5 (手順 5.1 参照) までに 0.2 M NaOH を追加することで 5 の pH 緩衝液を準備します。24 時間 ph 5 電極をバッファーに保持します。
   1. ・ ブリットン ロビンソン普遍的な緩衝液の準備、0.8 L の超純水水にホウ酸の 0.04 mol、0.04 mol の酢酸、リン酸の 0.04 mol をミックスします。目的 pH⁴に到達するまで緩衝液に 0.2 M 水酸化ナトリウムを滴下し追加します。最終巻は 1 l. まで純水を追加します。

5. ERGO PA 電極テスト時の pH (事前の校正前にナフィオン コーティング)

1. 5 の pH 緩衝液で電極を整えた後異なる pH のソリューションにおける電極抵抗を測定 (pH pH 9; 4 から図 5を参照)。
   1. この測定用緩衝液に直接電極を浸し、電極の他の部分をデータ集録のためコンピューター制御ポテンシオスタットに接続します。0.2 M NaOH で滴定で pH を変更します。
   2. テクニックのリストから溶出クロノポテンショメトリーまたはアンペロメトリーの i t 曲線を選択し、電極への 100 mV の電位差を適用します。
      注: ポテンシオスタット時間に対する電流を測定します。ポテンシオスタットを制御するソフトウェアは、現在の時間に対してのグラフィカルな表現を提供します。
   3. オームの法則 (耐電圧を電流で割った値に等しい) を使用して、現在および応用電圧から抵抗値を計算します。
2. 測定後 12 時間室温で電極を乾かしてください。

6. ナフィオン被覆エルゴ-PA 電極の作製

1. 5 wt % ナフィオン ERGO PA 電極上に 5 μ L を追加し、12 時間室温で電極を乾燥します。
2. ナフィオン塗布後 24 時間 pH 測定前に pH 5 に緩衝溶液に電極を保つため。
3. PH 5 のエアコン後、エルゴ-PA の Nafion 被覆電極 (ERGO-PA-NA) を削除し、pH 9 セクション 5.1 (図 6) で述べたように、pH 4 から電極の抵抗を測定します。

7. l. 乳酸菌培養液の準備

1. 250 mL の純水に粉末 M17 の 9.3 g を加えます。パウダーが完全に溶けるまでゆっくりとソリューションを揺り動かしなさい。オートクレーブ 121 ° C、15 分で解決。
2. 磁気攪拌バーと 250 mL 滅菌フラスコを取るし、フラスコに滅菌の M17 媒体の 50 mL を追加します。オートクレーブ 1m グルコース溶液 8 mL を加えます。以前同じ培養液で育つ乳酸菌 l.文化 10 μ L でソリューションを接種します。
   注: 細菌のひずみは 1 月コック、分子遺伝学、グローニンゲン大学から得られました。
3. 攪拌しながら 30 ° C でインキュベーション オーブンでマグネチックスターラー平板に 18 h の接種培とフラスコを置き、pH を監視します。

8. テスト ERGO PA NA pH L. 乳酸菌発酵実験の応答の

1. L. 乳酸菌培養に ERGO PA NA 電極を配置して、綿のプラグを閉じます。その後、 l. 乳酸菌を育てる 30 ° c サーモスタットにセットアップを配置します。
2. 適用 100 mV の電極と時間と電流を測定します。
3. オフライン 600 の光学濃度を測定する (例えば、図 7を参照) 異なる時点で 0.5 mL のサンプルを取る nm、従来のガラス電極 pH。文化の光の密度が一定、細菌がもう成長していないことを示すようになるまで測定を続けます。

結果

強い還元ピーク約-1.0 V の外観 (図 3) に移動の削減が示されているエルゴ^12,13,14,22に。ピークの強度は、行く層電極の数によって異なります。厚黒膜は電極の金ワイヤを完全にカバー。その時点で、2 つの絶縁された金電極が導電性移動 2 つの金電極ワイヤを接続しているので。アニリン電解重合堆積 ERGO^{15,16,17,18,19}

ディスカッション

移動の層は完全に不可欠だ行くの堆積後金電極ワイヤをカバーします。場合は金電極が移動で覆われていない、ポリアニリンないのみ入金されますエルゴも目に見える金電極ワイヤ上直接。ポリアニリン電極ワイヤ上の蒸着電極の性能に影響があります。エルゴへの還元、電極、ERGO 層と金電極ワイヤ間の結合を強化する 100 ° C で乾燥させます。各電極の抵抗は、金電極上に堆積移動層の数によって異なります。したがって、各電極の移動の同じ濃度を持っていることが重要だし、抵抗値が測定回路と互換性があらかじめ指定した範囲で電極を製造することは困難です。これは電極の簡単な大量生産を制限します。

減らされたグラフェン酸化物/電気化学法によるポリアニリンの準備は、他の報告準備方法上のいくつかの利点をしています。今回紹介した電気化学的方法は、強力な還元性および酸化剤を必要としない (e.g。、ヒドラジンとアンモニウムの過硫酸塩)^23,26。さらに、材料は電極への直接蒸着し、以上の処理...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
グラファイトフレーク	Sigma Aldrich
硫酸 (H2SO4)	メルク
亜硝酸ナトリウム (NaNO2)	Sigma Aldrich
過マンガン酸カリウム (KMnO4)	Sigma Aldrich
30 % H2O2	Sigma Aldrich
HCL	メルク
アニリン	シグマ アルドリッチ
5重量% ナフィオン	シグマ アルドリッチ
M17 粉末	BD ディフコ
リン酸 (H3PO4)	シグマ アルドリッチ
ホウ酸 (HBO3)	メルク
酢酸	メルク
水酸化ナトリウム	シグマ アルドリッチ
リン酸二水素カリウム	Sigma Aldrich
Dipostassium リン酸水素	Sigma Aldrich
Au インターディジテーテッド電極	BVT技術 - CC1 W1
Potentiostat	CH Instruments Inc (CH-600, CH-700)