方法論記事

NETQUANTを用いた好中球細胞トラップの自動画像ベース定量

DOI：

10.3791/58528

⸱

2019年11月27日

 , 
1Department of Clinical Sciences, Division of Infection Medicine, Lund University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、好中球細胞外トラップ(NET)を生成し、NETQUANTを動作させるプロトコルを提示し、免疫蛍光画像におけるNETの定量のための全自動ソフトウェアオプションを提示する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

好中球細胞外トラップ(NET)は、DNAおよび顆粒由来抗菌タンパク質からなるウェブ様抗菌構造である。免疫蛍光顕微鏡および画像ベースの定量方法は、好中球細胞外トラップ形成を定量するための重要なツールを残しています。ただし、NET の定量に現在使用できる免疫蛍光ベースの方法には、主な制限があります。イメージ ベースの NET 定量化の手動方法は、多くの場合、主観的で、エラーが発生しやすく、ユーザー、特に経験の浅いユーザーにとっては面倒です。また、定量化のための現在利用可能なソフトウェアオプションは、半自動または操作前にトレーニングが必要です。ここでは、NETQUANTと呼ばれるNET形成を評価するための自動免疫蛍光ベースの画像定量法の実装を示す。ソフトウェアは使いやすく、ユーザーフレンドリーなグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)を持っています。表面積やDNA:NETマーカータンパク質比の増加、核変形など生物学的に関連するパラメータを考慮してNET形成を定義します。さらに、このツールは自由に利用できるアプリとして構築され、単一セル分解能の定量化と分析を可能にします。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

好中球は、多種多様な微生物病原体1に対する先天的な宿主防御応答の重要なメディエーターである。彼らは、抗菌タンパク質2の広い配列を含む顆粒を放出することによって、その抗菌機能を実行し、活性酸素種(ROS)および次亜塩素酸塩1を産生し、食細胞症3を介して生じる。また、ブリンクマンら4は、好中球が侵入病原体を捕捉し排除する新しいメカニズムとして好中球細胞外トラップ(NETs)を記載した。彼らの発見は10年以上前4年に以来、NETは感染性5、6および非感染性7罹患率の多種多様に関与してきた。NET形成は活性プロセスであり、顆粒由来抗菌タンパク質8で被覆されたクロマチンDNAの押出をもたらす。NET形成に関連する細胞および核形態の主要な変化のいくつかは、核形態の喪失、クロマチン縮合、細胞質から核への顆粒タンパク質の動員および核および細胞直径の増加を含む。

ウェブ様NETは、細胞よりもわずかに大きい拡散構造として、または単一の好中球よりも数倍大きい構造として見えることがあり、NETosis5、10の指標と考えられる。蛍光顕微鏡を用いて、4',6-ジアミディノ-2-フェニルリンドール(DAPI)などの蛍光プローブでDNAを探査し、好中球エラスターゼなどのNET結合タンパク質に対する免疫蛍光染色によりNETを検出できます。DNAおよびNET結合タンパク質に対する染色の重なり領域の定量は、画像11におけるNETの下の総面積を決定する。

NETs11、12の蛍光画像ベースの定量を行うために、多くの画像解析オプションが利用可能である。しかし、これらのソフトウェアオプションは、ユーザーフレンドリーで完全に自動化されていないという制限があります。この記事では、バイアスのかからなからり完全に自動化された免疫蛍光顕微鏡顕微鏡画像ベースのNET定量を実行できる、自由に利用できるアプリ「NETQUANT13」の動作を実演します。アプリは、ユーザーフレンドリーなグラフィカルインターフェイス(GUI)を持っており、単一セル分析を実行することができます。本ソフトウェアは、DNA-NET結合マーカーの領域における形態学的変化を検出することにより、画像中のNETosisを定量し、クロマチンは核の変形に関連し、DNA:NET結合タンパク質比の増加を検出する。複数の NET 定義基準を組み合わせることで、複数のデータ セット間で厳密な NET 定量を公平に行うことができます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ルンド大学の倫理委員会は、ヘルシンキ宣言(2013/728)に従って、健康なボランティアからの静脈血の収集を承認しました。すべてのボランティアは、彼らの書面によるインフォームドの同意を提供しました。

1. 密度勾配遠心分離を用いた末梢血好中球の単離

  1. ヘパリンを含むチューブでヒトの静脈血を収集し、チューブが室温に達することを可能にします。
    注:健康なドナーからの血液の最低16 mLは、十分に大きな細胞ペレットを得るために必要とされる。
  2. 血液を生理食塩水(0.9%NaCl)で2%デキストランの1体積と混合し、無菌50mL円錐形遠心管で室温で30分間堆積物を入れます。
  3. 上清を無菌の50mL円錐形遠心管に吸引し、200 x gで遠心分離機を4°Cで10分間吸引する。
  4. このステップ以降、4°Cまたは氷上で分離を続けます。
  5. 5 mLの氷冷生理食塩水と層を5mLの白血球単離勾配(9.1%デキストラン、w/v)の上に無菌15mL円錐形遠心管でリスピンします。
  6. 遠心分離機 400 x g で 30 分間 4 °C。
  7. 上清を吸引し、それを捨てる。
  8. 30sの氷冷水でペレットを3mLで再サスペンドすることにより、赤血球をリゼし、直ちに3.6%NaClの1 mLを加え、10mLの氷冷生理食塩水で満たします。
  9. 350 x gで10分間の細胞懸濁液を遠心分離する。
  10. 上清を取り除き、細胞ペレットを採取し、1mLの生理食合いに再び中断します。ビュルカーチャンバーのトリパンブルーを使用して細胞数と生存率を評価するために、マイクロ遠心管に10°Lを取っておきます。
  11. 0.4%トライパンブルー溶液の90 μLに10μLのセル懸濁液を加えます。ビュルカーチャンバーでセル懸濁液の10°Lを服用します。チャンバーの各コーナーで3行で囲まれた4つの正方形のセルをカウントします。色素の取り込みに濃い青色で見えるセルは生存不可能であり、全細胞数から除外する。
  12. 以下の式で定義されているように、セル番号をセル/mLとして表現します。
    figure-protocol-1
    注:ここでチャンバー係数は10,000、希釈係数は10、平方数の合計は4であった。
  13. 残りの細胞懸濁液を最終洗浄工程のために10mLに希釈する。
  14. 遠心分離機は200 x gで5分間。
  15. RPMI-1640の好中球を2mg/mL熱不活性化ヒト血清アルブミン(HSA)で5x 105細胞/mLの濃度で再サスペンドします。

2. カバースリップの調製と好中球の刺激

  1. 12ウェルプレートの各ウェルにカバースリップ(10mm、#1)を1枚入れ、0.01%ポリL-リジン溶液200μLを加えてカバースリップをコーティングし、一晩37°Cのままにします。
  2. カバーリップを300μLリン酸緩衝液(PBS)で1回洗浄し、乾燥させます。
  3. 5 x 105好中球/mLの400 μLを各ウェルに加え、室温で15分間インキュベートします。
  4. 好中球を含むプレートを37°Cのインキュベーターに移動し、CO2を15分間5%で行います。
  5. 上清を取り除く。2 mg/mL HSA で 400 μL の予備温 RPMI-1640 培地をコントロールに追加します。刺激のために20 nM phorbol 12-myristate 13-アセテート(PMA)で300°L予温RPMIを追加します。
  6. 好中球を5%CO2で37°Cで150分間刺激する。

3. ネッツの可視化

  1. 上清を取り除き、200μLのPBSでサンプルを2x洗浄します。
  2. PBSに200μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を37°Cで20分間添加してサンプルを修正します。
    注: PFA は有毒であり、注意して取り扱う必要があります。
  3. サンプルを200μLのPBSで洗浄します。
  4. 30秒に対して0.5%トリトンX-100の50°Lを加えてサンプルを透過します。
  5. サンプルを200μLのPBSで3倍洗浄します。
  6. 37°Cで1時間、PBSで5%ヤギ血清でサンプルをブロックします。
  7. 37°Cで1:500の希釈液で、一次ウサギの抗ヒト好中球エラスターゼを300μL添加します。
  8. サンプルを300μLのPBSで洗浄します。
  9. 37°Cで1:1000の希釈で300μLの二次ヤギ抗ウサギ蛍光抗体を加えます。
  10. カバーリップを300°LのPBSで洗います。
  11. ウェルからカバースリップを取り外し、DAPIを含む10 μL取り付け媒体を使用してカバースリップを取り付けます。暗い中で室温で一晩保存し、サンプルを乾燥させます。
    注:DAPIによるDNAの染色は、この方法において確かに重要なステップです。ユーザーは、2\u20123 分の最終濃度範囲 0.1\u20120.5 μg/mL に対して、300 μL PBS で 3 回の洗浄手順を追加して、トラブルシューティングを行うこともできます。
  12. 20倍の目的を用いて広視野蛍光顕微鏡で画像を取得します。

4. NETQUANTを用いたNETTの分析と定量

注: NETQUANT は、ゼノド Github アーカイブまたは Nordenfelt Lab Web サイト (https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34) にあるインストール ファイルをクリックしてダウンロードできます。

  1. 解析用のデータセットのインポート、チャネルの命名、画像の変換
    1. NETQUANT で[設定]タブを開きます。
    2. ソースメニューの「パスの取得」オプションをクリックして分析するソースフォルダを選択し、解析する画像シーケンスを含むフォルダを選択します。
    3. ターゲット メニューの [パスの取得]オプションをクリックし、画像解析後にデータを保存するフォルダーを選択します。
    4. 「DNAチャネル」がDNA染色(例えば、DNAまたはDAPI)に対応するようにチャネルに名前を付け、「NETチャネル」は、画像中のNET結合タンパク質染色(例えば、NET、好中球エラスターゼ)を示す。ソフトウェアがスムーズに機能するためには、コントロールイメージファイルを含むフォルダに「コントロール」という名前を付けます(推奨)。
      注: NET チャネルは、NET 結合顆粒タンパク質マーカー染色のみを指します。
    5. [イメージ情報] サブメニューの [イメージ情報の読み込み]ボタンをクリックして、イメージメタデータをソフトウェアにフィードします。
    6. [チャンネルの順序] サブメニューのイメージに含まれる正しいチャネル順序を選択します。このオプションは、偶発的な不一致を防ぐためのフェイルセーフとして含まれています。
    7. 生データからプライマリ イメージのプロパティを取得し、[データの準備] ボタンをクリックしてイメージを変換します。変換されたイメージがサンプルタイプのサブメニューに表示されます。[サンプルタイプ]メニューをクリックして、解析用に取得したすべてのデータセットを表示および選択します。
    8. [サンプルタイプ]サブメニューから画像を選択し、[画像データを表示]ボタンをクリックすると、それぞれDNAチャンネルとNETチャンネルに分割された画像が表示されます。
  2. DNAチャネルおよびNETチャネルにおける細胞のセグメンテーション
    1. DNA チャネルと NET チャネルの両方で[方法]サブメニューをクリックして、セグメンテーション方法を選択します。
      注: セグメンテーションのデフォルトの方法はアダプティブに設定されており、推奨される設定です。グローバル、エッジ、チャン・ヴェッセなどの他のオプションも利用できます。集水域オプションは、密接に配置されたセルまたは NET を区別するのに役立ちます。
    2. [セグメント]コントロールサンプルオプションをクリックして、両方のチャンネルで最初に[セグメント化]タブを入力して、両方のチャンネルでコントロールセルをセグメント化します。
    3. サンプルタイプのサブメニューから PMA を選択し、「バッチ」(推奨) をクリックして、データ・セットに含まれるすべてのイメージのセグメンテーションを開始します。サンプルタイプメニューで画像を選択し、「画像データを表示」ボタンをクリックして、ポストセグメンテーションで生成されたバイナリイメージマスク(DNAマスクとNETマスク)を視覚化して検証します。
  3. 識別可能な特性の単一セル分析
    1. [分析]タブを入力し、[しきい値の決定]ボタンをクリックしてコントロールサンプルを分析します。
    2. サンプルタイプを PMA に変更し、[セルプロパティの取得]ボタンをクリックして、刺激されたサンプルの分析を完了します。
    3. サンプルタイプのサブメニューから画像を選択し、「画像データを表示」ボタンをクリックすると、オーバーレイと、画像内のオーバーレイとセル数とNET形成セルが表示されます。
  4. NET形成細胞を同定するための細胞特性の比較
    1. サンプルタイプのサブメニューからサンプルを選択し、[NETs解析]ボタンをクリックして解析を完了します。分析用のサンプルタイプのサブメニューから個々の画像を選択することも、バッチオプションを選択して画像のバッチ全体を分析することもできます(推奨)。
    2. NET 基準を手動で調整して、特定のサンプルに最適な結果を得ます。識別されたネットを元の画像と比較して、識別の品質を評価します。
      注: NET 基準は、データ・セット内のすべてのイメージで使用できます。NET 基準の変更は、すべてのコントロール サンプルに同時に適用されます。これにより、NET パラメータのオーバーフィットが原因で発生する可能性のある相違点が制限されます。NET 基準の設定は、ユーザーの要件に応じて調整できます。誤検出率と NETQUANT の関係は、以前に13を調査しました。面積増加の一般的な範囲は 2\u20124、循環度は 0.7\u20120.9、DNA/NET 比は 0.6 ~ 2.0 です。
    3. [セル データ]サブメニューで、イメージの数、画像あたりのセル数、およびイメージごとのネットの割合が表示されているデータサマリーを調べます。
      注: データセット全体の NET の合計パーセンテージは「ネットゲージ」で表示されます。サンプル内の合計画像数、セル数、NET のパーセンテージ (NETs%)およびコントロール サンプルの NETTs% は、NET ゲージの下の要約統計量テーブルに表示されます。制御データは、刺激されたサンプルから得られたデータと一緒に報告することをお勧めします。
  5. 結果出力
    1. [出力]タブを入力して、結果の出力を選択して表示します。
    2. 出力の形式を選択し、[結果の出力]ボタンをクリックして、制御と PMA の分析から生成されたさまざまなデータ出力を探索および比較します。
      注: コントロールと刺激の両方の後分析で生成されたすべてのデータは、ターゲット サブメニューで選択した解析フォルダに保存されます。データは .csv 形式または .pdf 形式で保存されます。
    3. メソッドファイルを起動して、分析に使用するソフトウェアと NET 条件のバージョンを取得します (公開用のメソッド セクションに含める)。
    4. [結果] データ テーブルをクリックして、特定のサンプル内の個々のデータ ポイントを視覚化します。
    5. サンプル内の NET 領域分布と DNA:NET 比を視覚化します。赤い線は、グラフのしきい値を示します。
    6. 二変量分布ファイルをクリックして、DNA の領域と形状を決定します。
  6. 前の分析とバッチすべてのステップの読み込み
    1. [前の解析を読み込む] ボタンを使用して、以前に成功した解析設定を NETQUANT に読み込みます。
    2. [セットアップ]メニューの [すべての手順をバッチ処理する] ボタンを使用して、手順 5\u201212 (図 1、図2、図 3、図 4、図 5)を直接実行して、最終的な出力を取得します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

5 x 105好中球/mLを12ウェルプレートに入れたカバーリップに播種し、20 nM PMAまたは150分間無刺激のままにして刺激した。次いで、原発ウサギ抗ヒト好中球エラスターゼ抗体、二次ヤギ抗ウサギフルオロフォア共役抗体およびDAPIを用いて試料を染色した(詳細は材料表参照)。その後、エピ蛍光顕微鏡と20X(NA =0.75)の目的を用いて、最低5枚の画像を取得した。原稿のテスト分析に使用されるサンプルデータは、リンクhttps://nordlab.med.lu.se/?page_id=34に従い、サンプルデータセットアイコンをクリックしてダウンロードできます。

ここでは、所定のサンプルにおけるNET形成を定量するNETQUANTワークフロー(

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NET形成は、多様な好中球武装体4に比較的最近の付加であり、幅広い研究領域5、7、14、15におけるNETの影響を研究することに関心が高まっています。免疫蛍光顕微鏡を用いた画像の取得とその後の画像ベースの定量は、NETを定量するために広く使用されている方法です。このアプローチは、単一細胞レベルでNETを形成する細胞を検出できるという利点があるため、バックグラウンド信号をより良く減らすことができます。定量化の手動方法は、網羅的で遅く、ユーザーバイアスの影響を受ける可能性があります。信頼性の高い分析11,12をユーザーに提供しているいくつかの半自動オプションが存在します。ただし、運用に関しては多大な技術的スキルが必要な場合や...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TMおよびPNには、NETQUANTで使用されるアルゴリズムに関連する特許出願中があります。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、クラフォード財団(TMおよびPN)、スウェーデン政府研究助成金(PN、TM)、スウェーデン研究評議会(PN)、グロシンスキー財団(TM、PN)によって資金提供されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BD Vacutainer ヘパリン処理プラスチックチューブBD Biosciences367885
LymphoprepAxis-Shield114547
RPMI-1640 with L-GlutamineGibco11835-030
50mL 円錐フラスコSarstedt62.547.004
15mL 円錐フラスコSarstedt62.554.002
12ウェルティッシュ培養プレートファルコン10626491
#1 カバースリップ 10mmメンゼル・グレイザーCS10100
スライドガラスメンゼル・グレイザー631-0098
一次抗ヒトエラスターゼDAKODAKO ウサギ 1373, 契約免疫
二次蛍光色素結合ヤギ 抗ウサギライフテクノロジーズ A-11072, A-11070
PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPILife technologiesP36930封入用剤
ヤギ血清Sigma-AldrichG9023
ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA)Sigma-Aldrich79346
パラホルムアルデヒドSigma-Aldrich158127
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
ニコン Ti-E 落射蛍光顕微鏡ニコン
CCDカメラアンドール ザイラ
プラン アポクロマート 20倍、40倍対物レンズニコン
Windows 10マイクロソフトオペレーティングシステム
macOS Sierra 10.12アップルオペレーティングシステム
MATLABMathworks

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
  3. Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
  4. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  5. Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  6. Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it? Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
  7. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
  8. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
  9. Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
  10. Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
  11. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413(2012).
  12. Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
  13. Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999(2017).
  14. Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
  15. Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray - NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
  16. Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755(2017).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

NETDNA NETNETQUANTPMA

関連記事