低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロ アレイ技術

ここを見直してメソッドでは、このライブラリに対して関心の対象のスクリーニングの試みに続いて、マイクロ アレイ フォーマットの細胞外蛋白質のコレクションの印刷について説明します。低結合親和性によって特徴付けられる相互作用の検出のための重要なステップとしてタンパク質の多量体形成を同定しました。これらの相互作用の検出を高めるためには、マイクロ ビーズを使用して興味のクエリ タンパク質の多量体形成に基づくプロトコルについて述べる。

分泌され、細胞表面発現タンパク質 (総称して細胞外蛋白質と呼ばれる) その相互作用パートナーと一緒に、細胞間コミュニケーション、シグナリングと、微小環境との相互作用の主調整装置。彼らは、したがって、多くの生理学的および病理学的プロセスの調節に不可欠であります。人間のゲノム (≈5、000 の蛋白質) のおよそ四分の一を細胞外蛋白質のためエンコード、薬品開発¹主要なターゲットを表す体系的に提供された薬の意義とアクセシビリティを考えると。その結果、細胞外蛋白質は「druggable プロテオーム」として知られている、市場で承認された薬の既知の薬理作用を持つ蛋白質ターゲットの 70% 以上を表します。にもかかわらず、その重要性と豊かさ、細胞外のタンパク質-タンパク質相互作用 (ePPI) ネットワーク利用可能なデータベースで著しく過小評価のまま。これは根本的に利用可能なほとんどの技術²を使用してその特性を排除する細胞外蛋白質の複雑な生化学的性質のためです。まず、膜タンパク質は、過酷な洗浄の条件と洗剤; をしばしば含むプロセスの可溶化困難第二に、細胞外蛋白質は、不在のこれらの蛋白質の表現は、一般的には、糖鎖修飾異種システムに使用されるなど、関連する翻訳後修飾をしばしば欠いています。最後に、免疫細胞に発現共受容体などの受容体間の相互作用は、しばしば一時的なと非常に低い親和性によって特徴付けられる (〜 1 μ M ~ K_D > 100 μ M の範囲)。完全に、これらの蛋白質と最も広くパートナーをレンダリングの自然利用アフィニティ精製/質量分析法 (AP/ミリ秒) または細胞外空間における相互作用の検出には不向き酵母-2-ハイブリッドなどの技術^2,3。

これらの技術的課題を克服するため、細胞外蛋白質の小説の相互作用の発見を加速するために、我々 は高いカバレッジの細胞外タンパク質マイクロ アレイ^4,5を開発しました。マイクロ アレイ、高スループット研究に一般に従うサンプルの少量の高密度サーフェスの生成の利点を提供します。ゾル性細胞質の相互作用または特定の蛋白質家族^{6,7、中心とはいえタンパク質マイクロ アレイを用いた研究がいくつかのモデル有機体の蛋白質の相互作用に関連する洞察力を提供している以前 8}。対照的に、限られた仕事は、この技術を使って細胞外蛋白質の相互作用を調査するため行われています。単一膜貫通 (STM) 受容器表現に融合として遺伝子組換え細胞外ドメイン (ECD) と浄化された分泌蛋白質の包括的で非常に多様なライブラリを構築することで ePPIs の研究蛋白質マイクロ アレイ法を開発しました。アフィニティ精製⁴共通のタグ。蛋白質のマイクロ アレイのスクリーンの成功は、高品質タンパク質ライブラリの確立に大きく依存します。ライブラリとクエリの両方のタンパク質の発現、哺乳動物細胞や昆虫細胞優先的に選ばれた異種発現システムとして適切な添加糖またはジスルフィド結合などの翻訳後修飾を確保するため。SDS ページとサイズ排除クロマトグラフィー多角度レーザ光散乱は、組換え蛋白質の品質を評価するためによく利用されている手法です。タンパク質ライブラリは、エポキシシランのスライドに斑点を付けるし、長期使用のための-20 ° C で保存します。0.4 mg/ml を超えるタンパク質濃度は、以下のプロトコルに適しています。したがって、低発現タンパク質は、濃度ステップ前にサンプル印刷とストレージを必要があります。それにもかかわらず、この手法の主な利点は、必要なタンパク質の少量 (50 μ g のタンパク質が実行するための十分な > 2,000 画面)、最小限のクエリ蛋白質の消費量 (重複画面あたり 20 25 μ g) と一緒に。プロトコルおよび装置を使用して、ここで説明し、1 営業日以内蛋白質個々 のクエリの結果を生成できるライブラリが使用可能で、提供されます。

細胞外の環境の蛋白質の相互作用を検出するに主要な課題は、最も一般的に使用される方法論によって識別を排除、その特質上弱いまたは非定常自然から発生します。結合親和が大きく増えて弱いタンパク質相互作用^9,10,11の検出感度を向上させます。(Fc 融合として表される) クエリ蛋白質 multimerize する手法を開発した原理に基づく蛋白質 A をコートしたビーズ^4,5を使用しています。クエリ タンパク質の任意の潜在的な不活性化を避けるためには、ランダムなラベリング、我々 代わりに Cy5 と無関係な人間グロブリン G にラベルを付けるし、クエリ タンパク質と一緒にに追加タンパク質 A ビーズの直接接合のための成果物がなくなり、興味の蛋白質を染めます。いくつかの受容体ペアのマイクロモル親和性を考えると、非常に多価の錯体は信号対雑音比、可溶性タンパク質⁴として上映 Fc 融合クエリ蛋白質と比較してを高めます。

要約すると、このプロトコルの目標は受容体-リガンド相互作用の同定の既存の細胞外タンパク質ライブラリを含むマイクロ アレイ スライドの準備を記述するためです。スライド印刷、その後細胞外タンパク質ライブラリに対する興味の蛋白質のスクリーニングのためのプロトコルにするための手順を確認します。さらに、研究中のタンパク質の増加の親和を達成するためにマイクロ ビーズに基づく ePPIs の強化された検出法について述べる.ここで説明細胞外蛋白質のマイクロ アレイの技術は唯一蛋白質のマイクログラム量、クエリの下を用いてスクリーニングおよび低い偽陽性率と新規 ePPI を検出するための高速、堅牢で効率的なアプローチを表します調査。この技術は、各種受容体^12,13, を含むウイルス immunoregulators¹⁴、未知の細胞機能やシグナル伝達経路に関連する洞察力を提供している複数の研究を煽っています。デ orphanize 興味の任意の細胞外蛋白質に利用することができます。

1. 人間の細胞外蛋白質のライブラリの生成

1. 細胞表面受容体またはタンパク質マイクロ アレイ ライブラリのビルドに興味の分泌された蛋白質のリストをコンパイルします。特定の蛋白質家族 (たとえば、免疫グロブリン スーパーファミリー) または蛋白質特に研究のタイプを選択できるセル選択的に発現。
2. 細胞表面受容体シグナルペプチドとソフトウェア ツールを使用して膜貫通領域を識別することによって細胞外ドメイン (ECD) の境界を決定します。いくつかの関連するツールの自由に利用できるオンライン、材料表^15,16,17,18で参照されます。
3. 関連するベクトルに興味とクローンの遺伝子の ECD を合成します。適切なベクトルをトランスフェクトした細胞の調節されたメディアまたはバキュロ ウイルス昆虫細胞発現系から、分泌タンパク質や一般的な親和性の札の数を融合した ECD の STM 受容体を浄化することが。
   注: 適切なタンパク質の折り畳みの尤度と関連する修飾糖などの添加を最大化する (HEK 293/CHO 細胞など) の哺乳類細胞を用いたシステムが推奨されます。
4. 標準的な親和性の浄化方法で蛋白質を浄化します。以前の努力は、何百もの関心^{9,19,20の蛋白質のセットを生成するために量ることができる、タンパク質の精製に適した自動または半自動の手順を説明しています。 21}。
   注: SDS ページ、サイズ排除クロマトグラフィー (S)、または多角度レーザ光散乱 (モール) 任意の非共有結合集計を評価するために、タンパク質製剤の全体的な品質を制御する適しています。
5. 可能な限り、200 または 400 μ g/mL にタンパク質を調整-20 ° C のセラム チューブの長期貯蔵のための 80% グリセロールと株式を希薄化とこれらはマスターの株式を表し、必要なときだけアクセスする必要があります。
6. 96 ウェルのプレート (株式板) に各蛋白質 (100 μ L) の因数を転送、接着箔シールし、マイクロ アレイ スライド準備まで-20 ° C で保存します。凍結融解サイクルを最小限に抑え、タンパク質の安定性は、株式板が生成されます。

2. 細胞外蛋白質のマイクロ アレイの印刷

1. スライドの印刷の標準的な microarrayer を使用します。ここで説明されているプロトコルの利用楽器は 57 スライド/実行能力し、ホールディング 48 スポッティング ピン印字ヘッドを使用します。これらのピンは ~ 350 μ m のスポットを距離で区切られた ~ 100 μ m 径のスポットを生成し、負荷ごとの 0.25 μ L を描画します。この設定では、スライドあたり 8,000 点まで対応できます。
2. 株式板から作業プレート (10 μ L のサンプル/ウェル、384 ウェル プレート) を生成します。この手順では、手動で、microarrayer を使用してスライド印刷する前に。その後、クイル型 (蛋白スポットの脱水を防ぐため) に 60% 湿度でエポキシシラン スライドにスポッティング ピンが付いている蛋白質を見つけます。
   注: Cy3 標識ウシ血清アルブミン (BSA) は、マスクのフィッティング (セクション 4 を参照) の配列を視覚化する各蛋白質のサンプル (PBS/40% グリセロールの 5 μ g/mL) 間での重複の発見することができます。お勧めは、この手順は省略できます。
3. 印刷後加湿環境からタンパク質マイクロ アレイ スライドを削除し、一晩 pbst; 表面を不活性化するために 5% ミルクでそれらをブロックします。
   注: 推奨されるアプローチは、超音波噴霧器を使用して、スライド面上に配置ソリューションをブロックの細かい霧を生成することです。
4. 凍結を防ぐために 50% のグリセロールに-20 ° C でスライドを保存します。

3 多価餌錯体の合成

注: 細胞外タンパク質間相互作用は、低親和性によって特徴付けられる多くの場合。結合親和、ECD、タグ付きの Fc として表されるクエリ タンパク質を捉えるに基づく多価アプローチを増やすことによってこれらの相互作用の検出を有効にするには、蛋白質のコーティング ビーズの開発⁴であった。

1. キャリア IgG Cy5 monoreactive 色素の検出のためにラベルを付けるし、脱塩カラムを使用して無料の色素を分離します。280 と 650 nm 帯紫外吸光度を測定することによりタンパク質の比率に色素を決定します。
   注: タンパク質-色素の比率は 2.0、4.0 は、通常使用されます。ラベリング処理のための潜在的な水溶性集計を削除する 15 分間 100,000 × g Cy5 抱合体をスピンすることをお勧めします。
2. クエリの蛋白質の一定量に対して蛋白質の滴定によって最適なビーズとタンパク質比を決定します。Biolayer 干渉法による決定競争の試金を使用して測定される最小限の飽和量のビーズ無料 Fc タグ付きタンパク質が残っていない場所はスクリーニングに使用されます。
3. タグ付きの Fc クエリおよび蛋白質のマイクロ ビーズと光から保護部屋の温度で 30 分間、PBS でチューブ回転子にミックス Cy5 IgG の孵化によってビーズ タンパク質複合体を形成します。
4. これらの複合体を形成、20 μ g/mL の最終的な集中でクエリ タンパク質を使用します。IgG の分子量によってクエリ蛋白質の分子量を分割クエリ蛋白質および Cy5 IgG のモル比を計算する (150,000 Da) 必要と Cy5 IgG 濃度を決定するため 40 μ g/mL を掛けると。
5. 可溶性タンパク質の配列に存在する Fc 融合タンパク質の任意無料蛋白質 A ビーズの結合を防ぐため、(1 mg/mL) 孵化直前でマイクロ アレイ スライド (後述の 4.2 を参照) でサンプルを補足します。
   メモ: 最終的な反応ボリュームは利用交配駅、インキュベーション室によって異なります。材料の表に記載されているインストルメンテーションにより、比較的小さなボリューム (スライドごと 〜 200 μ L) を使用してサンプルの培養です。

4. 細胞外蛋白質のマイクロ アレイのスクリーニングおよび処理します。

注意: 自動処理プラットフォームを提供するメーカーの数があります。交配駅が使用できない場合次の手順を手動で実行することができます、すべての回で冠水したスライドを保持するバッファーの十分な量があることを確保します。

1. 暖かい室温でスライドと交配ステーションにロードする前に残留グリセリンを削除する PBS/0.1% Tween 20 (pbst;) ですすいでください。
2. 次のスクリーニング プロトコルを使用します。
   1. 1 分の PBST で洗ってください。
   2. PBS/5% ミルクで 1 mg/mL 蛋白質 A の 200 μ L を読み込み、マイクロ アレイに存在する Fc タグ付きタンパク質へ結合ビーズ単量体蛋白質を防ぐために 30 分間インキュベートします。
   3. 1 分の PBST で 5 回を洗ってください。
   4. 1 mg/mL 蛋白質の存在下で複雑なクエリ: ビーズの 200 μ L を読み込み、30 分間インキュベートします。
   5. 1 分の PBST で洗ってください。
3. 交配後すすぎ水スライド、各 50 mL の円錐管に配置し、5 分間 900 x g で回して乾燥します。
4. 最後に、それぞれ 532 と 635 nm で励起することにより (BSA Cy3 がプリントされた) 場合、Cy3 を検出する適切なマイクロ アレイ スキャナーと Cy5 蛍光スライドをスキャンします。
5. 付属のマイクロ アレイ データ解析を用いたデータ解析を実行します。(.Gal ファイル) として関連する配列リストは、データ抽出ソフトウェアに読み込まれます。この段階でブロックを検索し、必要に応じて機能の手動配置に続いて、ソフトウェアの自動調整オプションを使用する Cy3 BSA スポットを利用します。さらに分析のための .gpr ファイルとしてファイルを保存します。

5. データの解析

1. GPR ファイルと r 一般マイクロ アレイ データ^4、5の解析のために利用、limma パッケージを使用してプロセスとしてデータを保存します。
   1. 前処理を行う背景補正とスライド内正規化。以来、各蛋白質を重複スポットで印刷すると、ライブラリでそのタンパク質の 1 つスコアを作成する両方のレプリケートの測定を組み合わせます。
   2. スライドごとにスコアを計算し、高得点候補者スライド間の交差の結果を分析します。
   3. スライド変動のコントロールに別の印刷実行から重複するマイクロ アレイを使用して、両方の画面からデータを表す交点プロットを使用して最終ヒットを呼び出します。
   4. 最後に、アレイ内での無差別の蛋白質を除外するフィルタ リングの追加レベルを実行します。このような非固有のバインダーは、蛋白質が特定のしきい値を超えるヒット頻度の独立した画面で、ユーザーが定義したように識別されます。
      注: このプロトコル、トムら2013⁵で詳しく説明します。呼び出す非特異的バインダーは累積の決定に基づいて我々 の場合ヒット率の餌食し、5% のデータ駆動型消去しきい値が使用されます。

細胞外蛋白質のマイクロ アレイの技術のワークフローの図を図 1に示します。細胞外タンパク質ライブラリを含むマイクロ アレイ スライドがあります、一度関心とデータ分析のタンパク質のスクリーニングは 1 日以内で完了できます。受容体の膜に埋め込まれた間多くの生理学的に関連する相互作用は非常に弱い結合力 (KDマイクロモルの範囲内) で特徴付けられます。このような相互作用の検出を高めるためには、タンパク質 A マイクロ ビーズにタンパク質 (Fc 融合として表される) 多量体を形成クエリに基づく方法が開発されました。このプロトコルは、テキストで記述されているし、PPI の強化された検出のためのこのアプローチの性能の代表的な例は図 2に示します。

タンパク質マイクロ アレイ画面の代表例を図 3に示します。、例では、孤立したヒト アデノ ウイルス免疫調節タンパク質以上 1,500 受容体 ECD から成るライブラリに対して相互作用についてスクリーニングする, または分泌タンパク質14。前述のように、ウイルスのタンパク質の ECD は recombinantly、Fc 融合タンパク質として発現、次いで多価錯体を形成するために蛋白質のコーティング ビーズ。手動操作を最小限に抑えるため交配ステーションを使用して蛋白質の複合体を上映、ただし、同様の画面が交配の商工会議所または類似のデバイスを使用して実行できます。印刷実行中に任意の可変性を制御するために別のスポッティング実行で印刷スライドを使用して重複する画面を実行する勧めします。図は、重複する、独立した画面から得られた交点プロットを示しています。肯定的な相互作用と全体的なスライドの背景はヒット通話を促進するプレート (Cy5 蛍光) のスキャン時に容易に視覚化します。ヒットの自信を高めるために重複のライブラリの各受容体を発見するが推奨されることに注意してください。ほとんどのクエリ蛋白質をなし、1 つ、またはいくつかのヒットが観察される、PPIs の検出の方法の特異性を示します。

特定のクエリのタンパク質は、バインド配列内の蛋白質の異常に高い数および/またはスライドによって検出された高の背景を表示します。我々 の経験でこのような非固有の背景を観察して、蛋白質の数が少ないため。タンパク質の性質に関するさまざまな要因グリコシル モチーフの認識などの非特定の相互作用に影響を与える可能性があります。特定のヒットの同定は除外高いバック グラウンドを示したマイクロ アレイ ライブラリに対して上映ウイルス蛋白質の例を図 3に示します。これらのインスタンスが (増加の塩、洗剤濃度など)、バック グラウンドを減少するプロトコルのマイナーな修正を考慮することは、研究中のタンパク質の deorphanization のための代替方法を探索することをお勧めします。

図 1: 受容体-リガンド相互作用の迅速な同定のため細胞外蛋白質のマイクロ アレイ。(ステップ 1)興味の細胞外蛋白質のライブラリがコンパイルされます。(ステップ 2)浄化された蛋白質がエポキシシラン スライド マイクロ アレイのプリンターを使用して印刷し、-20 ° C で保存(ステップ 3)興味のクエリ蛋白質は、増加の親和と一時的なタンパク質-タンパク質相互作用の検出のためのマイクロ ビーズの multimerized です。蛍光 IgG は不活性ラベル キャリアとしてクエリ: マイクロ ビーズとの複合体です。(ステップ 4)クエリのタンパク質の結合パートナーのスクリーニング。タンパク質の蛍光のクエリは、自動スライド処理のため交配ステーションを使用して細胞外蛋白質のマイクロ アレイに対して選別されます。(手順 5)マイクロ アレイ スキャナーを使用して、スライドは、可視化しました。535 nm チャンネルで BSA Cy3 スポットを観察し、画面から得られたヒットは 635 で重複するスポットとして観察できる nm。ヒットを呼び出すのためのデータ分析は、2 つの独立した実験の交点プロットを作成することによって実行されます。プロトコル セクションの説明に従って、背景の上相互に高得点に基づいてヒットと呼ばれます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: クエリ蛋白質の多価錯体の生成を介して強化された信号。(A)クエリ蛋白質.の多量体形成クエリ タンパク質は遺伝子組換え Fc 融合として表されます、フォーム multimerized 複合体に蛋白質のマイクロ ビーズに結合します。(B)高親和は、低親和性の相互作用の検出に します。親和は高い信号雑音比と強化されたヒットにつながる、蛋白質のマイクロ アレイの弱い相互作用の安定化 multimerized 結果蛋白質によって与えられます。プロットは、ヒットの可視化を有効にするには、CD200、複雑なビーズとして上映か Cy5 染料と直接分類可溶性タンパク質のスクリーニング結果を示しています。多量体形成 (赤い棒) には、水溶性製品 (青い棒) として同じ蛋白質と比較して有意な信号/ノイズ比低親和性結合パートナー CD200R1、タンパク質マイクロ アレイ ライブラリに存在の堅牢な検出が可能します。灰色のバーは、非固有のバインダーを示します。のみトップ 10 相互作用は、プロットで表されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 新規受容体受容体ウイルス-宿主間相互作用の同定蛋白質のマイクロ アレイ技術。(A)孤児アデノ ウイルス免疫調節蛋白質のための模範的な受容体探索結果。画像は、重複 (赤) で発見タンパク質からのヒットを表示、実際のマイクロ アレイ スキャンを表します。アッセイは、任意のスライドの可変性との交点プロットとして表される結果コントロールに重複で実行されます。プロット、黒いドットは、両方の独立した実行から交差するヒットを表すに対し、赤と青のドットはヒット 1 つのアレイのレプリケーションでのみ呼び出さを表します。全体のマイクロ アレイ ライブラリは、蛋白質、コレクションと配列の発見個々 の蛋白質ごとの十分な分離を確保するために存在の数を考えると使いやすさを 2 つのスライドに印刷されます。(B)排除高いバック グラウンドを示すウイルス蛋白質画面呼び出しをヒットしました。特定のクエリのタンパク質は、したがって高得点安打の同定のための課題を提起する複数のタンパク質やスライド、バインディングによって検出された高いバック グラウンドを表示ことがあります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

学、S.R R と N.M M。ジェネンテック社の従業員は、ジェネンテック社/ロシュ ・ グループの株式。