Method Article

ガラス化と地球温暖化の手順中に胚盤胞の行動の客観的評価のための形態のプロトコル

DOI:

10.3791/58540

⸱

February 28th, 2019

 , 
1Department of Reproductive Medicine and Gynecological Endocrinology, University Medical Centre Maribor

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

タイムラプス形態プロトコル previtrification 介入および地球温暖化後の復旧中に再拡張胚盤胞の収縮の強さを次にご紹介します。プロトコルのアプリケーションは体外受精所タイムラプス顕微鏡装備で可能であるし、最適な胚盤胞のガラス化法の開発にお勧めします。

Abstract

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この資料では、ガラス化の前後に個々 のフェーズ中に変更する胚盤胞の量の正確な監視のタイムラプス顕微鏡写真に基づいて胚盤胞の形態の非侵襲的方法について説明します。メソッドは、胚盤胞の収縮と再拡張別の前と後のガラス相を観察することによって胚盤胞凍結保護剤の濃度の異なる暴露の最適のタイミングを探しに役立ちます。この方法では、胚盤胞ガラス化プロトコルを最適化できます。この計測法の有用性の良いデモ、ガラス化のための 2 つの異なる胚盤胞準備のプロトコルが比較されます。折りたたみ人工の胞胚腔を使用して 1 つとガラス化する前にこの介入なし。両方、胚盤胞の体積はタイムラプス顕微鏡写真に続いて、写真編集ソフトウェア ツールで測定されました。Previtrification の段階で 20 秒ごとと 5 分後に地球温暖化の期間に、測定されます。時間ユニットごとの胚盤胞の寸法の変更は、線図でグラフィカルに表示されます。そのまま胚盤胞が縮小する最初と、ゆっくりとリフィルを胞胚腔は、液体で満たされた胞胚腔とガラスに入る長い平衡 previtrification 相を示した。人工的に折りたたまれた胚盤胞の全体の平衡の段階によって縮められた段階のままです。ガラス化段階では、それも変更されませんそのボリューム。以来、胚盤胞の形態は、previtrification ステップの間に人工的に折りたたまれた胚盤胞の一定量を示しています、それはこの段階が短いかもしれないようです。記述されていたプロトコル中に、速度とボリュームの変更、一部胞胚腔収縮または合計胚盤胞の数の強度に基づいて凍結保存後胚盤胞の多くの追加比較パラメーターを提供します崩壊し孵化する、または合計胞胚腔の再膨張する時間。

Introduction

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プログラムには体外受精 (IVF) 着床前胚の凍結保存は最近ほとんど体外受精研究室でルーチンの練習です。特定の凍結と氷核生成 (シード) が誘導されたとき、-7 ° C までの胚の制御冷却を可能にしたコンピューター制御冷凍庫の導入により、1985 年に臨床的に使用される遅い胚凍結法を始めた、周辺凍害中1。連続冷却による氷の結晶成長、hyperosmolality の残りの液体の部分と、その結果、脱水症状を引き起こしていると胚細胞の収縮。-30 ° C または-80 ° C で、胚は長期保管のため、液体窒素に飛び込んだでしょう。冷却中に胚や卵子で起こっていた凍結プロトコル2を改善する助けバリアフリー cryomicroscopes だけで観察できます。高いボリュームおよびより多くの流体に含まれる胎生期胚盤胞の凍結は、これらの日3の少ない有望な臨床結果を与えた。

画期的な胚盤胞の凍結保存細胞の脱水が高濃度の凍結保護剤4を使用して冷却する前に場所を取ったガラス化法の導入であった。2 栄養外胚葉細胞5間機械開口することによってガラス化する前に胞胚腔から液体の除去が可能します。新鮮な転送後、子宮腔内に胚盤胞の凍結融解の転送は結果にほ....

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Protocol

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ここで説明したすべてのメソッドは、2016 年 4 月 19 日 (号 0120-204/2016-2) に国立医療倫理委員会で承認されています。

1. 顕微鏡記録システムのセットアップ

  1. 顕微鏡の加熱プレートをオフにします。
  2. すべての治療前にカメラ付きの倒立顕微鏡下で胚盤胞のスナップショットを取る。胚盤胞の記録の倍率に注意してください。

2. 選択と胚盤胞のガラス化のための Prepreparation

  1. 唯一完全に展開された日 5 または日 6 胚盤胞、少なくともいくつかの内部細胞質量 (ICM) と凝集栄養外胚葉と凍結保存用を選択します。
  2. レーザー治療胚盤胞崩壊した胞胚腔での件名に至る 4.3 9.4 μ m 穴径の短いレーザー パルス (0.4 - 0.7 ms) に胚盤胞は透明帯と 2 つの隣接した trophectodermal 細胞の接合部で接線方向監督。5 分間完全にまたは部分的に崩壊に胚盤胞を許可します。
  3. そのまま胞胚腔と未処理胚盤胞のガラス化保存前に特定の治療法実行しません。
    注: これらの胚盤胞はそのままと見なされます。

3. 平衡相の保護剤の検討とシャーレの準備

  1. 無菌平衡メディアに合わせて卵母細胞侵....

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Results

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デモでは、1 つだけ previtrification と 1 つの後地球温暖化段階での胚盤胞の形態制御を示した。胚盤胞のボリュームで平衡相の終わりと違い培養培地は、実際には、胚の収縮の強さを示した氷結晶化に対する胚保全の強度の回復の初め。

それは、図 1とビデオ 1から気づくことができるとそのまま胚盤胞では崩壊しない完全に平衡化ソリューション。胞胚腔が部分的にのみ、契約しますが、10 分以内にゆっくりと 70% の再膨張サイズに達した。逆に、人工的に折りたたまれた胚盤胞は、レーザー治療後すぐに胞胚腔を完全に空に、そのボリュームは任意 (図 2ビデオ 2) 平衡ソリューションで変わらなかった。回復中に胞胚腔再膨張のプレゼンテーション (

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Discussion

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凍結保存することができます同様の機器と他のメーカーからソフトウェア ツールを使用して実施するも前後の中に胚盤胞の形態制御の観察のためのプロトコル。タイムラプス システム発生学の調整は、胚の開発の継続的な監視を許可します。この作業の目的は、胚盤胞のガラス化と温暖化の後の準備中に胚盤胞の行動の定量化を導入することだった。これは、タイム スケールの形態変化の客観的測定によって行われました。これらの測定の結果を数学的に分析および他の結果と比較できます。記述されていたプロトコルによって続くことができるパラメーターのうち胚盤胞のサイズの変更、一定期間内、その内部細胞塊、胞胚腔、または透明帯。サイズは、最大の胚盤胞断面、胚盤胞円周や直径も、体積の計算の後の表面積として表示できます。

タイムラプス システムを使った過去の研究、胞胚腔の膨張速度の測定は、新鮮胚11でのみ作られました。温暖化の直後に、胚移植前に胚盤胞の凍結融解、胚盤胞のサイズだけを測定したまたは期間を行ったを温めた胚盤胞透明帯9,.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、研究プログラム P3 0327 研究プロジェクト J3-7177-スロベニア語研究財団によって設立されたの一部です。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
倒立顕微鏡 Eclipse TE2000-U ニコン/
Saturn 5 Laser SystemResearch Instruments, Origio, デンマーク/
Digital camera DC1Research Instruments, Origio, デンマーク/
Digital camera DC2Research Instruments, Origio, Denmark/
Cronus 3.7Research Instruments, Origio, Denmark/顕微鏡記録ソフト
6% CO2, 5% O2バインダー Binder, Germany/
Primo Vision microscopeVitrolife, Sweden16600
Primo Vision Capture softwareVitrolife, Sweden16608time-lapse recording software
Adobe Photoshop CS6 Extended softwareAdobe Systems Incorporated, USA/video analysis
software VirtualDub エイブリー・リー/ビデオ編集ソフト
Microsoft Office Excell マイクロソフト、米国/スプレッドシートエディタ
PrimoVision 培養皿Vitrolife、スウェーデン16604
G2-plus 培地Vitrolife、スウェーデン10132胚盤胞期胚の培養培地
ヒト血清アルブミンVitrolife、スウェーデン10064
パラフィン油Vitrolife、スウェーデン10029
平衡化溶液媒体アーバイン・サイエンティフィック社(アイルランド90131
ガラス固化液媒体アーバイン・サイエンティフィック社(アイルランド90132
解凍液媒体アーバイン・サイエンティフィック社(アイルランド) 90134
希釈液媒体アーバイン・サイエンティフィック社(アイルランド90135
洗浄液媒体アーバイン・サイエンティフィック社(アイルランド)90136
HSV ガラス化ストローCryoBio System, France025246, 025249, 025250, 025248
液体窒素/
凍結容器 Biosafe 120 MD βCryotherm、ドイツ229286
CryoタンクCryotherm、ドイツ
鉗子//
Scisors//
胚盤胞操作用ピペットGynetics、ベルギーID275/10直径 275 & マイクロ;m
卵母細胞剥離用ピペットVitromed, GermanyV-DEN-135diameter 135 µm
Pipettor EZ-GripResearch Instruments7-72-2802
デジタルインターバルタイマー AssistentGlaswarenfabrik Karl Hecht41977010
IBM SPSS Statistics 21IBM, USA/statistical analysis software
Self adjusting wire stripperKnipex, Germany1262180
) ) )

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
  2. Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of in....

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