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Summary

安易なプロトコルである polydopamine と連日の表面を高機能化する. します。

Abstract

連日 (NDs) の表面機能化は ND 表面官能基の多様性のためにまだ挑戦です。ここでは、ムール貝に触発された polydopamine (PDA) コーティングを使用して、NDs の多機能表面改質のための単純なプロトコルを示します。さらに、NDs の PDA の機能層は、合成、金属ナノ粒子を安定させる還元剤として勤めるかもしれません。ドーパミン (DA) は、自己重合し、NDs とドーパミンは単に一緒に混合される場合自発的に PDA ND 表面層を形成できます。PDA の層の厚さは、DA の濃度を変化させることにより典型的な結果では、厚さの 5 〜 へ 〜 15 PDA 層の nm を 100 nm ND 懸濁液に da 50 から 100 μ g/ミリリットルを追加することによってアクセスできます。Ag などの金属イオンを減らすために、PDA NDs を基板として使用するさらに、[(NH₃)₂]⁺、銀ナノ粒子 (AgNPs)。Ag の初期濃度に依存して、AgNPs のサイズ [(NH₃)₂]⁺。Ag の濃度の増加とともに [(NH₃)₂]⁺、NPs の直径だけでなく、NPs の数が増えます。要約すると、この研究は pda、NDs の表面を修正する簡便な手法を提案するだけでなく、また高度なアプリケーション (AgNPs) などの様々 な種の固定による NDs の拡張機能を示します。

Introduction

ナノダイヤモンド (NDs) 新規の炭素ベース材料は、さまざまなアプリケーション^1,2で使用するため近年でかなり注目を集めています。例えば、NDs の高い表面積は超化学的安定性および熱伝導率³のため金属ナノ粒子 (NPs) の優れた触媒サポートを提供します。さらに、NDs は、バイオ イメージングの重要な役割、バイオセンシング、ドラッグデリバリーのための優れた生体適合性と nontoxicity^4,5を再生します。

その機能を効率的に拡張するため共役蛋白質、核酸、ナノ粒子⁶など NDs の表面に機能性種に貴重なものです。さまざまな機能グループ (e.g、水酸基、カルボキシル基、ラクトンなど) が作成されますその浄化中に NDs の表面に官能基の共役利回りがまだ非常に低いそれぞれの低密度のため。アクティブな化学グループの⁷。これはがちで不安定な NDs で結果集計、アプリケーション⁸をさらに制限すること。

現在、NDs を高機能化するために使用する最も一般的な方法は、共有結合の共役を銅フリー クリック化学⁹、ペプチド核酸 (PNA)¹⁰、および自己組織化 DNA¹¹の共有結合連鎖を使用しています。NDs の非共有結合の折り返しも提案されている炭水化物変更 BSA⁴、HSA¹²コーティングなど。ただし、これらの方法は時間がかかり、非効率的なので、NDs の表面を変更する簡単で一般的に適用される方法を開発できることが望ましいです。

遵守し、機能性ナノ粒子、金ナノ粒子 (結果)¹⁴Fe₂O₃¹⁵SiO₂^{16 などの広く使用されたドーパミン (DA)13脳の自然な神経伝達物質として知られています。}.自己重合 PDA 層豊かにアミノ基とフェノールのグループ、または簡単に溶液中におけるチオール/アミンを含む生体分子の固定化金属ナノ粒子を直接抑える更に利用されることができます。この単純なアプローチは、秦らにより NDs を施してに最近適用されました。当社研究所^17,18DA 誘導体を用いて NDs経由でクリックして化学以前研究^19,20の変更が。

ここでは、NDs を効率的に functionalizes 簡単な PDA ベースの表面改質手法について述べる。DA の濃度を変化させることによって数ナノメートルから数十ナノメートルの PDA 層の厚さを制御できます。さらに、金属のナノ粒子は直接小さくなり、さらに毒性軽減剤を必要とせず PDA 表面安定化します。銀ナノ粒子のサイズ Ag の初期濃度に依存して [(NH₃)₂]⁺。このメソッドにより、NDs の表面上の PDA の制御された堆積と ND の合成触媒の優れたナノ プラットフォームをサポートしている、バイオ イメージング、NDs の機能を飛躍的に向上させる AgNPs,の共役とバイオ センサー。

Protocol

1。試薬の調製

注意: は、読み取り、使用する前に関連するすべての材料安全データ用紙 (MSDS) を理解してください。化学物質は、毒性、揮発性があります。特別な取り扱い手順やストレージの要件に従ってください。実験中に、潜在的な危険を避けるために個人用保護具、手袋、安全眼鏡、白衣などを使用します。

1. トリス塩酸バッファーの準備
   1. 100 mL の脱イオン H₂O にトリス粉末 30.29 g を溶解、粉末が完全に分解することを確保し、250 mL メスフラスコにソリューションを転送します。
   2. Tris バッファーの 1.0 M を与えるメスフラスコで 250 mL のスケールに脱イオン H₂O を追加します。
   3. 1.0 M Tris バッファー 100 倍を与える 0.01 M トリス バッファーを希釈し、1.0 M 塩酸標準溶液を使用して 8.5 に pH を調整します。
   4. 0.01 M トリス塩酸バッファーの ph を調整するのに pH メーターを使用します。
2. ND の懸濁液の準備
   1. 100 を希釈 50 倍 ND 懸濁液の 0.02 mg/mL を与えるに 0.01 M トリス塩酸バッファーと単結晶 ND 懸濁液 (1.0 mg/mL) の nm。
3. ドーパミン溶液の調製
   1. 2.0 mL 10 mg/mL DA ソリューションを与えるための 0.01 M トリス塩酸バッファーの中の塩酸ドーパミンの 20 mg を溶解します。
      注: DA ソリューション必要があります新鮮な準備、使用 15 分以内。
4. Ag [(NH₃)₂] ああ溶液の調製
   1. アグノ₃ 10 mL の脱イオン H₂O 10 mg/mL アグノ₃ソリューションを与えるためには固体の 100 mg を溶解します。
   2. 1.0 M 水酸化アンモニウム (NH₃· を追加します。H₂O) 黄色までアグノ₃溶液に滴下フォームを沈殿し、NH₃· を追加していきます沈殿が消えるまでは、H₂O ソリューションです。
      注: 必要な最小ボリュームを作る使用直前に準備し、使用後に直ちに破棄します。
      注意: 追加 NH₃·H₂O 顔がヒューム フードの盾、手袋、ゴーグルしています。

2。NDs (PDA-NDs) の表面に合成 PDA 層

1. 作りたて DA ソリューション (10 mg/mL) を与えるため ND 懸濁液に最終濃度 50、75、100 を様々 なを追加 DA の μ G/ml1.0 mL に全反応音量を調整、10 mL テスト チューブにそれを転送し、25 ° C、12 時間暗闇の中で活発にかき混ぜます。
2. 16,000 x g で 2 h の PDA NDs ソリューションを遠心分離機、上澄みを除去し、16 歳で 1 h の脱イオン水にて 3 回洗浄 000 x g たびに。
3. 30 超音波処理と脱イオン水を 200 μ l 添加の PDA NDs を再分散 s。PDA – NDs のコーティングさらに使用できるようになります。

3。PDA NDs (AgNPs-PDA-NDs) の表面に AgNPs の削減

1. 脱イオン水で 2 回ステップ 2.3 で事前合成 PDA NDs の 40 μ L を希釈します。Ag の最終濃度を与えるために追加 Ag [(NH₃)₂] ああソリューション [(NH₃)₂]⁺ (0.08 0.16 0.24、0.40、0.60 mg/mL)。
2. 1.5 mL 遠心管中 100 μ L に最終的な音量を調整するには、脱イオン水、10 分間超音波処理を追加します。
3. 遠心分離機の AgNPs-PDA-NDs 16,000 × gで 15 分間無料銀イオンを除去、遠心分離後に上清を破棄、100 μ L の脱イオン水を追加、各時間 5 分 16,000 x gで脱イオン水で 3 回を洗浄します。
4. 30 の超音波処理と deionizedwater の 100 μ L の AgNPs PDA NDs を再分散 s それ以上の使用のために準備します。

4。PDA NDs と AgNPs PDA NDs クラスターの分析

1. (UV) の紫外・可視吸収スペクトル
   1. UV スペクトルを使用して、PDA ND 面 AgNPs の平均サイズ分布を監視します。手順 3.4 で 1 cm 石英キュベットで Ag [(NH₃)₂] オハイオ州の様々 な濃度の準備 AgNPs PDA NDs サンプルを転送し、250 に 550 のスキャン波長で吸収を監視 nm。
2. 選挙顕微鏡 (TEM)
   1. 場所にグリッドを維持するパラフィルムで包まれたスライド ガラスにコーティング炭素銅グリッドを配置します。プラズマ クリーナーに添付の TEM グリッドをガラス スライドを挿入します。クリーナーのプラズマと真空ポンプを入れます。5 分後、プラズマをオンにし、3 分の中規模電力レベルとグリッドを放電します。
   2. 預金 5 炭素フィルムのサンプルの μ L 被覆 Cu-グリッド 3 分使用濾紙グリッドの端から余分なサンプルを放出します。15 のためのグリッドに脱イオン水のドロップを預金し、塩を削除する s は、ろ紙を水を芯します。2 回洗濯手順を繰り返し、さらに使用のための乾燥空気にグリッドを許可します。
   3. 38,000 倍の倍率で通常、TEM による試料を可視化します。200 は、KV。

Representative Results

Discussion

自己重合 DA コーティング、NDs の表面機能化と Ag の削減のための詳しいプロトコルを説明 [(NH₃)₂]⁺ PDA レイヤー (図 3) に AgNPs します。戦略は、DA の濃度を変更するだけで PDA 層のさまざまな厚さを作り出すことができます。AgNPs のサイズは、元の金属イオン溶液の濃度を変えることによって制御できます。図 1Aの TEM 画像では、ノンコート 100 nm NDs フォーム マイクロクラ スターと集計しがちだったが表示されます。NDs は、PDA で内部に閉じ込められた、薄いリングとして示した PDA レイヤーは、NDs をラウンドします。PDA の層の厚さ、TEM 画像で測定したが約 5 nm、10 nm、および 15 nm、それぞれ最終的な DA 50 μ G/ml、75 μ g/mL、100 μ g/mL、濃度に相当します。NDs の懸濁液の色が無色からコーティング、ND 面で PDA の成功した文字列の折り返しを示す、PDA の厚さが DA の濃度に依存していたことを示す暗い次の PDA に変更する観察されました。注意してください: DA 重合に影響を与える重要な要因です (最も好ましい値は 8.5²³) pH 条件。ソリューションの正確な pH 値は、PDA の層の厚さを制御するために有益です。さらに、高速攪拌重合時に NDs の分解と制服を着た PDA 層の形成のため必要です。したがって、このメソッドは、アルカリ性溶液中で安定していない粒子に有効ではありません。

紹介する PDA の厚みに貢献した要因を記述する式 (1) ND 面上 PDA 層の形成を記述します。これは PDA への前レポート^21,22からのナノ粒子の運動方程式に基づいています。初期濃度の DA (C₁m/v)、反応時間 (t)、および (d) PDA 層の厚さは次のとおりです。

(1)

R (と仮定すると NDs は球) NDs の半径、 p₁ PDA の密度である、 V₁は反応体積、 N₁は NDs の番号、 k₁は、pH 値、部分的に関連する定数O₂、周囲温度と光度²³の圧力。したがって、PDA の層の厚さとして記述できる式 (2)

(2)

我々 に書き換える場合または式 (1 (3) ):

(3)

その後、 dはRよりもはるかに少ないためにd³と 3d²Rを排除 (d<<R)。

最後に、 dと表現できる式 (4)

(4)

塗装工程は、da 消費し、紫外-可視スペクトルによって監視されて完全に 12 h を必要です。したがって、は、定数とdの値は実験の結果 (表 1) によって確証された DA (C₁) の初期濃度に正比例します。注意してください、PDA の層の厚さの増加と共に NDs PDA の表面積の増加のための層の蓄積速度が遅かった。

直接金属前駆体と PDA コーティング表面^{24,25,26、その固定化の削減にナノ粒子の成長を誘発する PDA のカテコール グループの存在が示されています。 27}。後 PDA 層で 100 nm NDs をコーティング (~ 15 nm)、結果 PDA NDs は、超音波処理の援助を得て、金属イオン溶液から AgNPs を合成する基板として使用されました。[Ag (NH₃)₂] の増加を図 2に見られるように⁺ 〜 24 から濃度、AgNPs のサイズの増加 〜 28 nm nm、および NPs 117、97 から調達 [Ag (NH₃)₂] に対応する数⁺ 0.4 〜 0.6 mg/mL の濃度それぞれ。この現象は、紫外可視分光法によって特徴づけられることができます。ナノ粒子の吸光度のピークが徐々 に [Ag (NH₃)₂] の濃度として登場した⁺増加 (図 4)。たとえば、ナノ粒子の最大吸光度は 0.4 と 0.6 mg/mL [Ag (NH₃)₂] の削減によって形成される⁺は 410、430 nm の, それぞれ ∼20 および ∼30 nm の直径を持つ AgNPs に対応します。これは、TEM 観察¹⁷と一致。

減らされた AgNPs の直径に続く最初の順序線形微分方程式 (5) SはC₂ PDA NDs の表面領域に結果²⁸日の種結晶成長合成に似ています。Ag の初期濃度は、[(NH₃)₂]⁺、 tは反応時間、 rは AgNPs の半径、 ₂ kは定数、 p₂ Ag は、 V₂の密度であります。反応体積、 N₂は AgNPs、数、 S · n、 nはアクティブなカテコールの平均数グループに等しいは Ag を減らすことができます [(NH₃)₂]⁺。AgNPs は球として扱われます。

(5)

式で AgNPs の数と直接 PDA の層の厚さに依存している PDA の表面積に比例するとしました。PDA の層の表面に、AgNPs Ag の連続的な減少となった [(NH₃)₂]⁺O – AgNPs の種子の前駆物質として役立った PDA のサイトで金属 (0) 結合をしながら。AgNPs の数は面積^23,29,30,31に正比例している PDA に O サイトに比例します。その一方で、減らされた AgNPs を均等に分散 PDA 面上ので Ag [(NH₃)₂]⁺ PDA レイヤー上の制服を着たカテコール グループによって減った。調べた結果、Ag の初期濃度が高く [(NH₃)₂]⁺が大きく、AgNPs が、したが、各 ND 上の NPs の同じような数。[Ag (NH₃)₂] の初期濃度比⁺ (C₂) 比 (0.6 mg/mL: 0.4 mg/mL = 1.5) の平均半径の 3乗と一致した [(14/12)³= 1.588]。したがって、PDA NDs の厚い層を選択する必要があります PDA NDs の粒子の密度が高い場合は、削減期間が長い場合は要件に NPs の大きなサイズが必要な場合。

未反応 [Ag (NH₃)₂] を削除する⁺ NDs の低密度のための精製過程高遠心速度はお勧め。遠心速度は高く短く浄化期間になります、AgNPs のサイズのより良い制御を提供するか。また、超音波は、均一な AgNPs を取得するため不可欠なアプローチです。サンプルは、Ag の前に最初の数分間超音波処理する必要があります [(NH₃)₂]⁺ソリューションが追加されます。

我々 は安易な自己重合 PDA で NDs の表面改質法を示しています。クリックして化学法と比較して、この戦略だけでなく ND カオリンと安定性が向上、また金属ナノ粒子を減らすか、アミノ酸/チオールの添付とリンク、潜在的な後置修飾の反応性プラットフォーム (PDA 層) があります。種。PDA の層の厚さと ND 表面にナノ粒子のサイズは、PDA と Ag を変えることによって変更できます [(NH₃)₂]⁺濃度。彼らは、金ナノ粒子またはその他の貴金属の NPs を減らすためにも使用できます。PDA 化学の多様性と NDs の一意のプロパティを組み合わせることによってこのメソッドは触媒、エネルギー、生物医学分野に ND のアプリケーションを拡張するためにドアを開きます。

Materials

Nanodiamond	FND Biotech, Inc.	brFND-100	dispersed in water, and used without further purification
Dopamine hydrochloride	Sigma	H8502-25G	prepare freshly
Silver Nitrate	Fisher	S181-25
Ammonium Hydroxide	Fisher	A669S-500	highly toxic
Tris Hydrochloride	Fisher	BP153-500
TEM grid carbon film	Ted Pella	01843-F	300 mesh copper