方法論記事

X 線マイクロ断層レントゲン写真撮影に基づいてトウモロコシの維管束のミクロン スケール表現型解析技術

DOI：

10.3791/58501

⸱

2018年10月9日

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1Beijing Key Lab of Digital Plant, Beijing Research Center for Information Technology in Agriculture, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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普通マイクロ断層レントゲン写真撮影スキャンに適したトウモロコシ組織の x 線吸収コントラストを改善する新たな方法を提供します。CT 画像を用いた異材トウモロコシ トウモロコシの維管束の微細な表現を効果的に抽出するための画像処理ワークフローのセットを紹介します。

要約

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高速画像解析手法に基づくトウモロコシ材料の解剖学的構造を正確に定量化する必要は。ここでは、普通のマイクロ マイクロ CT 検査のスキャンに適したトウモロコシ材料 (すなわち幹、葉および根) の 'サンプル準備のプロトコル' を提供します。トウモロコシの茎、葉および根の高解像度の CT 画像を基に、維管束の表現型解析のための 2 つのプロトコルについて述べる: (1) 31 を自動的に抽出する特定のイメージ解析パイプライン開発したトウモロコシの茎と葉の CT 画像を用いた、・維管束の分化形質を 33(グリシンリッチプロテイン、ボリュームなどの 3-D 形質表面積とグリシンリッチプロテイン、三次元 (3 D) のセグメンテーションのための画像処理手法を設定し、2 次元 (2 D) を抽出 2) トウモロコシ根の CT 画像のシリーズに基づいて、などトウモロコシ材料の維管束の伝統的な手動測定と比べると、提案プロトコルでは効率とミクロン スケール表現型定量の精度大幅向上します。

概要

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トウモロコシの維管束系を通るルートと水と無機成分と有機物1を提供するため主要な輸送経路を形成する葉を茎から、全体の植物。血管系のもう一つの重要な機能は、トウモロコシの葉の機械サポートを提供することです。たとえば、形態、数、根や茎の維管束の分布はトウモロコシ2,3の耐倒伏性に密接に関連します。現時点では、維管束の解剖学的構造の研究主に茎、葉、またはルートの特定の部分の解剖学的構造を表示する微視的・極微の技術を活用し測定し、カウントのこれらの構造手動調査の関心。確かに、大規模な microimages の様々 な微細構造の手動測定が非常に面倒で非効率的な作業とその主観と矛盾4のための microphenotypic 特性の精度が大幅に制限 5。

トウモロコシに二次成長がなく、セルの内容は基本的に一次分裂組織の水ので構成されています。任意の前処理なしトウモロコシ組織の新鮮なサンプル直接マイクロ CT 装置を使用してスキャンすることができます。ただし、スキャンの結果は、おそらく貧しいとラフです。主な理由は次のとおり: (1) 低減衰原子番号とイメージで高いノイズの低コントラストをもたらす植物組織の密度(2) 新鮮な植物材料は、Du6によって報告されたが脱水し、通常のスキャン環境中に縮小傾向があります。上記問題開発とトウモロコシ、ムギ、米および他の単子葉植物の microphenotyping 技術のアプリケーションの主な制約となっています。'サンプル準備のプロトコル' を紹介ここでは、トウモロコシの茎、葉および根のサンプルを前処理します。このプロトコルは脱水と CT スキャンの中に植物材料の変形を回避できます。したがって、nondeformation による植物試料の保存時間を増やすに有益です。さらに、固体ヨウ素に基づく染色の手順はまた植物材料のコントラストを強調します。従って、それはマイクロ ct 画像の品質で大幅な改善を作るさらに、という名前の VesselParser、トウモロコシの茎や葉の CT 画像を処理する画像処理ソフトウェアを開発しました。このソフトウェアは、異なる植物組織の CT 画像を 2 D の高スループットと自動フェノタイピング分析を実行する画像処理パイプラインのセットを統合します。トウモロコシの茎や葉の全体の断面における維管束が検出され、抽出、画像処理手法を使用して識別されます。その結果、我々 はトウモロコシの茎における微視的表現型 31 とトウモロコシの葉の微細な表現型 33 を取得します。トウモロコシの根の CT 画像シリーズ、グリシンリッチプロテインの 3次元の形質を獲得する画像処理方式を開発しました。この方式は、画像の取得と従来の方法と比較して復興の効率に優れています。

これらの結果は普通 x 線マイクロ CT の撮像特性を維管束の微細な表現の有効な手段を考慮したパイプラインの処理イメージを示すこれは非常に植物科学 CT 技術の応用を広げ、細胞分解能6,7で植物材料の自動の表現を向上します。

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プロトコル

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1. サンプル準備のプロトコル

  1. サンプリング、幹、葉、収集し新鮮なトウモロコシからルートし、サンプル グループ (各 4) の 3 種類に分けます。その後、外科ブレードを使用して次のように小さなセグメントにそれらをカット: (1) カット、中間のセグメントの茎の節間 1 〜 1.5 cm の長さ;(2) 葉 0.5 - 主な静脈; を縦方向に長さ 3 cm 最大幅のセグメントをカットします。(3) 長さ 0.5 cm の根のセグメントにカットします。
  2. FAA 固定のため少なくとも 3 d のため、FAA のソリューション (90:5:5 v/v/v、70% エタノール: 100% ホルムアルデヒド: 100% 酢酸) でセグメントのサンプルを浸します。
  3. 6 連続エタノール グラデーション (すなわち30%、50%、70%、85%、95%、100%) の退避手順を実行し、30 分として各エタノール グラデーションの処理時間を設定します。
  4. 3 D プリンターを使用して製造された対応するサンプル バスケットの植物素材を配置します。その後、CO2臨界点乾燥システムのサンプル セルにサンプル バスケットをすばやく転送します。乾燥パラメーターを次のように設定します。
    (CO 1)2 : 速い速度。ホルダー フィラー: 100%。
    (2) 担当: CO2料金遅延 120 のサイクルに。交換速度: 5 します。 サイクル番号: 12。
    (ガス 3): 高速熱します。速度: 遅い 50%。
    1. トウモロコシ根の形態の違いによると、茎し、葉、(例えば図 1) 3次元プリンターを使用してデザインと印刷のサンプル バスケット。
  5. 揮発性ヨウ素蒸気の植物材料を染めるし、その後、遮光ルーム 4-5 h 用チューブを配置する固体ヨウ素の 2 g を 50 mL の遠心管に乾燥植物材料 (トウモロコシ根や茎、葉) を配置します。

2. マイクロ CT スキャン プロトコル

  1. 生の CT データをスキャンする設定パラメーターを次のように走査型 CT: (茎、葉) 40 kV/250 μ A または (ルート) のための 34 の kV/210 μ A。対応範囲のサイズが異なると使用される植物材料のボリュームをスキャンして設定し、次のように画像のピクセル サイズを調整する: (トウモロコシの根) の 2.0 μ m、(トウモロコシ茎) の 6.77 μ m、(トウモロコシの葉) の 10.0 μ m。
  2. スライス画像を再構成するには、画像再構築ソフトウェアを使用して 2 K の解像度 (2,000 × 2,000 ピクセル) の CT スライス画像に raw CT データを変換します。詳細については、NRecon ユーザー マニュアル (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf) で提供されます。

トウモロコシの茎や葉のシングル CT 画像の画像の分析のプロトコル

注: は、トウモロコシの茎や葉は (図 2) の ct スライス内の維管束の表現分析を実施するのに維管束の自動イメージング ソフトウェアを使用します。ソフトウェアの使用手順は次のとおりです。

  1. 異なるアルゴリズムのパイプラインを初期化するオルガン型を任命します。メソッドのパラメーター ] ボタンをクリックし、最初のドロップ ダウン ボックスでトウモロコシ茎やトウモロコシの葉を選択します。
  2. 画像をインポートするには、データ管理ボタンをクリックして作業ディレクトリを設定し、自動的にこのディレクトリ内のすべてのスライス画像をインポートします。画像のパイプラインにシングルまたはマルチ スライス画像を選択します。
  3. 画像の実際のピクセルのサイズを決定します。メソッドのパラメーターをクリックし、ピクセル サイズの編集項目の画像の実際のピクセル サイズを入力します。
  4. 表現型解析の計算ですべての選択したスライス画像の維管束の分化形質を自動的に抽出する表現型解析計算ボタンをクリックします。
  5. Txt ファイルや CSV ファイル形式として結果を出力する統計量の分析ボタンをクリックします。

4 トウモロコシ根の CT 画像シリーズ イメージ分析のプロトコル

注: トウモロコシ根の CT 画像のシリーズ グリシンリッチプロテイン画像処理ソフトウェアを使用しての 3次元構造の抽出に利用されています。主な手順は次のとおりです。

  1. トウモロコシの根 (BMP ファイル形式) に再建されたイメージをインポートし、正確な間隔パラメーター ([すなわちx、y、z] ボクセルの大きさ) を決定します。再帰的なガウス ツールを使用して、画像の品質を改善するためにこれらの画像を滑らかにします。
  2. しきい値パラメーターを調整することによってグリシンリッチプロテインの 3次元領域の分割を行うこれは各接続の metaxylem 容器の均一色ラベルを生成します。
  3. 改善し、対話をビットごと、形態、使用してグリシンリッチプロテインと洪水塗りつぶし操作を識別します。
  4. 血管ボリューム可視化と表面再構成を行います。マスクの統計ツールを使用して、2 D と 3 D のレベルで容器の形質を測る。

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結果

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普通マイクロ CT スキャンに適したサンプル準備のプロトコルは、植物組織の変形を防ぐだけでなく、また x 線吸収コントラストを高めます。高品質スライス画像にマイクロ CT を用いた前処理プラント材料がスキャンされ、最高の解像度は、2 μ m/ピクセルを達することができます。図 4は、幹、葉、根、スキャンしたマイクロ CT 画像を示しています、画像のコントラストが新鮮な植物材料からスキャン結果と比較して有意な改善。これらの CT スライス画像の濃淡値に有意差は維管束、柔細胞、導管、表皮、および他の組織の中で注目すべきです。

維管束のこのイメージング ソフトウェアに基づいて、全体の茎や葉の断面内の維管束の分布と構造機能自動的に解析でき定量化します。例として、トウモロコシの茎のイメージを取るし、ソフトウェアの表現型解析アルゴリズムは、5 つのステップで構成されています: スライス画像をセグメント、セ...

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ディスカッション

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この技術生物医学、材料科学の分野で CT 技術の成功のアプリケーション、植物や有望な技術ツールとして植物生命科学研究を推進して、農業の分野に徐々 に導入されています。.1990 年代後半の CT の技術は形態学的構造と植物根系発達の勉強を初めて使われました。過去 10 年間でシンクロトロン HRCT 植物生物学の強力な非破壊のツールとなっている、ブドウの血管システム8の組織構造、シロイヌナズナ葉9の組織構造を識別するために使用されています,10、およびレイプ11の種子構造。シンクロトロン HRCT による構造の研究と維管束植物12,13,14の機能の大きな進歩をしました。ただし、トウモロコシ、小麦、米および他の穀物の HRC...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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この研究は、国家自然科学基金、中国の (No.31671577)、科学と技術革新特別建設資金を供給されたプログラムの北京アカデミーの農業と林業 Sciences(KJCX20180423)、研究によって支えられました。ポスドクの北京、北京自然科学基金 (5174033) 中国 (2016YFD0300605-01) の開発プログラム研究財団 (2016 ZZ-66) と北京アカデミー農業と林業科学研究補助金 (KJCX20170404) (JNKYT201604)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Skyscan 1172 X線コンピュータ断層撮影システムブルカーコーポレーション、ベルギーNACTスキャン用
CO2臨界点乾燥システム (ライカCPD300)ライカコーポレーション、ドイツNA サンプル乾燥用
エタノールAnyNAFAA固定用
ホルムアルデヒドAnyNAFAA固定用
酢酸酸任意のNAFAA固定用
外科用ブレード任意のNAサンプルの切断用
3DプリンターMakerbot replicator 2, MakerBot Industries, USANAトウモロコシの根、茎、葉のサンプルバスケットの印刷用
遠心分離管コーニング、USANA根、茎、葉の材料を置く
固体ヨウ素AnyNAサンプル染色用
SkyScan NreconソフトウェアSkyScan NRecon、バージョン:1.6.9.4、ブルカーコーポレーション、ベルギーNA画像再構成
用VesselParserソフトウェアVesselParser、バージョン:3.0、農業情報技術のための国立工学研究センター(NERCITA)、北京、中国NAトウモロコシの茎または葉の単一CT画像のための画像解析プロトコル
ScanIPScanIP、バージョン:7.0;Simpleware, Exeter, UKNA3D画像処理ソフトウェア
ラテックス手袋AnyNA
ピンセットAnyNA

参考文献

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