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方法論記事

作物の生長と花ディップ アグロバクテリウム Extremophyte Schrenkiella parvulaの

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⸱

DOI:

10.3791/58544

⸱

2019年1月7日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Louisiana State University

この記事について

サマリー

花 dip 法を用いたアグロバクテリウム仲介された変形は extremophyte モデルSchrenkiella parvulaの安定形質転換線を作成する正常に用いることができます。シロイヌナズナ、別の成長の習慣と、extremophyte の生理学的特性を考慮したためと変更プロトコルを提案します。

要約

Schrenkiella parvulaは多重イオン毒性ストレスを含む様々 な非生物的ストレスに適応する extremophyte です。ツールは、実行可能な変換システムの不足によって制限されているし、利用可能な高品質のゲノム リソースにもかかわらず植物が環境に適応する方法を研究する強調、機能ゲノム学モデルとしての価値。このプロトコルで報告する安定した遺伝子組換え米 parvulaの生成方法アグロバクテリウム仲介された花のすくいメソッドを使用して行。不確定な開花習性と葉高エピクチクラ ワックス コンテンツなどs. parvulaのユニークな特徴を考慮してaに使用される変換プロトコルを変更しました。簡単に言えば、 S. parvula種子は植える前に 5 日間の 4 ° C で階層化しました。14 h 光と暗い 10 h と、130 µmol m-2の-1光強度、24 ° C に 22 の ° c の日長で栽培しました。8 複数花序と 9 週齢の工場には、変換に選ばれました。PMP90RKプラスミドを運ぶアグロバクテリウムGV3101 の浸透ソリューションは、これらの花序を浸したされました。花漬変換効率を高めるため 3 〜 4 週間の間隔で 2 回のラウンドを行った。T1 種子は、収集され、候補者の画面に発芽の行の変換前に、乾燥剤が付いている容器で 4 週間の乾燥します。バスタへの抵抗は、T1 植物を画面に使用されました。誤検知を減らすために 2 週古い工場で 3 日間の間隔で 3 回バスタ ソリューションを散布しました。バスタ ドロップ テストは真の肯定的な形質転換体を識別するために個々 の植物の存続で実行されました。変換効率 0.033 お %、10,000 T1 種子伝播あたり 3-4 遺伝子組換え植物の降伏であった。

概要

このプロトコルでは、成長と extremophyte モデルSchrenkiella parvulaの安定形質転換路線の設立について説明します。効率的な変換システムの可用性は、汎用性の高い遺伝的モデルの特徴です。極端な環境で繁栄する植物は、extremophytes、として環境ストレスに対する植物の適応を理解するための重要なリソースを提供するために呼ばれます。Schrenkiella parvula(旧Thellungiella parvulaと別 parvulum) ゲノム リソース1,2,3,4、5の拡大と、1 つのようなの extremophyte モデルです。ただし、変形のプロトコルまだ報告されていないs. parvulaの出版された調査で。

S. parvulaのゲノム アブラナ科 (マスタード キャベツ家族) で初公開された extremophyte ゲノムであり、非 extremophyte モデル、シロイヌナズナ1広範な全体的なゲノム シンテニーを示します。したがって、シロイヌナズナとs. parvula比較研究の恩恵S. parvulaゲノムがどのように進化し、規制に関する有益な仮説をするシロイヌナズナで行われた遺伝研究の富別様に対処する極端な環境は5,6,7を強調します。S. parvulaは最も耐塩性種の (土食塩 LD50 に基づいて) 知られている野生の親類間でa8の 1 つです。耐塩に加えて米 parvula存続させ、高濃度でほとんどの植物7に有毒である複数の塩イオン存在下におけるライフ サイクルを完了します。その自然の生息地で流行している非生物的ストレスに対する、それが展開する様々 な特性、その中でいくつかの生化学的、または生理学的なレベルの8,9,10、研究されています。 11。

2010 年、 S. parvula対象種としてまたは他の植物のゲノムとの比較でそれを使用する 400 以上のピア分列出版物がずっとあります。ただし、どのような研究が行われているのよく見るとクリアのボトルネックを識別できます。これらのレポートの大半は将来の研究で米 parvulaの潜在的な使用について話し合うまたは比較ゲノムまたはゲノミクス研究で使用します。概念実証の変形のプロトコルの不足のために確立S. parvula日付に利用可能な最高品質の植物ゲノムの 1 つを持っていることにもかかわらず、機能のゲノム研究で使用されていない (> 5 Mb contig N50) 組み立て、pseudomolecules 染色体レベル1に付きます。

アグロバクテリウム花ディップ法atrasngenic 行を作成する最も広く使用されている方法となっているし、変換の再現システムの開発だったとして、その成功の重要な要因、遺伝モデル12,13。ただし、すべてのアブラナ科の種は、シロイヌナズナの花のすくいの手法を使用して正常に変換する示されています。特別に、 S. parvulaを含むアブラナ科のリネージュ II 種は花のすくいに基づいて変換方法14,15に反抗的なされています。

S. parvula、その狭い葉の形態と組み合わせての不確定な開花生育は標準花ディップ アグロバクテリウム法を採用するために挑戦しました。本研究では、 S. parvulaの再現性のある変換を行った修正されたプロトコルを報告します。

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プロトコル

1. 植物の成長

  1. 種子殺菌 (オプション)
    1. 1 二重蒸留水 (ddH2O) の 50% の漂白剤の準備または非イオン性洗剤の 2 滴 (材料表参照) 50 mL のチューブで。数回のチューブを反転すると、ソリューションをミックスします。
      注:層流の場合 15 分間 UV 殺菌サーフェスとキャビネットの種子殺菌を実施することをお勧めします。
    2. 漂白剤溶液を加える 〜 100-200 s. parvulaの種を 1.5 mL チューブ。混和し、5 分間座っている管。
    3. チューブから漂白剤を削除し、70% エタノールを追加します。数回ピペッティングによる種子を洗浄、エタノール溶液をすぐに取り外します。
    4. 余分な漂白剤やエタノール、削除する滅菌水で種子を洗浄し、水を除去します。5 〜 6 回この手順を繰り返します。
  2. シード成層
    1. 殺菌水は、種子を浸すし、4 ° C で 5 ~ 7 日間の保存また、湿った土の上に直接乾燥無殺菌種をまくし、4 ° C で 5 〜 7 日土トレイを配置
  3. 変換の準備で植物を育てる
    1. 塗りつぶしの土 7 × 6 cm2鍋に (材料の表を参照) を混ぜて、水で鍋を浸して、均一にぬれた成長培地を確保するため上部から水をスプレーします。各ポットの土の表面に 5-肥料ビーズ (材料の表を参照) を追加します。
      注:我々 が経験している限りでは、 s. parvulaはシロイヌナズナが成長することができます任意の土壌ミックスによく生えています。
    2. ウェットつまようじを使用して転送 20 〜 土壌表面ポット当たり 25 種。
      注:便利な練習は、4 つのコーナーと鍋 (図 1、日 15、左パネル) のセンターに 4-5 種のバッチを置くことです。
    3. 発芽過程における高湿度下で種子を維持する明確なドーム ポット トレイをカバーします。
    4. 130 µmol m− 2 − 1光秒、22-24 ° C の温度、および夜のサイクルあたり日/10 時間あたり 14 h で設定照度成長チャンバ内植物トレーを維持します。発芽の後 7 ~ 10 日後ドームを削除します。望ましいレベルで均一に湿らせた土を保つためにトレイの下部から水を追加します。
    5. 苗の草取りし、よく (図 115 日、右側のパネル) 互いから分離ポット当たり唯一の 4-5 健康な苗を残します。
    6. 優しく水の植物 2 日毎とホーグランドのソリューション16 x 0.2 で 2 週間に一度受精します。
      注:キー均一レベルで土壌水分を保つことは一貫して、健康米 parvulaの成長に。
    7. 8-10 週間複数花序生成工場 (図 1日 60-80) 当たり 100-150 花蕾まで植物を成長を続けます。花のすくいに基づいて変換 (ステップ 4.5) の予定日、植物からすべての成熟と発展途上の siliques を削除します。

2. 植物形質転換のベクトルへのクローニング目的の遺伝子/ゲノムの要素

  1. ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)17と分離ゲルの抽出を使用して PCR の製品はキット (材料の表を参照) を使用してターゲット DNA のフラグメントを増幅するキットのプロトコルまたは agarose のゲルを用いた DNA を浄化するために他の適切な方法によると電気泳動17,18。サンガー シーケンス19を通じて分離の PCR の製品のシーケンスを確認します。
  2. クローン クローニング ベクトルと有能なエシェリヒア属大腸菌に複製された構成細胞のトポイソメラーゼに基づくクローニングを使用してトランス フォームに目的の PCR の製品はキット (材料の表を参照してください) の製造元のガイドラインに従います。
  3. ルリア ベルターニカミラ20 (LB) 寒天細菌の成長媒体 (表 1)、適切な抗生物質で変換された製品の 50 μ L を広める例えば.、 50 μ g/mL スペクチノマイシン (材料の表を参照)、37 ° で孵化させなさいとC 一晩。
  4. 次の日、5-10 の単一コロニーを選択、適切な抗生物質で液体の LB 培地に接種して一晩 37 ° C で穏やかな揺れで孵化させなさい。
  5. プラスミドの分離を使用して特定のプラスミド キット (材料の表を参照してください) 2.1 増幅ターゲット シーケンスが正しく複製かどうかサンガー シーケンス19を通じて確認してください。
  6. クローンと確認された PCR の製品を移動リコンビナーゼ酵素ミックスを使用してキット (材料の表を参照)、次の植物形質転換再結合に基づく (材料の表を参照してください) のクローニングと互換性の宛先ベクトルへキット メーカーの説明書。手順 2.3 から 2.5 を特定し適切なプラスミッドの構造をかくまっているクローンを確認の手順を繰り返します。

3. ベクター構築工場変換のために変換アグロバクテリウム

  1. A. 根頭がんしゅ病菌系統 GV3101:pMP90RK21, 染色体背景選択リファンピシン耐性遺伝子を庇護に 2.6 からベクターのコンストラクトのプラスミドを変換します。適切な抗生物質、ゲンタマイシン、カナマイシンなどを使用 (材料の表を参照)、植物の選択の変換を構築 (Ti プラスミド)。エレクトロポレーション経由A. 根頭がんしゅ病菌の変換のための簡単なプロトコルは、セクション 3.2 に含まれます。
  2. A. 根頭がんしゅ病菌電気穿孔法による変換
    1. A. 根頭がんしゅ病菌の有能なセル22氷の上を解凍します。2.6 から調製したプラスミドのミックス 0.1-1 μ g は、ddH2O、氷の上の有能なセルを 1-2 μ L に溶解しました。エレクトロポレーション キュベットに混合物を転送 (材料の表を参照してください)。
    2. プラスミドと 3.2.1, 使用して、遺伝子導入装置からの有能なセルの混合のエレクトロポレーションを実行 (材料表参照) 製造元のガイドラインに従います。
      注:キュヴェットの表面をきれいに、エレクトロポレーションを開始する前に。
    3. キュベットから液体 lb 1.5 mL を含む微量遠心チューブに反応混合物を転送、ピペッティングでよく混ぜるし、穏やかな揺れで 28 ° C で 1 時間インキュベートします。
  3. 適切な選択の抗生物質を含んでいる LB の版の 3.2 項から変換されたA. 根頭がんしゅ病菌を接種する (例えばカナマイシン 25 μ g/mL、スペクチノマイシン 50 μ g/mL、ゲンタマイシン 25 μ g/mL とリファンピシン 50 μ g/mL) と 3 日間の 28 ° C の孵化させなさい。

4. S. parvulaのアグロバクテリウム仲介された変形

  1. 単一の変形を予防接種 10 mL 滅菌 50 ml の円錐形 (3.3 と同じ) 抗生物質を含む LB 液体媒体にプレートからコロニー チューブ (材料の表を参照してください)。揺れのインキュベーターで 24 時間インキュベート (材料の表を参照) で 28 ° C で 250 回転数。
  2. 3.4.1 から滅菌 250 mL フラスコに細菌のソリューションを転送、適切な抗生物質で LB 液体媒体の 40 mL を加えて、600 nm の波長 (外径600) の光学濃度が 2.0 前後まで 12 時間を孵化させなさい。
  3. A. 根頭がんしゅ病菌cultureat 3,100 x gで 10 分間削除の上清を遠心し、再A. 根頭がんしゅ病菌の浸透液 (表 1) の 40 ミリリットルで細菌培養を中断します。
  4. 最終的な OD600 0.8 の浸透ソリューションを再懸濁A. 根頭がんしゅ病菌を希釈します。界面活性剤溶液 (表 1) 25 μ L に 50 mL の希釈A. 根頭がんしゅ病菌の追加ソリューションと複数回の反転でミックス。
  5. 6 ポットから花序を浸漬した後 20 s. 使用新鮮な細菌のソリューションのセクション 4.4 で準備A. 根頭がんしゅ病菌ソリューションにおける植物の花序をつけます。すべての花は、ソリューションと接触していることを確認します。彼らは溶液に浸漬することができない場合、花序の下の部分にある花に直接細菌の解決をピペットで移しなさい。
    注:第 1 ラウンドの変形のため、鋭いメスやハサミを使用してすべての成熟と発展途上の siliques を削除することを確認します。2 度目の変換を実行する場合は、siliques を削除しないでください。

5. 変換後植物ケアと 2 番目の変換

  1. 植物をカバーし、1-2 日間の暗い成長部屋にドームときれいなトレーに花に浸した植物を水平方向に配置します。
    注:(図 1変換後の植物) この段階では、高湿度下の花を保つことが重要です。
  2. 植物を直立位置に戻すし、植物を 14 h/日/10 h あたりの夜のサイクル、130 µmol m-2の-1光強度および 22 に 24 ° C の温度で成長室に転送します。
  3. 次の週に浸した花房を監視します。花のかなりの数は、(図 2) を中止する場合は、約 4 週間後または花の数が多いを新しく開発した後花のすくい (手順 4) を繰り返します。
    注:(ステップ 1.3.7) の最初の変換のための準備のステップとは異なりには、変換の第 2 ラウンドの前に既存のまたは siliques (図 2) の開発を削除しないでください。
  4. 種子成熟 〜 21 週に種子を収穫し、植物を育てます。
  5. 室温で気密の容器で 2-3 週間乾燥した種子は、乾燥剤 (材料の表を参照) でいっぱい。

6. 肯定的な形質転換体の選択

  1. 手順 1.2 への 1.3 で野生型種子のとおり T1 種子を植えます。
  2. 2 最初の真の葉を開発、約 10-14 日後発芽するまでは、植物を育てます。
  3. 除草剤としての抵抗 (図 3A と 3 b) 詳細下記の最初の選択項目を実行します。
    1. 除草剤グルホシネート アンモニウム (11.3%) (またはバスタ) を希釈 (表 1) 縮尺 (v/v) します。苗バスタの希釈液をスプレーし、一晩ドームが付いている植物をカバーします。
    2. バスタの 2-3 回の噴霧を繰り返すごとに 5-7 日。
  4. 下記のとおりバスタ ドロップ テストを使用して 2 番目の選択を実行します。
    1. バスタのソリューション 3-4 回噴霧された後生き残る植物を識別します。3-5 葉は比較的大きな表面積を開発するまで別の 2-3 週間の植物を育てます。
    2. 工場あたり最大の成熟した葉を [ワックス層を除去する指で軽く葉の表面をこする (ステップ 6.3.1) から希釈バスタ液一滴を配置します。
      注:最寄りの幹に紙テープを置くことによってバスタ ドロップで適用される葉の場所をマークします。
    3. 1 週間萎れの兆候をバスタ ドロップで適用される葉を監視します。バスタの低下によって影響を受けていない葉を持つ植物を選択します。
      注:最も偽陽性植物からの葉は、バスタ溶液の一滴が (図 3C) を乾燥した後も、真陽性からの葉はそのまま、2 日以内萎凋を開始します。
  5. ゲノム PCR を使用して肯定的な形質転換体を確認します。
    1. 6.4.5 のステップ時に生き残った植物から 2-3 の葉を収集します。
    2. CTAB 法23またはその他の適切な DNA 抽出法を使用して葉から DNA を抽出します。
    3. (ポジティブ コントロール) として対象植物、野生型植物 (マイナス コントロール) として、ステップ 3.1 からプラスミド構築から抽出したゲノム DNA のサンプルを使用して PCR を実行します。適切な選択マーカー遺伝子特定の PCR のプライマーのペアを使用して、例えば、バスタ耐性遺伝子 (バー)、TCAGCAGGTGGGTGTAGA (フォワード) と GTCAACCACTACATCGAGACAA (リバース)。
      1. 例、PCR のプライマーを使用してバー遺伝子をターゲット以下の PCR 条件: 30 98 ° C で初期変性のステップ s;30 98 ° C での変化のサイクル 30 回続く 30 59 ° C で熱処理 s s、および 30 のための 72 ° c を拡張する s;72 ° C、5 分で最後の拡張。
        注:全体の T-DNA 挿入するように、また選択マーカー遺伝子の PCR プライマーを用いたゲノム pcr 法を実行することをお勧めします。 とターゲット シーケンスに固有の別の PCR プライマーの段階で工場変換ベクトルにクローンを作成
    4. Agarose のゲル電気泳動法17ターゲットのサンプル (図 4A) および使用して孤立した PCR 製品19シーケンスによって増幅されたバーの PCR の製品の予想されるサイズの存在を確認します。手順 2.1 と同じ作業です。

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結果

シロイヌナズナの変更から花のすくいメソッドを使用して、150 日以内 T0種子の収穫を可能にする変形のプロトコルを開発しました。図 1は、タイムラインと花のすくいを通じて変換を実行するための最適なステージを表すs. parvula植物の概要を示しています。変換のためのターゲット段階として発芽後 60-80 日で複数花序S. parvula 70 –80 の花を持つ植物を選択しました。少数の既存のオープンまたは受精花とこの段階で siliques は、花ディップ法によるA. 根頭がんしゅ病菌の浸透する前に削除されました。A. 根頭がんしゅ病菌の感染は、いくつかの花 (図 2ブラケット (a)) の中絶で起因しました。Siliques は、完全に花ディップが変換された種子 (図 2ラケット...

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ディスカッション

植物の生理学的状態は、変換25の効率を大きく影響します。変換のための健康で、積極的な植物の使用は、 S. parvulaの正常な変形のための重要な要件です。水または重点を置かれた植物の光変換 (図 1、センター パネル) の理想的な健康な植物と比較して少ない花を持ちます。光強度で育てることができるS. parvula未満 130 µmol m-2の-1、しかし植物 frailer; する傾向があります。そのような植物はより多くにつながる花のすくい、次の花を中止します。S. parvulaアグロバクテリウム浸した花よりも高いレートを中止する傾向があるa.したがって、すべてのステップA. 根頭がんしゅ病菌の浸透溶液浸漬するとき中止された花を最小限に抑えることは、高い変換効率に貢献します。1 日あたりの 14 時間よりもはや光期間をお勧めします。多くの場合、シロイヌナズナの変換は、長日条...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、全米科学財団賞 MCB 1616827 によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
寒天VWRインターナショナル、ラドナー、ペンシルバニア90000-762バクト寒天販売剤、BD診断
B5ビタミンシグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州G1019Gamborg's ビタミン溶液
乾燥剤W A Hammond Drierite, Xenia, OH22005Indicating DRIERITE 6 mesh
植物形質転換の目的地ベクトルTAIRベクトル:6531113857pKGWFS7
エレクトロポレーションキュベットUSA Scientific9104-5050エレクトロポレーションキュベット、丸キャップ、0.2 cm
ギャップ エレクトロポレーターBIO-RAD Laboratories, Hercules, CA1652100MicroPulser Electroporator
肥料Osmocote Garden, Marysville, OHN/AOsmocote Smart-Release Plant Food フラワー&野菜
ゲル抽出キットiNtRON Biotechnology, Boston, MA17289MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit
GentamicinSigma-Aldrich, St. Louis, MOG1914-5Gゲンタマイシン硫酸グル
ホシネート-アンモニウム (11.3%) 除草剤 (BASTA)Bayer environmental science, Montvale, NJN/AFINALE 除草剤
カナマイシンVWR インターナショナル,Radnor, PA200004-444Kanamycin monosulfate
MESBioworld, Dublin, OH41320024-2MES, Free Acid
MS saltMP Biomedicals, Santa Anna, CA092621822Hoagland's modified basal salt mixture
N6-benzylaminopurine (BA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MOB32746-ベンジルアミノプリン溶液
NaClSigma-AlrichS7653塩化ナトリウム
非イオン性洗剤Sigma-Aldrich, St. Louis, MO9005-64-5TWEEN 20 
プラスミド分離キットZymo Research, Irvine, CAD4036Zyppy Plasmid Kits
Recombinase enzyme mix kitLife Technology11791-020Gateway LR Clonase II Enzyme mix
RifampicinSigma-Aldrich, St. Louis, MOR3501-1GRifampicin, powder, ≥97% (HPLC)
振盪インキュベーターThermoFisher Scientific, Waltham, MASHKE4450MaxQ 4450 ベンチトップ オービタルシェーカー
ソイルミックスSun GroSUN239223328CFLPSun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix
SpectinomycinVWR International, Radnor, PAIC15206705
滅菌済み 50 mL コニカルチューブUSA Scientific, Ocala, FL1500-181150 mL コニカルスクリューキャップチューブ、コポリマー、ラック、滅菌ス
クローVWR International, Radnor, PA57-50-1スクロース、ACS
界面活性剤溶液Lehle seeds, Round Rock, TXVIS-02Silwet L-77
トポイソメラーゼベースのクローニングキットLife Technologies, Carlsbad, CAK240020pENTR/D-TOPO クローニングキット、ワンショット TOP10 ケミカルコンピテント E. coli
トリプトンVWRインターナショナル、ラドナー、ペンシルバニア州90000-282BDバクトトリプトン、BDバイオサイエンス
酵母エキスVWRインターナショナル、ラドナー、ペンシルバニア州90000-722 BDバクト酵母エキス、BDバイオサイエンス
州ビーズ ス

参考文献

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