Method Article

低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロ アレイ技術

DOI:

10.3791/58451

⸱

January 7th, 2019

 ,  ,  , 
1Receptor Discovery group, Microchemistry, Proteomics and Lipidomics Department, Genentech, 2Portfolio Management and Operations, Genentech

In This Article

Summary

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高スループットで新規受容体-リガンド相互作用の同定のため画面細胞外蛋白質のマイクロ アレイのプロトコルを紹介します。タンパク質マイクロ ビーズの複合体を使用して、一時的なタンパク質-タンパク質相互作用の検出を強化する方法について述べる。

Abstract

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分泌因子、つなが膜の受容体と相互作用する相手は携帯電話通信の主なレギュレータと恒常性と病の間にカスケードをシグナル伝達の開始など治療の主な対象を表します。その妥当性にもかかわらずこれらの相互作用のネットワーク現在データベースで著しく過小評価のまましたがって、最も細胞外タンパク質が、文書化された結合パートナーを持っていることはないです。この不一致は主に機能性タンパク質と弱い、低親和性蛋白質の相互作用の細胞表面受容体の間が確立の表情など、細胞外のタンパク質の研究に関連する課題。このメソッドの目的は、細胞外蛋白質蛋白質蛋白質の相互作用のスクリーニングのためのマイクロ アレイ フォーマットのライブラリの印刷を記述することです。弱い相互作用の検出を有効にするには、調査の下でクエリ タンパク質の多量体形成に基づく方法が説明されています。増加 multivalency のこのビーズ ベースの多量体形成のアプローチに結合、蛋白質のマイクロ アレイは、高スループットの一時的なタンパク質-タンパク質相互作用の検出をことができます。この手法アプローチを提供迅速かつ低サンプル消費-細胞外蛋白質を適用可能な新しい相互作用を識別するため。蛋白質のマイクロ アレイの印刷とスクリーニング プロトコルを説明します。この技術は、細胞外空間におけるタンパク質相互作用の検出のための堅牢なメソッドを求めて捜査の役に立つでしょう。

Introduction

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ここを見直してメソッドでは、このライブラリに対して関心の対象のスクリーニングの試みに続いて、マイクロ アレイ フォーマットの細胞外蛋白質のコレクションの印刷について説明します。低結合親和性によって特徴付けられる相互作用の検出のための重要なステップとしてタンパク質の多量体形成を同定しました。これらの相互作用の検出を高めるためには、マイクロ ビーズを使用して興味のクエリ タンパク質の多量体形成に基づくプロトコルについて述べる。

分泌され、細胞表面発現タンパク質 (総称して細胞外蛋白質と呼ばれる) その相互作用パートナーと一緒に、細胞間コミュニケーション、シグナリングと、微小環境との相互作用の主調整装置。彼らは、したがって、多くの生理学的および病理学的プロセスの調節に不可欠であります。人間のゲノム (≈5、000 の蛋白質) のおよそ四分の一を細胞外蛋白質のためエンコード、薬品開発1主要なターゲットを表す体系的に提供された薬の意義とアクセシビリティを考えると。その結果、細胞外蛋白質は「druggable プロテオーム」として知られている、市場で承認された薬の既知の薬理作用を持つ蛋白質ターゲットの 70% 以上を表します。にもかかわらず、その重要性と豊かさ、細胞外のタンパク質-タンパク質相互作用 (ePPI) ネットワーク利用可能なデータベースで著しく過小評価のまま。これは根本的に利用可能なほとんどの技術

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Protocol

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1. 人間の細胞外蛋白質のライブラリの生成

  1. 細胞表面受容体またはタンパク質マイクロ アレイ ライブラリのビルドに興味の分泌された蛋白質のリストをコンパイルします。特定の蛋白質家族 (たとえば、免疫グロブリン スーパーファミリー) または蛋白質特に研究のタイプを選択できるセル選択的に発現。
  2. 細胞表面受容体シグナルペプチドとソフトウェア ツールを使用して膜貫通領域を識別することによって細胞外ドメイン (ECD) の境界を決定します。いくつかの関連するツールの自由に利用できるオンライン、材料表15,16,17,18で参照されます。
  3. 関連するベクトルに興味とクローンの遺伝子の ECD を合成します。適切なベクトルをトランスフェクトした細胞の調節されたメディアまたはバキュロ ウイルス昆虫細胞発現系から、分泌タンパク質や一般的な親和性の札の数を融合した ECD の STM 受容体を浄化することが。
    注: 適切なタンパク質の折り畳みの尤度と関連する修飾糖などの添加を最大化する (HEK 293/CHO 細胞など) の哺乳類細胞を用いたシステムが推奨されます。
  4. 標準的な親和性....

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Results

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細胞外蛋白質のマイクロ アレイの技術のワークフローの図を図 1に示します。細胞外タンパク質ライブラリを含むマイクロ アレイ スライドがあります、一度関心とデータ分析のタンパク質のスクリーニングは 1 日以内で完了できます。受容体の膜に埋め込まれた間多くの生理学的に関連する相互作用は非常に弱い結合力 (KDマイクロモルの範囲内) で特徴付けられます。このような相互作用の検出を高めるためには、タンパク質 A マイクロ ビーズにタンパク質 (Fc 融合として表される) 多量体を形成クエリに基づく方法が開発されました。このプロトコルは、テキストで記述されているし、PPI の強化された検出のためのこのアプローチの性能の代表的な例は図 2に示します。

タンパク質マイクロ アレイ画面の代表例を

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Discussion

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人間のゲノムでは、オーファン受容体のかなりの数が残っているし、以前特徴付けられる配位子を細胞外蛋白質のために出現し続ける小説の相互作用のパートナー。ディクテーション中不全疾患につながるだけでなく、恒常性は、携帯電話通信のメカニズムを理解し、したがって新しいまたは強化された機能を知らせる重要な人間の受容体-リガンド相互作用やモデル生物の定義は治療オプションです。それにもかかわらず、広く使用されている技術によって細胞外蛋白質の相互作用の検出は、細胞の受容体との相互作用のパートナーの生化学に関連する技術上の課題のために主に重要な障壁を表現しています。このレポートのクエリ PPIs の強化された検出のためのマイクロ ビーズ錯体の利用に重点を置いて、興味の蛋白質のスクリーニングのための細胞外蛋白質のマイクロ アレイの使用をについて説明します。

徹底的な受容体受容体相互作用は特に挑戦的な多くの生理学的に関連するペアはマイクロモル範囲2,3の結合親和性と非常に弱い相互作用によって.......

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Disclosures

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学、S.R R と N.M M。ジェネンテック社の従業員は、ジェネンテック社/ロシュ ・ グループの株式。

Acknowledgements

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原稿を批判的に読み、Philamer Calses と神戸ユンに感謝します。ランディ円優れた技術的なアドバイスに感謝しております。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
超高純度MBグレードグリセロールUSBコーポレーション56-81-5タンパク質貯蔵
SeptoMarkブロッキングバッファー ZeptosensBB1, 90-40ブロッキングバッファーマイクロアレイスライド
ウシ血清アルブミンロシュ03-117-957-001マスクフィッティング用スライドコントロール(オプション)
ポリプロピレン製マルチウェルプレートGreiner Bio One82050-678タンパク質保存
ポリプロピレン製マルチウェルプレートArrayitMMP384スライド印刷
NanoPrint LM60、または同様の接点マイクロアレイArrayitNanoPrint LM60、または同様の接触式マイクロアレイスライド印刷
マイクロスポッティングピンArrayitマイクロスポッティングピンスライド印刷
ZeptoFOGブロッキングステーションZeptosensZeptoFOGブロッキングステーション、1210印刷後のブロックスライド
スキムミルクパウダーサーモフィッシャーLP0031ブロッキングソリューション
エポキシシランコーティングガラススライドネクストリオンスライドE1064016マイクロアレイスライド
ガラスホルダーとスライドラックセットウィートン900303スライドストレージ
Cy5モノ反応性色素GEヘルスケアPA23031アルブミンラベリング
Cy5モノ反応性色素GEヘルスケアPA25001ヒトIgGラベリング
プロスピン脱塩カラムプリンストン分離CS-800遊離染料の除去
接着アルミホイルシールAlumaSealF-384-100シールストックプレート
ポリプロピレン極低温バイアルコーニング430658タンパク質ライブラリ保存用マスターバイアル
プロテインA マイクロビーズMiltenyi120-000-396クエリタンパク質多量体化
ヒトIgG ジャクソン免疫研究 009-000-003
プロテインAシグマ P7837マイクロアレイ スライドブロッキング
ハイブリダイゼーションステーション、a-Hyb または類似のMiltenyiハイブリダイゼーションステーション、a-Hyb または類似のマイクロアレイ処理 (オプション)
GenePix 4000B スキャナーまたは類似の Molecular DevicesGenePix 4000B スキャナーまたは類似のスライドスキャン
GenePix Pro または同等のデータ抽出ソフトウェアMolecular DevicesGenePix Proまたは同等のデータ抽出ソフトウェアデータ処理
Signal P4.1DTU Bioinformatics, Technical University of Denmarkオンラインソフトウェアシグナルペプチド切断部位の存在と位置を特定する予測ツール
TMHMM 2.0 serverDTU Bioinformatics, Technical University of Denmarkonline softwareタンパク質中の膜貫通ヘリックスの予測
Phobiusストックホルムバイオインフォマティクスセンターのオンラインソフトウェア貫通トポロジーとシグナルペプチド予測器の組み合わせ
TOPCONSストックホルム大学のオンラインソフトウェア膜トポロジーとシグナルペプチドの予測
の標識に無関係なIgG 膜

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
  2. Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interact....

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