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ここで説明したすべてのメソッドは、2016 年 4 月 19 日 (号 0120-204/2016-2) に国立医療倫理委員会で承認されています。
1. 顕微鏡記録システムのセットアップ
- 顕微鏡の加熱プレートをオフにします。
- すべての治療前にカメラ付きの倒立顕微鏡下で胚盤胞のスナップショットを取る。胚盤胞の記録の倍率に注意してください。
2. 選択と胚盤胞のガラス化のための Prepreparation
- 唯一完全に展開された日 5 または日 6 胚盤胞、少なくともいくつかの内部細胞質量 (ICM) と凝集栄養外胚葉と凍結保存用を選択します。
- レーザー治療胚盤胞崩壊した胞胚腔での件名に至る 4.3 9.4 μ m 穴径の短いレーザー パルス (0.4 - 0.7 ms) に胚盤胞は透明帯と 2 つの隣接した trophectodermal 細胞の接合部で接線方向監督。5 分間完全にまたは部分的に崩壊に胚盤胞を許可します。
- そのまま胞胚腔と未処理胚盤胞のガラス化保存前に特定の治療法実行しません。
注: これらの胚盤胞はそのままと見なされます。
3. 平衡相の保護剤の検討とシャーレの準備
- 無菌平衡メディアに合わせて卵母細胞侵食 (直径 135 μ m) の使用 pithe ピペット (20% 7.5% エチレング リコール、7.5 %dmso を M-199 HEPES バッファー媒体 DSS) 身障者用 9 よくペトリ皿の液滴領域の穴に微速度顕微鏡観察と記録。
注: 卵母細胞の侵食は卵丘細胞卵母細胞の周囲を削除するプロセスです。卵母細胞の侵食のためピペットの使用は、空気の泡の作成を回避するのに役立ちます。
- 平衡メディアの 30 μ L で液滴領域をオーバーレイします。
4. 平衡ソリューションで胚盤胞の転送
- 室温 (平衡の段階) で 10 分間点滴皿の液滴領域の下部に平衡する媒体にレーザー治療、あるいはそのまま胚盤胞が水没します。
- 平衡の中に胚盤胞を転送できるだけ早く 10 分のカウント ダウンを開始します。
5. 平衡段階で胚盤胞の記録
- カメラ付き顕微鏡液滴煮は、胚盤胞を転送します。同じ胚盤胞のスナップショットの前に同じ倍率を使用します。位置、液滴料理記録の中心部に約胚盤胞が表示されるようです。
- 顕微鏡の録音ソフトで録音を開始します。録音を開始するカウント ダウン時間に注意してください。
注: は、平衡の解決に 10 分露出の間に、そのまま (図 1ビデオ 1) と折りたたまれた胚盤胞 (図 2ビデオ 2) の録音の代表の結果を参照してください。
6. 胚盤胞のガラス化保存
- 無菌シャーレのカウント ダウンが終わる前に 2 分でガラス固化ソリューション (15 %dmso、エチレング リコール 15%、20 %dss、0.5 M ショ糖中 HEPES バッファー M-199) の 50 μ L ドロップを施します。
- 10 分のカウント ダウンが終了し、30 のガラス固化ソリューションに胚盤胞をすばやく転送を記録を停止室温で s。
- 優しくピペットの胚盤胞ガラス化ソリューション内で少なくとも 1 つの x。
- 胚盤胞の読み込みにガラス化のわらを使用します。読み込み、シール、およびわらのガラスに突入 80 内液体窒素 (LN) s、110 を超えない s ガラス化溶液への初期の暴露後。
7 平衡相の間に記録された胚盤胞のビデオ編集
- 録画したビデオ ファイルをビデオ編集ソフトウェアにインポートします。
- この時点で、タイムライン スライダーを 20 s. 注フレーム番号に移動します。
注: 不要なビデオ フレームを台無しにこの番号が使用されます。フレームのみのすべての 20 秒が使用されます。
- [ビデオ] タブの [フレーム レート...をクリックします。[フレーム レート変換、デシメーションでフィールドを確認し、上記フレーム番号を入力します。[Ok]をクリックして確定します。ファイル→エクスポートをクリックして画像。
- 出力形式として JPEG を選択保存した画像のシーケンスを保持するディレクトリを設定し、 [ok]をクリックします。
注: 記録された胚盤胞まで 30 の画像のシーケンスでガラス化の平衡の段階でディレクトリを作成これが。
8. 胚盤胞の平衡の段階で作成したイメージから断面積の測定
- ビデオ分析ソフトウェアを開きます。[ウィンドウ] タブをクリックし、タイムラインを選択します。
- タイムライン ウィンドウで、フィルム ストリップの記号をクリックし、ガラス化の平衡化フェーズの前に胚盤胞のイメージを追加するメディアを追加... ] を選択、いずれかがあった場合、レーザーの介入の前に。
注: このイメージは、ほとんどの拡大された状態で胚盤胞を表示され、その断面積が参照として使用されます。
- 以前 (ガラス化の平衡の段階) のビデオ編集ソフトウェアで生成された対応する胚盤胞の画像シーケンスを追加します。
- イメージ→解析→データ ポイントを選択する行くカスタムデータ ポイントを選択] ウィンドウを開きます。
- すべてのデータ ポイントを選択解除領域だけを選択し、 [ok]をクリックして確認します。
- [タイムライン] ウィンドウで最初の画像をタイムライン スライダーを移動します。
- ウィンドウのタブをクリックし、ツールを選択します。
注: これは左側のツール パネルをアクティブになります。
- クイック選択ツールを選択します。
- 胚盤胞の端をタッチする胚盤胞の内部ツール マーカーを配置します。クリックすると胚盤胞の外側の端にツール マーカーを配置することによって胚盤胞を概説し、マウスの左ボタンを押したまま、全体の胚盤胞の断面積まで胚盤胞の外側のエッジに沿ってツール マーカーをドラッグすることを選択します。
注: 透明帯はありませんする必要がありますので、測定の一部除外 (図 5)。
- タイムライン ウィンドウで計測ログ] をクリックし、計測値を記録ボタンを押します。
注: これは選択した領域を記録します。
- タイムラインに戻る、画像の上を右クリックし、選択を解除を選択します。
- 下にある対応するタイルをクリックしてタイムライン スライダーを次の画像に移動します。
- クイック選択ツールで新しいイメージの胚盤胞を概説します。測定を繰り返します。
- この手順 (手順 8.9 8.13) した画像を繰り返してすべての画像の断面積を測定し、記録します。
- 最後に、計測ログに領域の変数の下のすべての測定を選択し、.txt ファイルでエクスポートするを移動します。
注: 断面積の単位は、正方形ピクセルです。
9 平衡の段階で作成した画像から記録された胚盤胞の断面積データ ファイルの編集
- .Txt ファイルから記録された胚盤胞の断面積のデータをスプレッドシート エディターに転送します。
- 最初断面積の値基準値 1 と表現として (変換) の一部にする他のすべての値を参照値を使用します。
- 新しい変数 Area_r を作成し、それの下で (参考値) を除くトランス コードの面積の値を貼り付けます。
- Area_r 変数の横に時間の変数を作成し、最初の時刻値を追加します。
注: 最初の時刻値は、胚盤胞が公開された瞬間からカメラ付きの顕微鏡の下で録音の発症に平衡化ソリューションに渡される時間を表します。
- 20 を追加することによって、各次の連続した時間計算前の時間値に s。
注: これは記録中に作成された不要なビデオ フレームを間引きで使用する時間間隔です。
10. 胚盤胞の温暖化
- 地球温暖化のメディアを準備します。
- 前日、胚盤胞を温暖化には無菌 3 150 μ L 滴 4 よく皿にリカバリ媒体を調剤します。また、無菌調剤回復点滴 9 よく料理微速度顕微鏡観察のために設計、記録中。パラフィン オイルでリカバリ媒体をカバーし、6% の CO2と 5% O2の 37 ° C で preincubate。
メモ: リカバリ媒体は追加したひと血清アルブミン (HSA) 胚盤胞期胚の培地です。リカバリ媒体の HSA は、12 mg/mL をする必要があります。9 よく皿に穴を埋めるためには、空気の泡の作成を避けるために卵母細胞の侵食のピペットを使用し、リカバリ媒体の 30 μ L で液滴領域をオーバーレイします。
- 胚盤胞を温暖化の日、無菌融解 4 よく料理の単一の井戸のソリューション (TS) 500 μ L を分注、CO2インキュベーターで 37 ° C に温めることができます。
- 常温では無菌希釈液 (DS) の 1 つの 50 μ L ドロップと滴洗浄ソリューション (WS) の 50 μ L 滅菌シャーレに調剤に。パラフィン オイルと DS、WS1 と WS2 の滴をカバーします。
注: シャーレの代わりに 4 も皿も使用できます。
- 胚盤胞を温めます。
- LN ストレージから削除され、地球温暖化のプロシージャのための準備で LN 充填ポータブル タンクにわらをすばやく転送するガラス固化体の胚盤胞と HSV わらを識別します。
- 鉗子、わらを持ち上げて色処理ロッドを公開するだけで十分。自己調整ワイヤーストリッパーを使用して、色処理棒の高さでストローをカットします。
- 取り扱いロッドをつかむし、迅速なまだ制御された動きとストローから抽出直ちに処理ロッドの曲がりヘラを 37 ° C TS に突入します。
- 胚盤胞をデタッチし、TS の 1 分の合計のためにそれを残す処理ロッドを軽く旋回します。
- 常温で転送胚盤胞連続 DS、WS1 と WS2 各メディアで 4 分間。
- 地球温暖化の手順の後リカバリ媒体 4 よく皿に胚盤胞を転送し、軽くピペッティングそれによってすべての 3 滴でそれを洗います。
注: 洗濯物は約 1 分に行われます。
- リカバリ媒体と時間経過 9 よく皿に胚盤胞を転送します。(6% CO2と 5% O2の 37 ° C) でインキュベーターでコマ撮りカメラの下で 9 よく皿を配置します。
注: インキュベーターでコマ撮りカメラの下で 9 よく皿を置くことにつづく Thre 地球温暖化手順は、約 17 分続きます。
11 回復後温暖化中に胚盤胞の再拡大のコマ撮り録画
- コマ撮り録画ソフトウェアを実行します。
- 記録カメラを選択します。
- ライブ モードのボタンを押します。
- 画像にマウス カーソルを置いて、スクロール ボタンを使用して、それを拡大します。クリックし、マウスの左ボタンを押したままカーソルを画面の真ん中に胚盤胞で井戸を配置します。
- フォーカシング、下胚盤胞の記録面を集中するのに上下の緑の矢印を使用します。下光の強度、光の強度を設定します。
- 露光時間とガンマを設定するには、顕微鏡パラメーターをクリックします。
- ライブ モードの終了キーを押します。
- プロジェクトのスタートボタンを押すとプロジェクト データを入力、培養ディッシュ タイプ (3 x 3 または 4 x 4) を選択し、記録する 1 つを除くすべてのポジションをオフにします。、
- 撮影を 5 分ごとにキャプチャ タイミングを設定します。
- 承認ボタンを押すと録音を開始します。少なくとも 150 分を記録します。
- プロジェクトを停止ボタンを押して録音を停止します。
注: 地球温暖化後の回復期間中にそのまま (図 3) と折りたたまれた胚盤胞 (図 4) の録音の代表的な結果を参照してください。
12 後温暖化の再拡張の間に記録された胚盤胞のビデオ編集
- プロジェクト フォルダーに移動し、約 80 KB のサイズは記録された画像を探します。
- 別フォルダーを作成し、それにこれらの画像を転送します。作成時間に従って数の画像の名前を変更します。ビデオ編集イメージ シーケンスとしてソフトウェアにインポートします。
- [ビデオ] タブ→フィルター → へ追加し、 Null 変換フィルターを選択します。
- 右側の [トリミング] ボタンをクリックし、記録された胚盤胞と表示フィールドだけを残し、画像をトリミングします。[Ok]と[ok]もう一度確認してください。
- ファイル→エクスポートをクリックして画像。出力形式として JPEG を選択保存した画像のシーケンスを保持するディレクトリを設定し、 [ok]をクリックします。
注: これは、さらにビデオ解析ソフトウェアで測定のため用意されたサイズ (トリミング) 画像が作成されます。
13 コマ撮り録画ソフトウェアで作成されたイメージのビデオ分析ソフトウェアで計測スケールの設定
- コマ撮り録画ソフトウェアのアナライザーを実行します。
- 記録された胚盤胞を持つプロジェクトを開きます。
- 記録された胚盤胞を持つフィールド [分析] ボタンをクリックします。
注: 新しい分析ウィンドウが開きます。表示する測定ツール測定ボタンをクリックします。
- 測定ツールを使用して、全体のイメージの幅を測定します。
- 画像を右クリックし、それを保存します。プロパティで、画像の幅 (ピクセル単位) を確認します。
- 幅 (ピクセル単位) でイメージの実際の幅を分割します。
注: これは、このイメージの単一のピクセルの実際の長さを計算します。
- ビデオ分析ソフトウェアを実行します。
- [ウィンドウ] タブをクリックし、タイムラインを選択します。
- タイムライン ウィンドウ フィルム ストリップの記号をクリックし、ポスト暖かい再拡大胚盤胞の画像シーケンスを追加するメディアを追加を選択します。
- イメージ→分析→計測スケールを設定をクリックカスタム尺度] ウィンドウを開きます。ピクセル長 1; を入力してください。論理長ピクセル (13.6 のステップ) の以前に計算された実際の長さを入力してください。論理単位入力プリセット保存されました。
14. 胚盤胞の再拡張後暖かい中に作成されたイメージから断面積の測定
- 計測スケールをセットし画像シーケンスをインポート後は、これらの測定測定断面積 μ m2 台を持って唯一の違いでステップ 8 で説明したように同じ方法の胚盤胞の断面積を測定します。.
15 再拡張後暖かい中に作成された画像から記録された胚盤胞の断面積データ ファイルの編集
- .Txt ファイルから記録された胚盤胞の断面積のデータをスプレッドシート エディターに転送します。
- エリア変数の横に時間の変数を作成し、最初の時刻値を追加します。
注: この例では、最初の時間の値に設定されます 0 分コマ撮り録画の発症であります。各次連続時間値は、5 分を以前の時刻の値に追加することによって計算されます。5 分、2 つの連続したコマ撮り録音間で使用される時間間隔。
16. 線図の作成
- ガラスや再拡張後温暖化の平衡の段階で時間で胚盤胞の断面積変化の時間プロットを作成する統計解析ソフトウェアでスプレッドシート データ ファイルをインポートします。