Β アミロイド誘起分光と電子顕微鏡によるフィブリン血栓構造異常の解析

サマリー

フィブリン凝固組織に及ぼす β-アミロイドを分析する個別にまたは組み合わせて使用することができます 2 つの方法は、ここで紹介します。続いて、体外フィブリン血栓を作成する血栓濁度及び走査電子顕微鏡法に含まれている、プロトコルです。

要約

この記事は、体外のフィブリン塊の生成と分光法による β アミロイド (a β) 蛋白が血栓形成と構造に及ぼす影響の分析走査電子顕微鏡 (SEM) の方法を紹介します。アルツハイマー病 (AD) における神経毒性アミロイド凝集体を形成、a β は、フィブリノゲンと対話する示されています。この a β フィブリノーゲン相互作用構造的異常および線溶に強いフィブリン血栓になります。A β によるフィブリン凝固異常などけばけば、AD 病理脳血管側面に貢献するかもしれないまた、炎症だけでなく、脳アミロイドアンギオパチー (CAA)。AD 病理脳血管障害の可能性のある重要な役割を与え、有望な治療上の価値は、抑制したり、a β フィブリノーゲン相互作用を軽減する化合物の開発。どのフィブリンによる血栓形成を簡単かつ体系的に評価する培養方法は、治療化合物の開発の潜在的に有用ツールです。ここに提示すると、a β と β フィブリノーゲンの相互作用阻害剤の効果の解析と同様にフィブリン血栓の生成体外に最適化されたプロトコルです。血栓の濁度測定は急速な再現性の高い、多数 a β フィブリノーゲン阻害剤のスクリーニングを可能にする同時に、複数の条件をテストする使用ことができます。A β による SEM. を使用してフィブリン血栓建築の構造的な異常を改善する能力をこのスクリーニングからヒット化合物をさらに評価できます。これらの最適化されたプロトコルの有効性を TDI-2760、最近同定された a β フィブリノーゲン相互作用阻害剤を使用してここで示します。

概要

アルツハイマー病 (AD)、高齢患者における認知機能の低下につながる神経変性疾患主に起こる異常な β アミロイド (a β) 式、集計および神経毒性^1,の結果障害クリアランスから²。 a β の凝集体と広告³のよ特徴付けられた協会、にもかかわらず病の病理の基礎となる正確なメカニズムの理解⁴ではありません。証拠が増えている神経血管障害が進行と広告⁵の重症度の役割を果たすこと a β は直接循環システム⁶のコンポーネントと対話します。A β フィブリノーゲン^7、は⁸、AD 患者でマウス モデル^9,10,11a β 預金も鈍痛と高親和性の相互作用があります。さらに、線溶^9,12への抵抗と同様、異常なフィブリン血栓形成と構造、a β フィブリノーゲンの相互作用を誘導します。循環障害、a β とフィブリノゲン^13,14間の相互作用を阻害することによって広告の治療 1 つの治療可能性を軽減すること。我々 は、したがって、高スループット スクリーニングと医薬品化学アプローチ^13,14a β フィブリノーゲンの相互作用を阻害するいくつかの小さな化合物を識別されます。A β フィブリノーゲン相互作用阻害剤の有効性をテストするためフィブリン血栓形成の in vitro解析の 2 つの方法を最適化: 濁度分析、走査電子顕微鏡 (SEM)¹⁴を凝固します。

血栓濁度測定は、紫外可視分光法を用いたフィブリン血栓形成を監視するための単純明快かつ迅速な方法です。フォーム、光はますますフィブリン血栓として散らばっているし、ソリューションの濁度を増加させます。逆に、a β が存在する場合フィブリン血栓の構造を変更すると、および混合物の濁度が減少 (図 1)。A β による異常から血栓の濁度を復元する潜在的な阻害物質の影響を評価できます。濁度測定は、複数の条件の迅速分析できますが、塊形状と構造に関する限定的な情報を提供します。血栓^15,16,17,18 3 D アーキテクチャの方法の評価分析を SEM では、電子プローブによってソリッド オブジェクトの形状が明らかになる可能 a β の存在とあるいは阻害化合物は、その構造^9,14を変更します。両方の様々 な目的のために使用されている古典的な実験技術は、SEM 分析法、吸光光度法をアミロイド凝集^19,20を監視に使用するたとえば。同様に、SEM は、またパーキンソン病や血栓塞栓性脳卒中患者^21,22,23アルツハイマー病のプラズマから形成されるフィブリン血栓を分析する使用されます。ここに示すプロトコルは、再現性と迅速な方法でフィブリン血栓形成の評価に最適です。

次のプロトコルは、体外フィブリン-血栓と a β なしの準備のための手順を提供します。また、フィブリン血栓形成と構造の a β の効果を分析する方法の詳細します。TDI-2760、小さな阻害化合物¹⁴を使用して a β フィブリノーゲンの相互作用の阻害を測定するためのこれらの 2 つの方法の有効性を示します。これらのメソッドを個別と一緒はフィブリン血栓形成の in vitroの迅速かつ簡単ですが解析できるように。

プロトコル

1. 分析のため Aβ42 とフィブリノーゲンの準備

1. 凍結乾燥粉末から単量体 Aβ42 を準備します。
   1. 30 1,500 × g で部屋の温度とスピンする Aβ42 パウダーを暖まる s。
   2. Aβ42 粉末 0.5 mg 当たり冷たい hexafluoroisopropanol (HFIP) の 100 μ L を追加し、氷で 30 分間インキュベートします。
      注意: HFIP を処理するときに注意をして、化学のフードのすべての手順を実行します。
   3. 20 μ L の因数と 2-3 h. フィルムの化学フード乾燥フィルム空気は-20 ° C で保存できるようにを準備します。
   4. 室温で 10 分間お風呂超音波発生装置の撹拌によって新鮮なジメチルスルホキシド (DMSO) を 10 μ l 添加の単量体の Aβ42 映画を再構成します。
   5. 50 mM トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン (トリス) バッファー (pH 7.4) の 190 μ L を追加し、そっと上下にピペットします。
   6. 4 ° c 20 分 20,817 × g で遠心分離によるタンパク質凝集体を削除します。
   7. タンパク質凝集体を破棄、さらに一晩、翌日遠心 4 ° C で 20,817 x g で 20 分間の 4 ° C で上清を孵化させなさい。
   8. ビシンコニン酸 (BCA) 法による Aβ42 濃度を測定します。シリアル希薄精製ウシ血清アルブミン (BSA) 1 mg/mL から 0.0625 mg/ml 蛋白質の標準、3 通のウェル プレートの井戸に各標準の 10 μ L を追加します。A β サンプル 1:4 希釈し、3 通の井戸に 10 μ L を追加します。BCA ソリューション A と B を混ぜて、200 μ L を各ウェルに追加します。37 ° C で 30 分間インキュベートし、562 のプレート リーダーで読む nm。氷の上の残りの a β ソリューションを維持し、濁度測定および SEM のためのこの準備を使用
2. フィブリノゲン溶液を調製します。
   1. 15 mL チューブにフィブリノゲンを凍結乾燥粉末の 20 mg を測定し、予め温めておいた 2 mL の 20 mM hydroxyethylpiperazine エタン スルホン酸 (HEPES) バッファー (pH 7.4) を持つ再中断します。
   2. 10 分の 37 ° C の水浴で孵化させなさい。
   3. 0.2 μ m のシリンジ フィルターを通してソリューションをフィルターし、30 分のための 4 ° C で保存します。フィブリノゲン集計を削除する再び 0.1 μ m シリンジ フィルターを通して 4 ° C とフィルターからソリューションを取るまたは既存のフィブリン。
   4. BCA アッセイ フィブリノーゲン濃度を測定します。1.1.8 の手順の指示に従います。4 ° C で残りのフィブリノゲン溶液を維持し、濁度測定および SEM のためのこの準備を使用

2. 血栓濁度測定

1. 96 ウェル プレートの実験も、その最終濃度が 200 μ L バッファーの 3.0 μ M、ステップ 1.1.8 から 30 μ M Aβ42 溶液 20 μ L を追加します。96 ウェル プレートでコントロール井戸をバッファーに 50 mM Tris バッファー (pH 7.4) で 5 %dmso の同じボリュームを追加します。
   注: この手順で Aβ42 の正確な量は重要ではありません。低濃度の準備のために高いボリュームを使用できますと血栓形成バッファーのボリュームを調整することができます。最終巻 200 μ L のままする必要があります。
2. 阻害物質をテストする場合は希釈作業濃度 DMSO への化合物です。追加化合物または DMSO だけで Aβ42 とよく混ぜると井戸を制御するため。
   注: Aβ42 ソリューションだけでなく、化合物の下部に離散液滴を形成する、または DMSO は液滴のセンターに直接戻必要があります。
3. 血栓形成バッファーのステップ 1.2.4 からフィブリノゲン原液を希釈 (20 mM HEPES 緩衝液 (pH 7.4) 5 mM CaCl₂、および 137 mM NaCl) 96 ウェル プレートの Aβ42 を含む、コントロールの井戸に追加。その最終濃度反応容量 200 μ L で 1.5 μ M になるように、フィブリノーゲン溶液の量を調整します。ゆっくりとソリューションをピペットし、泡の形成を避けるため。板振動回転プラットフォーム上で 30 分間室温で孵化させなさい。
   注: フィブリノゲン溶液のボリュームはその在庫の濃度によって異なりますが、各容量も潜伏中 170 μ L をする必要があります。
4. DdH₂O 50 U/mL の原液を作るための商業的精製トロンビン粉末を溶解することにより、トロンビン溶液を準備します。直接使用する前に 20 mM HEPES 緩衝液 (pH 7.4) の 5 U/mL 作業ソリューションに希釈します。
5. インキュベーションの 30 分後に同時にマルチ チャンネル ピペットを使用してステップ 2.3 から 96 ウェル プレートでフィブリノゲン ソリューションにトロンビン溶液 (5 U/mL) を 30 μ L を追加します。トロンビン添加はすぐに血栓形成を開始します。したがって、泡の形成を避けるために注意を払ってのフィブリノゲン溶液のセンターに直接トロンビンを追加します。
   注: トロンビンの活動は、トロンビンの多くと同様に、実験条件によって異なります。確実の塊を生産するために必要な正しい濃度は経験的に定められる必要があります。
6. 体外血栓トロンビン添加の直後プレート リーダーで吸光度をお読みください。350 で吸光度を測定、すべての 30-60 s. 実行室温で全体アッセイの 10 分のコース上の nm。
   注: いくつかの阻害剤の化合物可能性があります変更するソリューション吸光度 350 nm、405 で、ケース、濁度を測定できる nm。

3. 走査電子顕微鏡観察

1. 血栓、固定および洗濯の準備
   1. 場所の清潔さは、鉗子を使用して 12、または 24 ウェル プレートにガラス サークル カバー スライド (12 mm) をケイ化。
   2. 血栓形成バッファー中のフィブリノゲンを準備します。詳細についてはプロトコル手順 1.2 を参照してください。
   3. A β フィブリノーゲン相互作用阻害剤のフィブリン血栓構造に及ぼす影響を評価するには、濁度分析 (ステップ 2) のとおり培養の指示に従います。常に a β と阻害剤の不在中のフィブリノゲンを含む制御井戸があります。
   4. カバー スライド ステップ 3.1.3 からフィブリノーゲン混合物の 80 μ L をピペットします。ソリューションが優しく広がるカバー スライドに均等に分布しています。
   5. トロンビン株式 (50 U/mL) を最終濃度 2.5 U/mL に 20 mM HEPES 緩衝生理食塩水に希釈し、混合せずフィブリノゲン ソリューションの中心に直接 20 μ L を追加します。
      注: 必要な場合、高いトロンビン使用濃度 (5 U/mL) が使用できます。
   6. プラスチック製ふた付け 12 ウェル プレートをカバーし、30-60 分の室温でそれを残します。
   7. 凝固反応が実行されていると、脱水症状や固定のソリューションを準備します。ナトリウム cacodylate バッファー (0.1 M、pH 7.4) を準備します。ナトリウム cacodylate バッファー (0.1 M、pH 7.4) 2% グルタルアルデヒドのソリューションの作業をするために 10% グルタルアルデヒド原液を希釈します。氷の上のすべてのこれらのソリューションをしてください。1 週間以内たて希薄グルタルアルデヒド (2%) を使用する必要があります正しく 4 ° C で冷蔵庫で保存するとき
   8. 無水エタノール (100%) 二重蒸留水 (80%、50%、20% エタノール) で希釈します。これらのエタノール溶液とエタノール (100%) 氷の上にしてください。
      注意: ナトリウム cacodylate とグルタルアルデヒドを処理するときに注意をして、化学のフードでこれらの手順を実行します。
   9. 30 分後 2 回冷たいナトリウム cacodylate バッファー (0.1 M) と血栓は水洗い。血栓が完全に浸漬するよう、各ウェルにバッファーの 2 mL を追加します。ふた付きウェル プレートをカバーし、室温で 2 分間それを残します。2 分後に 1 mL ピペットや狭い幹転送ピペットを使用してバッファーを慎重に取り外します。もう一度繰り返します。
   10. 冷たいグルタルアルデヒド (2%) で、血栓を固定します。ウェル プレート氷の上を維持し、各ウェルに 2% グルタルアルデヒドの約 2-3 mL を追加します。血栓が完全に水中に沈むかどうかを確認します。カバーし、30 分間氷の上プレートを残してください。
   11. 30 分後に優しく各ウェルから、グルタルアルデヒドを削除し、(2分、2 回) 上記のようにナトリウム cacodylate バッファー (0.1 M) を使用して血栓を洗います。氷の上のウェル プレートを保ちます。
2. 血栓と臨界点乾燥のシリアルの脱水
   1. 冷たいエタノールの洗浄ステップ 3.1.8 (20%、50%、80%、100%、again100%) 5 分で準備の一連の階級における血栓を脱水します。エタノール系列ごとに、血栓が水中に沈むことを確かめる 2-3 mL を追加します。カバーし、氷の上を孵化させなさい。
   2. 各エタノール ステップ後エタノール 1 mL ピペットまたは使い捨てピペット スポイトを使用してを削除します。エタノールを完全に削除しないでください。血栓表面は空気に公開されませんを確認します。
      注: 無水エタノール (100%) で脱水を 2 回実行する必要があります。
   3. サンプルの最後の 100% エタノールに浸漬したまま、臨界点乾燥機 (CPD) に転送します。CPD 室にスライドを転送するため、洗濯機で CPD の試料ホルダーまたはカバー スリップ ホルダーを使用します。各スライドの間に少なくとも 1 つの洗濯機を配置します。
   4. CPD 室からカバー スライドを取り出し、カーボン テープを使用して SEM スタブでそれをマウントします。
3. スパッタ コーティングとイメージング
   1. スパッタ コーティング室に SEM の半券の提示ですべてのサンプルを転送します。
   2. スパッタ コート未満 20 nm の金/パラジウムまたは他の導電性材料、真空スパッタ塗布装置による炭素など。
      注: 我々 は 18 を使用している金/パラジウム コーティングの nm。スパッタ コーティングを行った 45 s と塗装速度だった 4 Å/s. スパッタ コーティング サンプルが数週間室温乾燥した環境で正しく保持するとき安定しています。SEM 分析をいつでも実行できます。
   3. 4 SE2 検出器搭載の走査型電子顕微鏡の画像を取得 kV。
      注:この画像でイメージのピクセル サイズは、13 nm 31 nm から範囲を設定します。

結果

体外(濁度) アッセイを凝固、酵素トロンビンは、フィブリノゲン、フィブリン ネットワーク²⁴の形成の結果を裂きます。このフィブリン血栓形成濁り (図 1)、(図 2緑) 読書期間の終わりの前に頭打ちで、その結果、ソリューションを通過する光の散乱が発生します。曲線の約半分の高さの最大値に達すると、溶液の濁度が減少したとき、フィブリノゲンはだった Aβ42 の存在下で培養した、フィブリノゲン単独で (図 2 a、青) のこと。最近の出版物で a β の凝集のブロッカーのシリーズを合成し、複合 TDI 2760¹⁴を識別する a β フィブリノーゲンの相互作用を阻害する能力を評価しました。本研究では a β フィブリノーゲンの対話をブロックする TDI 2760 を使いました。TDI-27...

ディスカッション

ここで説明する方法は、フィブリン血栓形成の in vitro評価の再現性と迅速な手段を提供します。さらに、システムのシンプルさは、フィブリン血栓形成と構造比較的ストレートに a β がどのように影響するかの解釈です。この演習の前の文書で a β フィブリノーゲン相互作用^13,14を禁じる機能のための化合物をテストするこれらの試金を使えることが示されました。これらの 2 つの試金を使用して、合成化合物のシリーズは a β フィブリノーゲンの相互作用を阻害する能力を分析しました。実際には、血栓の濁度測定は、a β フィブリノーゲンの相互作用を阻害することができますすべての化合物は、フィブリン血栓形成を復元することも治療の可能性があるものにヒット化合物のプールを狭く使用できます。

濁度測定のトラブルシューティングが必要な場合がありますまたはこの技術の使用を制限するいくつかの側面があります。主な制限は、実験結果の解釈を複雑にする可能性がありますのいくつかの...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フィブリオゲン、プラスミノーゲン枯渇、プラズマ	EMDミリポア	341578	、湿気への暴露を避けるために蓋のパラフィルムを包み続けます
ベータアミロイド(1-42)、ヒト	アナスペック	AS-20276
血漿からのトロンビン	シグマアルドリッチ	T7009
1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール、99%以上	グマアルドリッチ	105228
ジメチルスルホキシド(DMSO)、滅菌ろ過	Sigma-Aldrich	D2438
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Tris Base	Fischer Scientific	BP152
HEPES	Fischer Scientific	BP310
NaCl	Fischer Scientific	S271
CaCl2	フィッシャーサイエンティフィック	C70
フィルターシリンジ、0.2µM、25mm	ポール	4612
Millex 滅菌シリンジフィルター、0.1 um、PVDF、直径 33 mm	ミリポア	SLVV033RS
ソリッド96ウェルプレート 高結合性認定フラットボトム	フィッシャーサイエンティフィ	21377203
Spectramax Plus384	分子デバイス	89212-396
遠心分離機、5417R	エッペンドルフ	5417R
ブランソン200 超音波洗浄機	フィッシャーサイエンティフィック	15-337-22
ラボローテーター	Thermo Scientific	2314-1CEQ
カバースリップホルダー用スペアワッシャー	Tousimis	8766-01
ナローステムピペット - Sedi-Pet	電子顕微鏡科学 (EMS)	70967-13
CPD用サンプルホルダー (カバースリップホルダー)	Tousimis	8766
マウントホルダーボックス、ピン型	電子顕微鏡科学 (EMS)	76610
丸型ガラスカバースライド(12 mm)	Hampton Research	HR3-277
10% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences (EMS)	16120
Ethanol	Decon Labs	11652
24 well plate	Falcon	3047
Na Cacodylate	Electron Microscopy Sciences (EMS)	11652
SEMスタブ、テーパーエンドピン。	電子顕微鏡科学(EMS)	75192
PELCOタブ、カーボン導電性タブ、12mm OD	Ted Pella	16084-1
Autosamdri-815 クリティカルポイントドライヤー	Tousimis
Denton Desk IV 金/パラジウムターゲット付きコーター	Denton Vacuum
Leo 1550 FE-SEM	Carl Zeiss
Smart SEMソフトウェア	カールツァイス