Method Article

発展途上ひよこ視蓋接線細胞移動の可視化

DOI:

10.3791/58506

⸱

October 24th, 2018

 ,  , 
1Department of Neuroanatomy and Embryology, School of Medicine, Fukushima Medical University

In This Article

Summary

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接線方向の移行の蛍光標識法について述べるエレクトロポレーション、および移行を視覚化するためにフラット マウント文化のラベルの付いたセルの動きのタイムラプス イメージング用セル セル開発ひよこ視蓋動作.

Abstract

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タイムラプス イメージングは、移行細胞の挙動を分析する強力な方法です。蛍光細胞ラベリング後、ビデオ顕微鏡下文化の標識細胞の動きを記録できます。発展途上の脳細胞の移動を分析するためスライス培養、細胞遊走の放射状の細胞遊走などのスライス セクションに平行を観察する使用されます。しかし、限られた情報は、接線方向の細胞遊走などのスライス セクションに垂直セル移行を分析するスライス培養法から入手できます。ここでは、発展途上のひよこ視蓋接線細胞遊走を視覚化する時間経過イメージ投射のためのプロトコルを提案する.Ovo でエレクトロポレーションと細胞培養チップの後フラット マウント文化によって分類するセルの組み合わせにより、水平面内移行細胞運動の検出です。また、本手法は個々 のセルの動作と長期的に細胞のグループの集団行動の両方の検出を容易します。このメソッドは、蛍光マイクロ構造の非神経組織神経のティッシュか細胞の変位で軸索の伸長を含む連続した変化を検出する可能性があります適用ことができます。

Introduction

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ライブ イメージングの進歩技術と細胞移動の研究が進み。蛍光細胞ラベリング後、ビデオ顕微鏡下で培養皿や生体内での標識細胞の時間的な動きを記録できます。神経系の発達の研究では、タイムラプス イメージングを用いた移行細胞または軸索伸長の形態学的変化を分析されてが。効果的なイメージング実験と解析の目的に基づく蛍光細胞ラベリングと組織の準備のための適切な方法を適用が欠かせません。発展途上の脳細胞の移動を分析するため細胞遊走細胞径移行1,2,3などのスライス セクションに平行を観察するスライス培養によく使用されています。スライス培養系も接線方向セル移行4,5の検出用、セルがスライス セクションに垂直を分散の場合指向性分析のため適していません。

視蓋は萌芽期の開発中に放射状および接した細胞移行によって形成された、多層構造で構成されます。蓋層形成心室の地帯から後の神経前駆細胞の放射状移動に主に左右心室ゾーン6生年と相関する層の彼らの最終目的地。接線方向の移動に関しては以前に発展途上のひよこ視蓋の真ん中と表面的な層の移行の 2 ....

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Protocol

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1。Ovo でエレクトロポレーション

  1. 高濃度で蛍光ラベリングの発現プラスミド DNA を準備します。製造元のプロトコル (材料表) によると陰イオン交換カラムを用いたアルカリ溶解法による細菌培養の 200 mL から DNA を隔離します。PCAGGS EGFP と pCAGGS-mCherryNuc 4 μ g/μ l 各最終濃度で混ぜます。
    注: プラスミド DNA 精製のエンドトキシンはエレクトロポレーションの最寄りにあります。
  2. 38 ° C 相対湿度 70% で水平方向に肥沃な鶏の卵を孵化させなさい。
  3. 2.5 日後 18 ゲージ針で 20 mL の注射器を使用して、卵の尖った側から卵白 (卵白) 5 mL を排除し、テープで針穴をシールします。
  4. 直径 2 cm の穴を開く (ハンバーガーとハミルトンの9のステージ 17) 実体顕微鏡下で胚の発育段階をチェックして曲線はさみで卵の殻の上部をカットします。もう一度テープで穴を塞ぐ。
    注: この手順は、E2.5 E3.0 中にいつでも実行できます。1.3 と 1.4 の手順は、トップのシェルに成長する胎児の血管タイトな添付ファイルを避けるために卵の胚のレベルを下げます。
  5. E5.5 まで潜伏を続けてください。
  6. エレクトロポレーション、前に述べられたプラス....

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Results

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図 2は、記録の発症後経過時間 (0、9、18、27 h) でフラット マウント文化で可視化された表面的な接線方向の移動を示します。映画1は 28 時間 50 分の間 10 分間隔のインターバル撮影ムービーです。フレームは、フレームのラベル左下隅からラベルのない領域 (図 3 a) 移行の細胞に焦点を当てに対して選択されます。移行細胞 (GFP; 上部左側のパネル、映画 1) の質量の運動 (mCherry Nuc; 右上のパネル)、原子核を結合されたムービー (下のパネル、映画 1) で観察できるし、。細胞移動の方向性は、ラベル センターからすべての方向 (映画 2

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Discussion

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上記で説明したプロトコルは、浅層6,8で細胞の移動を検出に最適です。エレクトロポレーション (E4.5、E5.5) のタイミングと文化の始まりをシフト イメージング (E6.0 に E7.0) だけで中間層の移行ストリーム (映画 5)6、7を検出が可能です。

提示された手順ovo でエレクトロポレーション、フラット マウント文化とタイムラプス顕微鏡を用いたイメージング (図 1) によって分類するセルで構成されます。まず第一に、健康と通常として生体内で成長して、組織を維持する培養条件を最適化するべきであることの前提条件です。また、ティッシュの向きは細胞遊走の検出に適していることを確認する.......

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Disclosures

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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、日本学術振興会科研費助成数によって支えられた Y.W. に 15 K 06740

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EFMACHEREY-NAGEL740422.5エンドトキシンフリープラスミドDNA精製キット
20mlシリンジテルモSS-20ESZ
18ゲージ針テルモNN-1838R
ファストグリーン和光061-00031
100xペニシリンとストレプトマイシンGibco15140-122
ガラス毛細管成重G-1
細胞培養インサートミリポアミリセル CM-ORG
ラミニンSIGMA L2020培養インサート
ポリ-L-リジンペプチド研究所3075培養インサート
ガラス底皿松波D11130H
Opti-MEMGibco31985-070培地
F12Gibco11765-054培地
ウシ胎児血清Gibco12483培地
ひよこ血清Gibco16110082培地
10xHBSSGibco14065-056
マイクロサージェリーナイフ外科専門協力72-1501
名企業名カタログ番号コメント
Equipment
湾曲ハサミAS ONENo.11
マイクロピペットプロセッサーSUTTER INSTRUMENTP97/IVF
鉗子型電極BEXLF646P3x3
パルス発生器BEXCUY21EXエレクトロポレーター
蛍光顕微鏡ライカMZ16F
倒立型蛍光顕微鏡オリンパスIX81
ガスコントローラートッケンMIGM/OL-2
温度調節器東海ヒットMI-IBC
レーザー共焦点ユニットオリンパスFV300
のコーティング

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
  2. Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time ima....

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