コアと N₂O マイクロ センサーを使用して土砂脱窒率を推定

窒素循環の人為的な変化は、地球システムの¹の最も困難な問題の一つです。人間の活動は、バイオスフィア²に利用可能な窒素酸化物のレベルを少なくとも倍増しています。ただし、グローバルの N サイクルの評価方法に関する大きな不確実性が残っています。誤差 ± 20%、以下いくつかフラックス推定を定量化しているされて、多くは ± 50% と大きく³の不確実性。これらの不確実性は、生態系変動メカニズムの理解、脱窒速度の正確な推定のための必要性を示します。脱窒は、窒素酸化物、硝酸、亜硝酸、主が減り、窒素ガス、N₂O および N₂⁴に微生物の活動です。経路は、除去⁵の主なプロセスだから反応性窒素の生物圏の可用性に関連性の高いです。N₂O は、温室効果ガスの地球温暖化の潜在性のほぼ 300 回 co₂ 100 年、それは大量放出^6,7をされているため成層圏オゾン層破壊の現在の主な原因。

以下では、堆積物の脱窒率実験コアと N₂O マイクロ センサーを使用して (図 1) を推定するためのプロトコルを提案します。脱窒速度の推定には、アセチレン阻害法^8,9と (図 2および図 3) に定義された期間中に N₂O の蓄積の測定を使用しています。山湖堆積物にそれを適用することによってメソッドを示します。このケース スタディは、堆積物の物理的な構造の攪乱を最小限で比較的低料金の自動検出法の性能を強調表示します。

脱窒は¹⁰を測定する特に困難です。いくつかの代替的なアプローチと方法は、それぞれ長所と短所があります。利用可能な方法の欠点、高価なリソース、十分な感度と基板レベルを変更したり、妨げられたサンプル¹⁰を使用してプロセスの物理的な構成を変更する必要があります。N₂を測定するさらにもっと基本的な課題は、環境¹⁰上昇背景レベルです。N₂N₂ O の削減は、アセチレン (C₂H₂)^8,9によって阻害されます。したがって、脱窒は環境 N₂O レベルが低いため可能な蓄積された N₂O C₂H₂の存在下での測定によって定量化することができます。

C₂H₂堆積物における脱窒率を測定するための使用が開発された約 40 年前¹¹、および N₂O センサー定款発生した約 10 年後¹²。最も広く適用されるアセチレン ベースのアプローチは、「静的コア」です。蓄積された N₂O は、C₂H₂が封印された堆積物コア¹⁰のヘッド スペースに追加された後、24 h までの潜伏期間中に測定されます。ここで説明する方法いくつかの技術革新とこの手順に従います。我々 はいくつかの分のコアの水の段階でガスをバブリングによって C₂H₂を追加、我々 は N₂O マイクロ センサーとの蓄積を測定する前にサンプル水とすべてのヘッド スペースを埋めます。我々 は、堆積物を再することがなく水の成層を防止する攪拌システムがあります。プロシージャを定量化堆積物表面積あたりの脱窒速度 (例えばµmol N₂O m^-2 h^-1)。

脱窒の高時空の変化は、その正確な数量¹⁰で別の難易度を示します。通常、N₂O の蓄積は、孵化中に収集されるサンプルをヘッド スペース ガスクロマトグラフィーによって順番に測定されます。説明した方法は、マイクロ センサーは、連続的な信号を提供するため、N₂O 蓄積の変化の監視機能の向上を提供します。マイクロ センサー マルチメータは、インターフェイスをセンサーとコンピューター (図 1、) デジタル マイクロ アンプ (picoammeter) です。マルチメータは、同時に使用するいくつかの N₂O マイクロ センサーをことができます。例えば、4 つの底まで同じ研究サイトからコアが同時測定可能空間の可変性をアカウントに。

中核的なアプローチは、堆積構造のいくつかの他の方法 (例えばスラリー) と比べてほとんど妨げます。堆積物の整合性が変更された場合、これはあくまで相対的な比較に適切な非現実的な脱窒率¹³につながります。後者基板拡散¹⁵によって脱窒の制限が保持されますので、率が高い、常にコア メソッド¹⁴に比べてスラリー法が得られます。スラリー対策は、その場で料金¹⁶; の代表を考慮することはできません。彼らは正確に同じ手順で作られて比較のための相対的な時間を提供します。

記載されているメソッドは芯が土砂タイプで脱窒率を推定するためです。特に、いくつかの運転の要因の実験的操作の実行方法をお勧めします。例としては、硝酸可用性とエネルギーの活性化 (E_、) 脱窒¹⁷ (図 2) を推定するため必要に応じて温度を変更する実験です。

図 1: 実験のセットアップ。コアと N₂O マイクロ センサーを使用して土砂脱窒率を推定する (、) 一般的な実験のセットアップ。培養室は、闇と制御温度 (± 0.3 ° C) の条件を確保します。5 そのまま堆積物コアは、同時に彼らのそれぞれの N₂O センサーを使用して処理できます。(b) N₂O センサー校正室。ゴム栓と N₂O の水を混ぜて注射器適応我々 (プロトコル手順 3.4.3 参照)。水の温度を制御する温度計があります。(c) センサーと底質コア試料のクローズ アップは、PVC カバーと粘着テープで密閉接合部の中央の穴に挿入。水のかくはんがぶら下がっていると電磁石が、それに近い、アクリル管の外部の部分に固定します。(d) N₂O マイクロ センサーのクローズ アップのヒント金属片によって保護されて。(e) 堆積物コア回収されてちょうど。それは、深い湖でボートから採取コアでは、アクリルのパイプはメッセンジャー適応重力ピストンコアラー¹⁹にまだ固定されます。このメソッドを実行するために必要なすべての項目のための材料表を参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

1. 準備

注: 測定は前日にこれを開始します。

1. 測定セットアップを組み立てる (図 1、材料の表を参照してください)。
   注意: 定数と高品質の電力供給のため、経由でグリップに接続は測定デバイス バックアップとして機能することができますも無停電電源装置 (UPS) です。長時間の停電の場合、車のバッテリーは、余分な電源として機能します。
2. センサーのソフトウェアを起動して適用-0.8 V N₂O マイクロ センサーを分極する電圧。信号は急速な降下およびそれに続く上昇を示し、それが最終的には低く、安定まで減少します。
   注: マイクロ センサー製造元が推奨する偏波、少なくとも一晩 (またはそれ以上) センサーの信号の安定性を確保します。別の勧告は偏光測定が複数計画されて場合センサーを保つためにまたは日連続¹⁸。
3. インキュベーション室と実験条件を調整する(例えば、選択したライトをオフ、フィールドで期待に類似する設定温度) に切り替えます。チャンバー内脱イオン水を容器に置き、水は測定温度センサーの校正に後で利用できます。
   注: この手順のコアを収集するために出発前に計画の測定の同じ日を行うことができます。標準的な測定は、暗い条件を使用することをお勧めします。
4. パックのフィールドのコア資料: ピストンコアラー デバイス、サンプリング チューブ、ゴム栓、ポリ塩化ビニル (PVC) タップ、ドライバー、グローバル ポジショニング システム (GPS) 装置、温度計、携帯魚群探知機、歩く人、および膨脹可能なボート (テーブルを参照してくださいの材料)。チェックリストを使用すると、すべての材料が含まれていることを確認します。

2. 堆積物コアのコレクション

1. 水の深さに応じて 2.1.1 または 2.1.2 に従ってください。
   1. 深い水域の
      1. ボートやプラットフォーム (図 1e) からメッセンジャー適応重力ピストンコアラー¹⁹を使用します。
      2. サンプリング チューブを修正 (アクリル、ø 6.35 cm、長さ ≥ 50 cm) ドライバーで芯抜き器に。
      3. 調査目的に応じてサンプリング ポイントを選択します。(例えば、GPS 座標を使用して) の位置の測定深さ (例えば、携帯魚群探知機を使用して) 注意してください。ボートからサンプリング、コア コレクション中に漂流を避けるために (例えば、石袋) アンカーを使用します。
      4. サンプリング チューブが堆積物から 〜 1 m まで掘削システムを展開します。サンプリング装置の深さ位置を制御する (例えば、1 m 間隔) 正規のマークでロープを使用します。
      5. 60 のサンプリング装置を安定させる s (例えばボートの動きを最小限に抑える)。これは、正しい土砂侵入とやっとのことで妨げられた堆積物コアの回復が保証されます。
      6. サンプリング チューブ貫通堆積物解放、~ 1 m をさらにロープに。サンプリング チューブはあまり浸透し場合、は、水/土砂インターフェイスを乱すことがそれに注意します。
      7. 芯抜き器が固定されたまま、ロープの張力を維持しようとしながら、垂直にメッセンジャーをリリースします。メッセンジャー、芯抜き器に影響を与えるとき、は、ロープの張力の小さな違いを感じることができます。その時、芯抜き器堆積物コアの回復のための真空を生成するを閉じます。
      8. 常に、ゆっくりロープを引いて、芯抜き器を回復します。
      9. 一度コアが表面に近いが、まだ完全に水没 (真空により芯抜き器のゴム部分を含む) は、試料採取管の下部にゴム栓を配置します。水/土砂インタ フェースを検査します。それはクリアされ、目に見えていない (図 1e) を邪魔しました。場合はない場合は、コアを破棄、チューブを洗浄、手順 2.1.1.4-9 を繰り返します。
      10. 水からコアリング システム全体を高揚させます。芯抜き器からサンプリング チューブを解放し、PVC カバーを上に配置します。それを粘着テープで封印します。空気空間の形成を避けるため。
   2. 沿岸生息地や浅い水域の
      1. 非常に浅い海域でサンプリングの歩く人の服装 (< 0.6 m)。
      2. 深いサンプリングのシュノーケ リングやスキューバ ダイビングのギアを使用 (最大 3 m)。
      3. 調査目的に応じてサンプリング ポイントを選択します。(例えば、GPS 座標) の位置の注意してください。手動で、試料採取管を挿入 (例えば、アクリル、ø 6.35 cm) 堆積物に。
      4. 真空を得るにサンプリング チューブの上面にゴム栓を配置します。
      5. 堆積物からコアを外し、チューブ下部に別のゴム栓を迅速に紹介します。
         注: すべての回でチューブを水中で動作する必要があります。非常に浅いサイトで短縮 20 cm ダウン チューブをお勧めします。時々 底に高水内容があり排水土砂ベッドからチューブが削除されます。この場合、底外側のコアを高揚することがなく下部ストッパーを導入する必要があります。これを行うには、手動で管の周りの土砂でストッパーに没頭し、チューブの底を閉じるに慎重にそれを配置します。
      6. 水の代わりに PVC カバー付きトップサイド ゴム栓と粘着テープとの接合部のシールします。
2. 回転を最小限に抑え、揺れによって研究所へ転送される間にコアを保護します。

3. 亜酸化窒素 (N₂O) マイクロ センサーのキャリブレーション

1. センサーの信号が安定しており、ことを確認コンピューター (ストリップ ・ チャート、センサー ・ ソフトウェア) を使用して (< 20 mV)。
2. 校正値とセンサーの信号を記録する (例えば日付とサンプリング サイト (130903_Redon_Lake) で) 新しいファイルを作成します。
   注: センサーの信号 (図 4) の温度に敏感です。測定とセンサーのキャリブレーションのための同じ温度を使用します。センサーは 0%-2.5% N₂O²⁰線形応答します。したがって、2 点校正は十分な¹⁸です。
3. キャリブレーション値ゼロの笑気と、センサー先端部を維持するセンサー信号水没 N₂O 無料水 (純水) を読みます。
4. 望ましい集中で N₂O の水とを調整します。
   注: 定義された N₂O 濃度を潜伏中に予想される最大の濃度を多少上回ると水を準備します。私たちは、校正値として 〜 25 μ M N₂O を使用します。500 N₂O μ m 最大センサー範囲濃度を超えない注意します。
   1. 取得 N₂O 飽和水バブル N₂O に脱イオン水に数分間。
      注: N₂O の水容解性によって異なります水温・塩分²¹;センサー マニュアル¹⁸付録の表を参照してください。
   2. N₂O の飽和量を脱イオン水のボリュームに追加することによって N₂O の飽和水を希釈します。たとえば、20 ° C で 28.7 mM N₂O は、375 mL の水、22.9 μ M N₂O 濃度の合計の濃度がある飽和 N₂O 水の 0.3 mL を追加します。メモその 375 mL は、校正室 (図 1b) の総ボリュームです。
   3. 優しく N₂O を混合した後希望の濃度に希釈するキャリブレーション容器内の脱イオン水で飽和水は一定だとセンサー信号を読みます。これを読んで、 X µM N₂O の水と校正値です。溶液の混合しているとき、は、N₂O 校正ソリューションからなくなるように、泡を生成しないように注意します。
      注: N₂O の水は、空気の中にエスケープゆっくりことを注意したがって、準備された校正ソリューションは、数分間だけ使用できます。

4. コア ・準備、アセチレン阻害

1. ポリ塩化ビニール カバーの変更をぶら下げマグネチックスターラーと中心の穴に別のカバーによって各堆積物コアの上部にあります。再粘着テープとの接合部をシールします。
2. 12 cm のおおよその高さに各サンプルの水相を減らす (ボリューム ≈ 380 mL)。このため、まず、中央の穴にシリコン チューブを挿入します。円柱の堆積物コアを配置し、圧力を作成するボトムのボタンをプッシュします。ストッパーおよび堆積物のサンプルが上がるし、余分な水をチューブ内を通過します。受け側容器の中の水を収集します。
   注: この手順中に粒度の粗いとサンプルが問題があります。ストッパーとチューブの間に堆積物の粒子はストッパーを変形し、空気泡は渡して、サンプルを邪魔できます穴を開くできます。この問題を避けるためには、下部ストッパー部にシリンダーを置くし、一定の力でプッシュしてみてください。余分な水を避難させるためのシリコン チューブのジョイントと PVC カバー シリコン チューブに挿入されます (例えば、その狭い終わりのない 5 mL ピペット チップ) 固体部分で構成されています。
3. 約 10 分のコアの水相のアセチレン ガスをバブリングによってアセチレン阻害を実行します。再堆積物は避けてください。
   メモ: メソッドの可能な変更は、追加基板 (硝酸) 高濃度液体培地を介してバブル前に潜在的な脱窒測定 (例えば図 3b、cのように) アセチレン。

5. 脱窒素 (N₂O 蓄積測定)

1. 前の残り水でサンプルのすべての空気スペースを埋めます。トップサイド PVC カバーの中央の穴を堆積物にセンサーを配置します。攪拌機 (図 1c) 上記水段階でセンサーの先端にあります。
   注: アクリル試料採取管のすべての関節を測定 (図 1、c) の中にガスと水漏れを避けるために密封されなければなりません。管の下の部分のゴム栓はこれに対して十分です。トップサイド部分をシールすることは難しくなります。PVC カバーを調整する必要があります。トーチで加熱する必要がありますその後、素材に柔軟な焦げがない場合は、カバーはその形状を成形することができますので、チューブに配置されます。冷却した後、カバー (を除いて 2.1.1.10 または 2.1.2.6 手順で研究室にサンプルを輸送するために使用カバー) の変更が必要です。センサーが挿入されて中央の穴を掘削する必要があります。順番は癒着して接着剤カバーの内側に水 (図 1c) の釣り糸にハングアップする、攪拌、釣り糸でかくはんを保持できます。また、すべての関節 (PVC カバー チューブや PVC カバー センサー) は、粘着テープでシールされています。ポリ塩化ビニール カバーの中央の穴とセンサー (図 1c) 間の表面接触をシールするためにセンサーの直径を調整する伸縮性粘着テープを置きます。
2. 攪拌システムの一部である電磁パルス回路に切り替えます。
   注意: 攪拌システムの妨害 (再) なし水相の成層を防ぐ堆積物。攪拌システムは磁気攪拌の魅了/リリースする電磁石のオンオフのスイッチ回路で構成されています (詳細については材料の表を参照してください)。
3. 粘着テープ (図 1c) を使ってその場で固定し、かくはんが連続的に移動するまで、アクリル管の外部の部分のまわりの電磁石を移動します。
4. 一定の温度 (例えば、± 0.3 ° C の変化) を確保するため培養室を閉じます。
5. センサー信号の記録を開始するレコード ボタン (センサー ソフトウェア) を押します。測定値は通常、5 分ごとに記録されます。
6. 測定期間の終わりに停止ボタンを押します。

6. 最終的な測定手順

1. 無料の N₂O 水 (純水) ゼロの N₂O の校正測定の信号を読む前に沈んでセンサーの先端で少なくとも 〜 10 分を待ちます。
2. 最終的なセンサーのキャリブレーションを実行します。これは、センサーのキャリブレーションは、次のセクション 3 が、3.3 のステップに開始を繰り返します。
3. (センサー ソフトウェア) ファイルを保存します。

7. 脱窒率の計算

1. MV と μ N₂O は、校正データにおけるセンサーの信号の記録を含んでいるセンサー ソフトウェアによって生成された集計出力ファイルで開始します。
2. (例えば図 2は) N₂O の蓄積傾向を可視化する時間とセンサーの信号をプロットします。
3. 線形の蓄積サンプルと基板の制限 (例えば図 2のb) のための可能な最終的な彩度の初期の馴化期間を除く期間だけを使用します。時間 (h) をかけてセンサー信号 (μ M) の線形モデルを作成します。
   注: 斜面は脱窒速度 (μ M N₂O コア^-1 h^-1)、μ M N₂O m^-2でレート変換コア (πr²) の面積で分割されている場合 h^-1で乗算されるときと、水量 (πr²h、 hは水層の高さ、 rはアクリル チューブの内側の半径この場合 0.12 m、0.03175 m、それぞれ) µmol N₂O m^-2でレートに変換h^-1。

468 脱窒率の合計は、期間 2013-2014 ピレネー山脈山湖堆積物中の上記プロトコルを使用して推定しました。(図 2および図 3) 手順を説明するためにこれらの結果のいくつかを紹介します。一般に、N2O 濃度と時間の線形モデルは良い相関 (R2 ≥ 0.9) を持っています。斜面関係の脱窒速度 (ステップ 7.3 の見積もりを提供します。例えば図 2のd)。脱窒活性が非常に低い場合、センサーの電子ノイズがより重要になるし、の適合度が低下 (例えばセンサー図 2 b 、図 3 aの 4 と 5)。N2O のベースライン検出限界は ~0.1 μ M 水22、中間体である代替方法23ノイズをフィルター処理する観測の蓄積の何千もの可能性に関する値1 ~ µmol N2O m-2までの比較的低い脱窒率で推定を許可 h-1 (図 2と図3)。低金利 (すなわち、 ~0.4 µmol N2O の m-2 h-1) 8 cm の高さにコア試料の水相を狭くすることによって推定することができます (プロトコル手順 4.2 参照)。

図 2: 温度依存性の実験では脱窒率計算します。(Aとb) の実績および潜在的な脱窒の測定 (c-f) が表示されます。測定温度が低下 (c)、最初のサンプルの冷却と温度依存は、センサーの信号は低下します。実際脱窒の測定で培養開始時 (、) A の同様のイベントが発生します暖かい所環境においては培養条件は、センサー信号の減少が伴うサンプルの冷却を生成します。(e) 温度の増加、最初サンプルを暖めるし、センサー信号は線形ではなく指数関数的に増加します。サンプルが一定の温度に達したら、センサー信号がいつものように線形増加します。すべてのケースで単線形 N2O 蓄積 (b d、および f) の期間を使用して脱窒率を計算することが可能です。(b) 非アクティブ サンプル 3 は表示されません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 脱窒の例率計算します。実績 (、) および潜在的な (bとc) 脱窒率を推定しました。線形 N2O 累積時間範囲を使用されるのみ脱窒速度 (線形モデルの斜面) を計算します。ただし、(、) の教育目的のためより少ない成功とすべての測定 (モデル) を表示我々 はセンサーとサンプル 2 N2O 蓄積の飽和のための高い不安定なため 3 サンプルを破棄します。4 および 5 (、) のサンプル率の 0.5 と 0.7 µmol N2O m-2 h-1、それぞれが測定法の検出限界に近い場合。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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