方法論記事

逆にジカと尿、血清、蚊のサンプルでハウスキーピング遺伝子の転写-ループ - Lamp 法 (RT ランプ) アッセイ

DOI：

10.3791/58436

⸱

2018年9月14日

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1Department of Urology, Beaumont Health System, 2Foundational Sciences, College of Medicine, Central Michigan University, 3Oakland University William Beaumont School of Medicine

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、効率的かつ低コスト ジカのウイルスを検出または逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) で人間の尿や血清のサンプルや蚊のターゲットを制御するメソッドを提供します。このメソッドは、RNA の隔離を必要としないし、30 分以内に行うことができます。

要約

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ジカ ウイルス (ZIKV) の感染は成人の無症候性することができます、ただし、妊娠中の感染は流産と重度の神経学的な先天性欠損症に 。このプロトコルの目的は、人間と蚊のサンプルで ZIKV を迅速に検出することです。ZIKV 検出のための現在のゴールド スタンダードは定量的逆転写 PCR (qRT PCR);逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) 高価な機器を必要とせずより効率的かつ低コストにテストのため可能性があります。本研究では RT ランプは最初のサンプルから RNA を隔離することがなく 30 分以内のさまざまな生体試料中の ZIKV 検出に使用されます。この手法は、患者の尿、血清、感染し、感染蚊のサンプル ZIKV を使用して示されています。18 s リボソーム リボ核酸とアクチンは、それぞれ人間と蚊のサンプル内のコントロールとして使用されます。

概要

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2015 年にジカ (ZIKV) 注目を集めて著名なグローバル懸念の伝染病として妊娠中の感染は、流産、死産、重篤な神経学的な出生時欠損など小頭症、その他先天性にリンクされていたので先天性欠損症1。まれに、ZIKV は、ギランバレー症候群に関連付けられています。ZIKV は主にネッタイシマカ蚊; によって送信されます。しかし、それ1性的接触を通して広げることができます。迅速かつコスト効果の高い検出法の改良の必要性があったことを考えると ZIKV 感染は、ほとんどの人に無症候性または他アルボ1の感染症の症状と重なっている軽度のインフルエンザのような症状を呈する、ローカル蚊の個体数と同様、両方の人々 を画面に ZIKV。

定量的逆転写 PCR (qRT PCR) は ZIKV 検出; のための信頼性の高いアッセイです。ただし、この手法には、高価な特殊な装置、訓練された人員および興味のサンプルからの RNA の隔離が必要です。逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) は鎖と耐熱性 DNA ポリメラーゼの使用により 1 つの孵化の温度を必要なだけ PCR 技術に基づくワンステップ核酸増幅法変位プロパティ。これをたちの必要性を回避して試験を完了に必要な時間の長さを減少させます。RT ランプの付加的な利点は、高い特異性と感度、多くの PCR 阻害剤2への抵抗と温度、pH のレベルの範囲で堅牢性を含めます。比較的低コスト、試薬は室温で安定しています。これらの特徴を考えると、実験室やフィールドで RT ランプが展開できます。そのため、病原体や感染3,4、5の他の種類の範囲を検出するランプ反応が開発されています。本稿で記述されている RT ランプ プロトコルの目的は、ひと血清および尿中サンプルでも RT ランプ経由 30 分以内単一感染した蚊のように RNA の隔離なし ZIKV を検出するためです。実験室外側迅速かつ設定で動作する高感度、迅速な診断ツールである qRT PCR を交換するこのメソッドを使用できます。

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プロトコル

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ここで説明したすべてのメソッドは、ボーモント厚生制度レビュー委員会 (IRB) によって承認されています。関連するガイドラインと規制に従ってすべての実験を行った。

注意: 個人用保護具の使用を含むバイオ セーフティ レベル 2 標準によるとすべての可能性のある感染性物質を処理必要があります。バイオ セーフティ キャビネットにおけるエアロゾルを作り出すかもしれないプロシージャを行わなければなりません。さらに、ライブの蚊との仕事は、適切な節足動物封じ込めレベル 1-3 施設で行わなければなりません。ZIKV 先天性異常症の協会を与えられた、またはこれらの女性のパートナーの妊娠している女性、妊娠しようとしている必要がありますを大幅に削減 ZIKV への実験室の露出。ZIKV サンプルの輸送はカテゴリ B の生物学的物質に従って部門の輸送有害材料規則としてアメリカ合衆国に分類する (49 CFR Part 171-180) に従う必要がありますしたがってサンプルを出荷し、ガイドライン。ZIKV 米国 biospecimens へのインポートでは、疾病管理・予防 (CDC) 輸入許可センターが必要です。彼らが感染していない場合でも、アメリカ合衆国農務省 (USDA) が必要です ZIKV 伝送のためのベクトルとして役立つことができる節足動物のインポートを許可します。この情報は出版時点現在です。最新の推奨事項は、https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html で見つけることが。

注: 実験計画で講じる必要がありますので、RT ランプ反応、偽陽性反応の率が高いしやすい。指定されたピペットおよびフィルターのヒントは、すべてのセットアップと RT ランプ反応の実行を使用してください。理想的には、横の作業の流れを確立する必要があります。可能であれば、汚染を防ぐために囲まれた部屋で、解析と画像処理 (セクション 5) が発生します。RT ランプ製品を含むテスト管の開口部は、最小限に抑える必要があります。

1. RT ランプ プライマーの準備

  1. 分子グレード水最終濃度 100 μ M (表 1) に各凍結乾燥 RT ランプ プライマーを再構築します。簡単に渦同種のソリューションを確保し、すべてのプライマー ソリューションを収集するテーブル トップ遠心分離機で最大速度でソリューションを簡単にスピンするプライマー ソリューション。
  2. 準備、10 x のボリュームを使用して表 2FIP、BIP、F3、B3、LF、LB のプライマーの RT ランプ プライマー ミックス。簡単に渦同種のソリューションを確保して簡単に任意の損失を避けるためにテーブル トップ遠心分離機で最大速度でソリューションをスピンダウンするプライマー ソリューション。
    注: Ae。 ネッタイシマカアクチン (AEDAE) の RT ランプ プライマーが LB プライマーを含まれていない (ループ プライマーは常に RT ランプ反応に必要な)。この場合、LB プライマー ボリュームを分子グレード水に置き換えます。
  3. -20 ° c に使用するプライマーを格納し、無料の融解を避けてください。

2. サンプル準備

  1. 尿サンプルの:防腐剤で新鮮な尿、凍結尿尿のいずれかを使用します。新鮮なまたは冷凍サンプル: すぐに 700 x gで 10 分間のコレクションの後、サンプルをスピン上清を使用しての分析や将来の使用に備えて-80 ° C で凍結します。使用する前に氷の上凍結試料を解凍します。
  2. ひと血清サンプルの:いずれかの新鮮なまたは冷凍の血清サンプルを使用します。
  3. ZIKV の感染細胞株: エアコン メディアまたはセル lysates のいずれかを使用します。
    注: セル無料 Ae からメディアを完備しました。ヒトスジシマカ C6/36 セル 8 日感染後は、ZIKV RT ランプ反応のポジティブ コントロールとして使用できます。
  4. Ae。 ネッタイシマカ蚊:いずれかの全体の新鮮なまたは冷凍の蚊の死体を使用。氷の上の凍結の蚊を解凍します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 100 μ L で個々 の蚊を配置することによって粗蚊 lysate を準備し、P10 ピペット先端部 (図 1) で 10 回蚊の粉砕による均質化。簡単に任意の残骸をペレットに lysate の原油を遠心分離機します。下流の RT ランプ解析の上澄みを使用します。
    注: ポジティブ コントロールによって生成できる実験室の設定で約 103ゲノム相当量 200 でウイルスによる胸腔内マイクロインジェクションのメスの蚊を感染 nL と蚊に 5 日間を収穫感染後。

3. RT ランプ マスター ミックスを調製します。

  1. 氷の上の RT ランプ マスター ミックス反応を表 3にボリューム ガイドを使用して、使用する各プライマーに備えます。
    注: 使用不耐熱ウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG) の誤検知を防止に役立ちます。
  2. 、すべてのサンプルが混ぜように簡潔に渦、スピン ・ ダウン簡単にボリュームの損失を防ぐために。

4. RT ランプ アッセイ

  1. ピペット 23.0 μ L あたり 200 μ L の PCR チューブに反応 RT ランプ マスターの組合せの。サンプル (尿、血清、または手順 2 に記載されている粗蚊ライセート清) の 2.0 μ L を追加します。これは RT ランプ反応あたり 25.0 μ L に総量をもたらすでしょう。否定的な制御分子グレードの水を使用します。肯定的な制御が含まれます。
    注: 感染した細胞株の培養上清から PCR 標準またはウイルス株は、肯定的な制御として使用できます。
    1. オプション: デング ウイルス (DENV) など関連アルボ ウイルスの特異性制御反応が含まれます。サンプルの種類に応じて手順 2 で説明したように、サンプルを準備します。200 μ L の PCR チューブに RT ランプ マスター ミックスの 23.0 μ L に特異性制御の 2.0 μ L を追加します。
  2. ヒート ブロック、水浴、またはたちを使用して 30 分の 61 ° C で試料を加熱します。
  3. 熱は 80 ° C 10 分の加熱によりポリメラーゼを非アクティブ化します。

5. RT ランプ解析

注: 独立した密閉空間で RT ランプ解析を実行します。

  1. 、孵化後 RT ランプ反応の色の変化の有無を見ることによって視覚的にアクセスします。
    1. 蛍光核酸色素 1:10 (40 mM 20 mM 酢酸トリス 1 mM EDTA) TAE バッファーで希釈します。
      注意: 任意の核酸染色核酸に結合し、したがっては発癌物質。処理するときは、手袋を着用します。
    2. 12 μ RT ランプ反応、蛍光核酸色素希釈法の 2 μ L を追加します。
      注: 否定的な反応の色でオレンジ色になります、陽性反応は黄/緑の色になります。
    3. 省略可能: は、カメラを使用して、白地に RT ランプ反応の写真を撮る。
  2. 302 nm UV の下でサンプル配置光蛍光による RT ランプ製品の存在を確認します。カメラを使用して結果の写真を撮る。
    メモ: RT ランプを肯定的な反応には蛍光出力があります。
    注意: は、紫外線を作業時に UV 保護目のグーグルや顔のシールドを着用します。
  3. 省略可能: サンプルの電気泳動の実行によって RT ランプ製品の存在を確認します。
    1. 可視化のための核酸染色で 1 x TAE バッファーの 2% の agarose のゲルを注ぐ。
      注意: 任意の核酸染色核酸に結合し、したがっては発癌物質。処理するときは、手袋を着用します。
    2. 分子量を比較する最初の車線に DNA の梯子の 5 μ L を追加します。
    3. 各 RT ランプ反応の DNA のローディングの染料の 2 μ L で 13 μ RT ランプ反応混合物を混ぜます。ローディングの染料の DNA を含んでいる 15 μ L の混合物をロードします。
    4. 302 nm の紫外光を用いたゲル 90 V 90 分またはバンドを分離するまでのイメージを実行します。
      メモ: 肯定的な RT ランプ反応では、ラダリング パターンがあります。RT ランプの否定的な反応は、任意のバンドを含めないでください。

6. ゴ ミ処理

  1. 二重密封された袋に RT ランプ反応の処分します。これは、将来的に偽陽性反応につながる RT ランプ製品をイアントが、オートクレーブ滅菌を行います。

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結果

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RT ランプ反応は、3 つの異なる方法を使用して分析できます。まず、蛍光核酸色素の添加、肯定的な反応になりますイエロー/グリーン色で否定的な反応が肉眼で見える色はオレンジが表示されます。第二に、RT ランプ反応を蛍光核酸色素添加結果蛍光信号サンプルが紫外線によって興奮しているとき。否定的な反応は、陰性対照に少量存在する背景の蛍光性の検出可能な蛍光シグナルを持っていないでしょう。最後に、RT ランプ反応は agarose のゲル実行できます。肯定的な否定的な反応には DNA バンドがあるないに対し、RT ランプ反応はバンディング パターンを持っています。これらの解析手法の 3 つすべてを使用してこの例を図 2および3に示します。これらのサンプルのどれもは、RT ランプ前に分離した RNA を持っていた。図 1は、RT ランプの反応で使用のために十分である pbs は、全体蚊の粉砕を示しています。ZIKV RT ランプ反応の...

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ディスカッション

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人間と蚊の両方のサンプル6を使用してこの紙の作品で説明している ZIKV RT ランプの試金。検出限界は約 1 ゲノム等価6、症候性 ZIKV 感染患者の典型的なウイルス負荷は 10 なので十分なする必要があります3  106 Pfu/ml7。さらに、このメソッドは最初の分離する RNA と細胞培養におけるウイルスの増幅なしのサンプル ZIKV を検出できます。時間、コスト、および qRT PCR と比較してこのアッセイの健康上のリスクが大幅に減少します。

RNA 分離なしに行われる RT ランプ反応尿このプロトコルに示された容積比で使用できるようにします。一方、1 つは理論的に RT ランプ反作用で使用されるサンプルの量を高めることができる、このサンプルが尿ケアを行使しなければなりません。尿には、PCR 反応を阻害することができる複数の化学物質が含まれています。尿中の尿素が...

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開示事項

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レルと MBC ジカ ウイルス診断法の知的財産があります。残りの著者は競合する興味を持ってないです。

謝辞

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この作品は、モーリーンとロナルド ・ ハーシュ家族の慈善的貢献とフィールド神経科学研究所、ミシガン州の聖マリアによって支持されました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。我々 はまた、彼らの重要な原稿のレビュー博士ベルナデット Zwaans とエリヤ病棟をありがとうございます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Bst 2.0 WarmStart DNA ポリメラーゼNew England BiolabsM0537S
等温増幅バッファー ニューイングランドバイオラボB0537S
WarmStart RTx逆転写酵素ニューイングランドバイオラボM0380S
南極熱不安定UDGニューイングランドバイオラボM0372S
MgSO<サブ>4ニューイングランドバイオラボB1003S
100 mM dATPソリューションニューイングランドバイオラボズN0440SデオキシヌクレオチドセットN0446S
100 mM dCTP 溶液New England BiolabsN0441Sデオキシヌクレオチド セット N0446S
100 mM dTTP 溶液New England BiolabsN0443Sデオキシヌクレオチド セット N0446S
100 mM dGTP 溶液New England BiolabsN0442Sデオキシヌクレオチド セット N0446S
100 mM dUTP 溶液サーモフィッシャーサイエンティフィックR0133
SYBR グリーン I 核酸ゲル染色InvitrogenS7563
Nancy-520Sigma Aldrich01494
Low DNA Mass LadderInvitrogen10-068-013
ジカポジティブコントロールRobert Koch Institute, GermanyN/A
AgaroseThermo Fisher ScientificBP1600
BlueJuice Gel Loading BufferInvitrogen
10816015プライマー統合DNA技術カスタムオリゴ
ヌクレアーゼフリー 水アンビオンAM9938
尿防腐剤ノルゲン Biotek18126
ZIKV PCR標準ロバートコッホ研究所N / AベロE6細胞上清
DENV2 ニューギニアC制御コネチカット州農業実験ステーションN/A
剤

参考文献

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