接線方向の移行の蛍光標識法について述べるエレクトロポレーション、および移行を視覚化するためにフラット マウント文化のラベルの付いたセルの動きのタイムラプス イメージング用セル セル開発ひよこ視蓋動作.
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この記事について
サマリー
要約
タイムラプス イメージングは、移行細胞の挙動を分析する強力な方法です。蛍光細胞ラベリング後、ビデオ顕微鏡下文化の標識細胞の動きを記録できます。発展途上の脳細胞の移動を分析するためスライス培養、細胞遊走の放射状の細胞遊走などのスライス セクションに平行を観察する使用されます。しかし、限られた情報は、接線方向の細胞遊走などのスライス セクションに垂直セル移行を分析するスライス培養法から入手できます。ここでは、発展途上のひよこ視蓋接線細胞遊走を視覚化する時間経過イメージ投射のためのプロトコルを提案する.Ovo でエレクトロポレーションと細胞培養チップの後フラット マウント文化によって分類するセルの組み合わせにより、水平面内移行細胞運動の検出です。また、本手法は個々 のセルの動作と長期的に細胞のグループの集団行動の両方の検出を容易します。このメソッドは、蛍光マイクロ構造の非神経組織神経のティッシュか細胞の変位で軸索の伸長を含む連続した変化を検出する可能性があります適用ことができます。
概要
ライブ イメージングの進歩技術と細胞移動の研究が進み。蛍光細胞ラベリング後、ビデオ顕微鏡下で培養皿や生体内での標識細胞の時間的な動きを記録できます。神経系の発達の研究では、タイムラプス イメージングを用いた移行細胞または軸索伸長の形態学的変化を分析されてが。効果的なイメージング実験と解析の目的に基づく蛍光細胞ラベリングと組織の準備のための適切な方法を適用が欠かせません。発展途上の脳細胞の移動を分析するため細胞遊走細胞径移行1,2,3などのスライス セクションに平行を観察するスライス培養によく使用されています。スライス培養系も接線方向セル移行4,5の検出用、セルがスライス セクションに垂直を分散の場合指向性分析のため適していません。
視蓋は萌芽期の開発中に放射状および接した細胞移行によって形成された、多層構造で構成されます。蓋層形成心室の地帯から後の神経前駆細胞の放射状移動に主に左右心室ゾーン6生年と相関する層の彼らの最終目的地。接線方向の移動に関しては以前に発展途上のひよこ視蓋の真ん中と表面的な層の移行の 2 つのストリームを報告しました。E6 E8 の中に中間層で長い主要なプロセスと薄い後続プロセスと双極細胞は、7を実行する背腹側蓋の遠心性軸索軸索束に沿って背側または腹側を移行します。この axophilic 移行後、細胞は深い層にある多極神経細胞に分化します。E7 E14 中に表層で移行するセルは複数方向8分岐リード処理および散布を改質による水平方向に分散します。移行を分散後に、後者のセルは、最終的に様々 な形態の表面的なニューロンに分化します。両方のケースでは、フラット マウント文化は軟膜表面に平行細胞運動を観察するが効率的です。
ここでは、発展途上のひよここま7,8で接線方向細胞遊走を視覚化する時間経過イメージ投射のためのプロトコルを提案する.Ovoエレクトロポレーションと携帯文化にその後フラット マウント文化によって分類するセルの組み合わせにより、移行細胞の移動および移行の方向の検出です。このメソッドの目的は、長期と水平面内のセルのグループの集団行動の両方の個々 のセル動作の検出を容易にすることです。
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プロトコル
1。Ovo でエレクトロポレーション
- 高濃度で蛍光ラベリングの発現プラスミド DNA を準備します。製造元のプロトコル (材料表) によると陰イオン交換カラムを用いたアルカリ溶解法による細菌培養の 200 mL から DNA を隔離します。PCAGGS EGFP と pCAGGS-mCherryNuc 4 μ g/μ l 各最終濃度で混ぜます。
注: プラスミド DNA 精製のエンドトキシンはエレクトロポレーションの最寄りにあります。 - 38 ° C 相対湿度 70% で水平方向に肥沃な鶏の卵を孵化させなさい。
- 2.5 日後 18 ゲージ針で 20 mL の注射器を使用して、卵の尖った側から卵白 (卵白) 5 mL を排除し、テープで針穴をシールします。
- 直径 2 cm の穴を開く (ハンバーガーとハミルトンの9のステージ 17) 実体顕微鏡下で胚の発育段階をチェックして曲線はさみで卵の殻の上部をカットします。もう一度テープで穴を塞ぐ。
注: この手順は、E2.5 E3.0 中にいつでも実行できます。1.3 と 1.4 の手順は、トップのシェルに成長する胎児の血管タイトな添付ファイルを避けるために卵の胚のレベルを下げます。 - E5.5 まで潜伏を続けてください。
- エレクトロポレーション、前に述べられたプラスミド DNA の色付きの高速グリーン (25 mg/mL)、0.5 μ 10 mL をオートクレーブ処理したリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (100 単位/ml) ペニシリンとストレプトマイシン (100 μ g/mL)、製マイクロ ピペットを含む 10 μ L を準備します。ガラス毛細管ピペット プロセッサを使用します。注射用 DNA の量によって孔の適切なサイズを作るにピペットの先端をカットします。
- 穴径 2.5 cm を再び開いて、安定したステレオの顕微鏡の下で卵を設定にハサミでシールのトップのシェルをカットします。卵に PBS を数滴を追加します。2 つの微細鉗子を用いた出血せず、胚を覆う尿膜をはがします。胚の頭から、羊膜を削除します。
- Microspatula で頭を回しながら注入 0.1-1 μ L マイクロ ピペットを使用して左の視蓋の心室に着色された DNA の吸引管に接続されています。
注: DNA の注入量は、実験の目的によって異なります。DNA 溶液をシンク、心室の壁に沿って取り付けます。 - 光 tectumis のターゲット領域 (図 1、ステップ 1) の間に配置されるように鉗子型電極 (7 mm と 3 mm 正方形電極) のペアを配置します。
注: DNA は陽極側に electroporated です。 - 30 V の前のパルス、1 ms の 5 ms 間隔と 6 V の 4 つ後のパルス、パルス発生器を使用する 10 ms 間隔で 5 ms を充電します。
注: 電子の状態は、電極の距離とサイズに依存します。効率的な遺伝子導入を達成するために十分に強いべきであることが、それは標的組織の正常な発達を保証するために十分な謙虚でなければなりません。 - 穴をテープでふさぐし、潜伏を続けます。プラスチックの皿に歯間ブラシで卵白を削除する PBS で電極を浸します。それぞれの卵に 1.7 1.11 を繰り返します。
2. フラット マウント文化セルの挿入
- フラット マウント文化前日準備被覆細胞文化挿入。10 cm の細胞培養皿で蒸留水をフロートいくつかの細胞培養は、オートクレーブに挿入します。8 μ G/ml ラミニンと 80 μ g/mL ポリ-L-リジン挿入をカバーし、37 ° C でセル文化 CO2インキュベーターで一晩フロート挿入のままのソリューションを読み込みます。
注: 次の日にコーティングされた挿入格納できる 4 ° C で - E7.0 で文化の日、挿入からラミニン ポリ-L-リジンのソリューションを削除し、1.1 ml 培養液 (60% 減少血清中、20 %10 10% 牛胎児血清、f12 キーのガラス底皿 (図 1の手順 2) に挿入を置きます50 単位/mL ペニシリン、50 μ g/mL ストレプトマイシン % ニワトリ血清)。37 ° C でセル文化 CO2インキュベーターで皿を保つ
注: 媒体を変更することがなく 3 日間の培養期間中使用できます。 - 文化のセットアップを準備します。40% O2と 5% CO2 (ガス コント ローラー) 38 ° C (温度コント ローラー) でのガス流れと倒立顕微鏡に湿気の多い室内ユニットを設定します。
- 胎児の頭をハサミでカットします。冷たいハンクス平衡塩類溶液 (HBSS) 6 cm 細胞培養皿の中に鉗子を頭をつまみます。
- 2 つの微細鉗子を用いた electroporated 視蓋を分離します。冷たい HBSS でいっぱい別皿にプラスチック スポイトを蓋を転送します。切断のための受け皿としてブラック シリコンによる凹面ガラスの皿を使用します。
- 蛍光実体顕微鏡下でラベルの位置を確認します。蓋組織の顕微鏡下のナイフでラベルの領域を周囲をカットします。組織の方向性の確認蓋 (前方-後方、背腹軸) します。
- ぴあ側が挿入に接続されるので挿入するプラスチック スポイトがラベルの付いたティッシュを転送します。目的の方向に蓋組織を置き、余分な HBSS (図 1、手順 2) を取り外します。
- 同じ他の組織を準備するために 2.4 2.7 挿入を繰り返します。倒立の共焦点顕微鏡 (図 1、手順 3) に prewarmed の商工会議所に料理を配置します。
3. タイムラプス イメージング
- 蛍光ラベルをチェックし、倒立顕微鏡でミクロな場に焦点を当てます。レーザー共焦点ユニットを起動し、フィールドに X および y 軸に沿って組織の位置や方向を調整する共焦点スキャンをサンプリングしようとします。10 X または浸漬油なし 20 × 対物レンズ使用します。
- スキャン サイズを選択 (例えば512 x 512 dpi)。間隔および z 軸に沿って共焦点スキャンの全範囲を決定します。100 μ m の範囲の 5 〜 10 μ m の間隔を取る。共焦点レーザー顕微鏡とイメージングの期間 (例えば、 10 分間隔 48 時間以上) 合計の時間間隔を決定します。
注: レーザー光毒性を避けるためには、高スキャン サイズ長い z 範囲の z - 間隔が短いまたは長いイメージング期間中に短い時間間隔でのスキャンを禁止します。たとえば、高スキャン サイズ (1024 x 1024 dpiなど) を適用すると、z 軸に沿ってスキャンの数を減らします。 - セット共焦点実行中のパラメーターは、プログラムに記載されている 3.2 とイメージングを開始します。
- イメージング後、すべての時点で焦点微調整で z のイメージを提供する別の z 軸の共焦点画像を組み合わせます。
- 異なる時点で z の画像を追加し、AVI 形式でコマ撮りムービーを作成します。
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結果
図 2は、記録の発症後経過時間 (0、9、18、27 h) でフラット マウント文化で可視化された表面的な接線方向の移動を示します。映画1は 28 時間 50 分の間 10 分間隔のインターバル撮影ムービーです。フレームは、フレームのラベル左下隅からラベルのない領域 (図 3 a) 移行の細胞に焦点を当てに対して選択されます。移行細胞 (GFP; 上部左側のパネル、映画 1) の質量の運動 (mCherry Nuc; 右上のパネル)、原子核を結合されたムービー (下のパネル、映画 1) で観察できるし、。細胞移動の方向性は、ラベル センターからすべての方向 (映画 2
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ディスカッション
上記で説明したプロトコルは、浅層6,8で細胞の移動を検出に最適です。エレクトロポレーション (E4.5、E5.5) のタイミングと文化の始まりをシフト イメージング (E6.0 に E7.0) だけで中間層の移行ストリーム (映画 5)6、7を検出が可能です。
提示された手順ovo でエレクトロポレーション、フラット マウント文化とタイムラプス顕微鏡を用いたイメージング (図 1) によって分類するセルで構成されます。まず第一に、健康と通常として生体内で成長して、組織を維持する培養条件を最適化するべきであることの前提条件です。また、ティッシュの向きは細胞遊走の検出に適していることを確認する...
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開示事項
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
謝辞
この作品は、日本学術振興会科研費助成数によって支えられた Y.W. に 15 K 06740
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | エンドトキシンフリープラスミドDNA精製キット |
| 20mlシリンジ | テルモ | SS-20ESZ | |
| 18ゲージ針 | テルモ | NN-1838R | |
| ファストグリーン | 和光 | 061-00031 | |
| 100xペニシリンとストレプトマイシン | Gibco | 15140-122 | |
| ガラス毛細管 | 成重 | G-1 | |
| 細胞培養インサート | ミリポア | ミリセル CM-ORG | |
| ラミニン | SIGMA L2020 | 培養インサート | |
| ポリ-L-リジン | ペプチド研究所 | 3075 | 培養インサート |
| ガラス底皿 | 松波 | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 培地 |
| F12 | Gibco | 11765-054 | 培地 |
| ウシ胎児血清 | Gibco | 12483 | 培地 |
| ひよこ血清 | Gibco | 16110082 | 培地 |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| マイクロサージェリーナイフ | 外科専門協力 | 72-1501 | |
| 名 | 企業名 | カタログ番号 | コメント |
| Equipment | |||
| 湾曲ハサミ | AS ONE | No.11 | |
| マイクロピペットプロセッサー | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| 鉗子型電極 | BEX | LF646P3x3 | |
| パルス発生器 | BEX | CUY21EX | エレクトロポレーター |
| 蛍光顕微鏡 | ライカ | MZ16F | |
| 倒立型蛍光顕微鏡 | オリンパス | IX81 | |
| ガスコントローラー | トッケン | MIGM/OL-2 | |
| 温度調節器 | 東海ヒット | MI-IBC | |
| レーザー共焦点ユニット | オリンパス | FV300 |
参考文献
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
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- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
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