このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

選択したプロウイルス統合サイトの HIV-1 感染の Jurkat レポーターのモデルを生成する CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学

9.1K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/58572

⸱

2018年11月14日

 ,  ,  , 
1Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology, 2Department of Anesthesiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 3German Center for Infection Research (DZIF)

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

プロウイルス選択したゲノム サイト統合を要約 HIV-1 感染の新しい体外モデルの生成のゲノム工学ワークフローを提案します。記者の HIV 由来のターゲットは、CRISPR Cas9 媒介、サイト固有のゲノム操作によって促進されます。単一細胞クローン生成、スクリーニング、および正しいターゲットの検証のための詳しいプロトコルを提供しています。

要約

ひと免疫不全ウイルス (HIV) は、再発のサイトやゲノムのホット スポットでホスト細胞のゲノムに非ランダムにプロウイルス DNA を統合します。ここで CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学技術を使用して選ばれたゲノム統合サイトと HIV 感染の新規の in vitro モデルの生成の詳細なプロトコルを紹介します。この方法では、選択の記者のシーケンスに統合できます、選択したターゲットを絞った genomic 位置臨床的に関連する統合サイトを反映しています。

プロトコルでは、HIV 由来の記者の設計およびターゲット サイトと gRNA シーケンスの選択を説明します。両手を相同性ターゲット ベクトルが構築され、Jurkat T 細胞にトランスフェクションします。ターゲット ・ サイトで Cas9 を介した二重鎖切断によって促進される相同組み換えによる記者シーケンスは選択したゲノム サイト向けです。単一細胞のクローンを生成およびフローサイトメトリー PCR によって対象化、イベント上映します。選択されたクローンが展開し、PCR、シーケンシング、および南にしみが付くことによって検証は正しいターゲットします。CRISPR Cas9 を介したゲノム工学の潜在的なターゲットを離れてイベントが分析されます。

このプロトコルは、新しい細胞培養システムを用いた臨床的に関連する統合サイトでそのモデルの HIV 感染を生成できます。正しい記者シーケンス統合の単一細胞クローンの生成と検証は時間がかかるが、結果として得られる系統、機能的プロウイルス統合サイトの選択を分析するための強力なツールです。

概要

感染宿主ゲノムにプロウイルス DNA の統合は、ひと免疫不全ウイルス (HIV) のライフ サイクルの重要なステップです。次の統合、HIV はメモリー cd4 陽性 T 細胞など寿命の長い cd 4 + T 細胞のサブセットの遅延を確立することによって永続化します。HIV の統合は、非ランダムな1,2に表示されます。急性と慢性感染した人2,3,4 の統合サイトのシーケンスを通していくつかの研究で反復的統合のプロウイルス DNA ゲノム ホット スポットの数が検出されました、5,6,7,8。興味深いことに、これらの統合サイトのいくつかで同じ軌跡がリカレント サイトの統合も積極的にクローン性増殖1に影響を与える可能性があります考えにつながる、感染細胞の大部分で検出されました。

再発統合サイトの意義の理解を進めるためプロウイルス統合サイトの選択肢を検討する必要があります。ただし、いくつかの技術的な側面を妨げる勉強 HIV 統合サイトの選択と結果。JLat 細胞株は臨床的再発統合サイト9を反映していないような広く HIV 待ち時間の細胞モデルを使用しました。プライマリ患者由来細胞の研究、一方で、配列による統合サイト風景の説明を有効にするが、機能解析を可能にしません。我々 の知識に十分な実験モデルは機能的選択した臨床的に関連する統合サイトを分析する利用可能なありません。

CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学技術を使用して HIV 感染のための新しいモデルを生成するための詳細なワークフローをご紹介します。ここ記載されているワークフローは、モデル選択した統合サイトで genomically 統合プロウイルス記者を運ぶ HIV 感染 T 細胞由来のレポーター細胞ラインを生成する使用できます。彼らしたがってプロウイルス統合サイトによる hiv 感染生物学への影響し、provirus が別の治療戦略 (待機時間逆転エージェントによる,誘導など) に応答する方法を探索する新しいツールとして提供しています。本手法は、CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学、ターゲット ・ サイトで、Cas9 ヌクレアーゼ誘起の二重鎖切断によって促進される相同組み換えによるシーケンス レポーターの統合の利点を使用します。ターゲット ・ サイトの統合には、HIV 感染者と Cas9 を介したゲノム工学のための適したの PAM モチーフの存在に関する研究から説明再発統合サイトへの近さによって判断されます。

模範的な結果、BTB および CNC の相同性転写レギュレータ 2 のコード BACH2 遺伝子座に注力します。抗レトロ ウイルス療法に慢性的な HIV 感染、個人で BACH2 は統合された HIV-1 シーケンス3,6,7,8,10の濃縮を示す遺伝子座であります。BACH2 イントロン 5 の 2 つの特定のサイトにしようと思いましたが HIV 由来 1 長いターミナル リピート (左から右)、tdTomato コーディング シーケンスとウシ成長ホルモン (BGH) 起こる信号 (PA) から成る最小 HIV 由来の記者をしました。提案するプロトコルは、Jurkat 細胞、ヒト cd4 T 細胞由来の懸濁液セル行が線を使用して他のセルおよびそれに応じて適応プロトコルに最適です。相同性の腕、CRISPR-Cas9-介したレポーターのターゲットに選ばれたゲノム サイト、世代クローン系統の選抜に、包括的な目標点のベクターの構築対象サイトの選択の詳細なワークフローを提案する検証新しく生成された、対象となるレポーター細胞。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1. ゲノム工学とベクトル (テレビ) の設計をターゲットに戦略をターゲット

注:ゲノム工学の最初のステップは、選択と CRISPR Cas9 媒介をターゲットに必要なツールの生成を含みます。ゲノム統合サイトの軌跡の選択は、ターゲットのセル型の選択と統合のため HIV 由来の記者の設計この手順を付けます。このプロトコルは、Jurkat 標的細胞への HIV LTR_tdTomato_BGH PA 最小限記者ターゲットについて説明します。CRISPR ベース Cas9 ターゲット、世代、スクリーニング、クローン系統の検証のワークフローのフローチャートは、図 1に描かれています。記載されているターゲット戦略s. 化膿Cas9 を使用して、選択した統合サイトで gRNA 監督 dsDNA 改を生成する (SpCas9)。相同組換えを介して選択された genomic 位置に記者が対象とし、いわゆる 5' と 3' の相同性 (HA) の腕11が並ぶ記者シーケンスを含む非線形ターゲット ベクトル (テレビ) を提供します。

  1. ターゲットの軌跡、gRNA、およびベクター デザインをターゲットの選択
    1. 個々 の科学的な質問に基づいて対象とする thegenomic の軌跡を選択します。Hiv 感染の再発統合サイトの公開されたリストは、異なる患者で発見した使用研究2,3,4,5,6,7、8ガイドライン。インシリコ抽出対象 (完全な遺伝子のシーケンス) またはゲノムの少なくとも 5 kb 必要な genomic 位置のゲノム シーケンス UCSC のゲノムのブラウザー (http:// genome.edu.ucsc.edu) を使用しています。
    2. 選択ガイド Rna (gRNAs) 20 E カリカリ webtool (http://www.e-crisp.org) を使用して選択された genomic 位置のターゲットのための nt。
      1. 生物として「ホモ ・ サピエンス GRCh38」を選択します。1.1.1 手順で抽出した目的の genomic 位置をカバーするゲノム シーケンスの入力 2,000 bp。
      2. 中規模アプリケーション設定 (任意の PAM、任意 5' 基本、ターゲットを容認のミスマッチ、イントロン/CPG の島が除外されます) を使用して gRNA の検索を開始します。可能な gRNA デザイン一覧は、高い特異性と効率のためのスコアを下げることからランキング表示されます。
      3. できれば特異性と効率性の高いスコアを示していますし、対象とする目的の genomic 位置にできるだけ近く、gRNA を選択します。
        注:目的の genomic 位置への近さと具体的かつ効率的な gRNA の設計間の妥協は発見されていません。
    3. NCBI blast ブラウザー (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) を使用して gRNA 結合部位の一意性をチェックする参照ゲノムに対して選択した gRNA シーケンスを爆発します。
      1. ゲノムとして「人間」を選択します。クエリ シーケンスとして gRNA シーケンスを入力します。「類似性の高いシーケンス」を選択 (メガブラスト) プログラムとして。GRNA シーケンスが一意であることを確認します。そうでない場合は、再びステップ 1.1.2.3 とブラストからの別 gRNA を選んだ。
    4. GRNA シーケンスを選択すると、それに応じて 5' と 3' HA として 1.1.1 手順で抽出したゲノム配列からインシリコ1,000 bp 上流と下流の gRNA シーケンスを選択します。
      注: 、GRNAs 選択したゲノム統合サイトの軌跡に相同であるべきし、protospacer の隣接するモチーフに隣接 (PAM; 例えば、 SpCas9 の NGG) (図 2 a)。テレビには、5' と 3' HAs が並ぶの記者のシーケンスが含まれています。上流と下流の gRNA シーケンス11カバー 1000 bp があります。完全 gRNA シーケンスは、HA には含めない。最大 5 の重複 nt は受け入れられる (図 2 a)。
  2. GRNA とターゲット ベクトルの生成
    注:ベクター方式、図 2 bを参照してください。
    1. SpCas9 と gRNA の発現用ベクターを生成するには、元 SpCas9 と RNA (sgRNA) の 1 つのガイドの両方同時に表せることのバックボーンとして、pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 を使用します。バックボーンに gRNA シーケンスをクローン、BbsI 制限サイト12を使用します。
    2. テレビを生成する、(, pMK や cDNA3.1 などのバックボーンとして高いコピーのプラスミッドを選択します。
      1. まず、記者を組み立てる (このプロトコルで: LTR_tdTomato_BGH PA) ギブソン アセンブリ clong によって構造物のバックボーンに13クローン商業アセンブリを使用してキット、および 5' と 3' 制限のサイトをご紹介 (例えば、 5' パーチと 3'SmaI) それに続く制限消化がのクローニングのため。
      2. 対象となるセル型のゲノム DNA (gDNA) から 1.1.4 で選んだ HA フラグメントの 1000 bp を増幅 (このプロトコルで: Jurkat 細胞) 活動を校正と DNA ポリメラーゼを用いた (表 1と2の PCR 食材を参照してくださいと循環の条件)。その後、記者が並ぶ各 HA (5' 3' HA の両端に SmaI、両端 HA のパーチ) の 5' と 3' 端に制限のサイトをご紹介します。
      3. 順番にクローンは既に14,15をクローニング制限酵素による記者 (1.2.2.1 の手順で生成された) を含む構造物のバックボーンに持っています。まず、クローンで 5' HA 3' HA でパーチ制限のサイトを使用して、クローン、SmaI 制限のサイトを使用して。
        注:テレビ バックボーンに追加蛍光レポーターがある場合不要なバックボーン統合フローサイトメトリーによって評価される (3.2.2 および 3.2.3 の手順を参照してください)。PCR を用いたバックボーン統合を評価する必要がありますテレビのバックボーンに蛍光レポーターが含まれていない場合 (手順 3.2.8 参照)。

figure-protocol-1
図 1: CRISPR Cas9 仲介されたターゲット、生成、およびワークフロー クローン記者の選択行に定義された統合サイト。(A) 目標点のベクターを生成し、目標点のベクターと Cas9/gRNA 発現プラスミド Jurkat T 細胞を変換します。(B) エンリッチ FACS による transfected セル 72 h ポスト トランスフェクションします。(C) 許可しなさいセル 10 ~ 14 日の成長ターゲットに PCR によるイベントの発生を確認およびフローサイトメトリーします。(D) 生成希釈させクローンを制限することによって単一細胞クローン成長 3 週間。(E) PCR による正しいターゲットのためのクローンを画面し、96 ウェル フォーマットでフローサイトメトリーします。選択されたクローンを展開します。(F) は南しみ、PCR やシーケンシング、および Cas9 a エンドヌクレアーゼ活性のターゲットをイベントの分析によって選択されたクローンのターゲットが正しいを確認します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-protocol-2
図 2: 戦略とベクトル デザインを対象とします。(、) の gRNA と相同性武器の選択。20 nt gRNA は選ばれたゲノムのターゲット ・ サイトに相同と腕 1,000 bp アップを補完するものと、gRNA の下流、gRNA シーケンスを含める必要がありますいない PAM. 相同に隣接して位置しています。(b) ベクトルと gRNA/Cas9 ベクトルをターゲットの模式図。ターゲットのベクトルは、5' と 3' ホモロジー腕が並ぶは、選ばれた記者のシーケンスで構成されます。GRNA/Cas9 ベクターは pX330 U6 Chimeric_BB cBh hSpCas9 バックボーンに基づいています。(c) の相同組み換えによるターゲットの模式図。目標点のベクターと guideRNA/Cas9 ベクトルは Jurkat 細胞に導入しました。Cas9 はゲノムのターゲット ・ サイトで二重鎖切断を仲介する (によって示される *) と相同組換えとゲノムのターゲット遺伝子座に記者シーケンスの統合が容易になります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

2 Jurkat 細胞のターゲット CRISPR ・ Cas9-ベース

  1. Jurkat 細胞のトランスフェクション
    1. プレート 1.25 x 106 Jurkat T トランスフェクション前に 24 h は 10% (v/v) 牛胎児血清 (FCS) と 4 mM L-グルタミン [と呼ばれる「RPMI w.o. 抗生物質 (AB)」]/6 よく細胞培養プレートのウェルに添加 RPMI 1640 の 2.5 mL のセルします。単一ターゲットの実験の 1 つの完全な 6 ウェル プレートを準備 (すなわち, 6 井戸細胞懸濁液 2.5 mL をそれぞれ)。
    2. 次の日に transfect 円形テレビと pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9/gRNA Jurkat 細胞のトランスフェクション試薬特定を使用して細胞が共同。
      1. 反応管でよく混ぜる商業 RPMI 培地の 250 μ L に低下した血清中濃度 (血清の 50% 削減を RPMI) の transfection のために最適化された円形のテレビの 2 μ g と pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9/gRNA/ウェルの 2 μ g を追加します。
      2. 管の壁に触れることがなく DNA/メディアにゆっくりとトランスフェクション試薬の 12 μ L を追加し、旋回します。混合物は 15 分間インキュベートし、滴下 1 つよくセルの追加をしましょう。37 ° C と 5% の CO2のセルを孵化させなさい。
        注:トランスフェクション反応の準備をスケール アップすることができます。トランスフェクション後、中型の変更は不要です。
  2. 蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えして transfected セルの濃縮
    1. 72 時間後のトランスフェクション プール transfected セル カウントする方法、FACS による濃縮のための準備します。4 分の 300 x gと部屋の温度 (RT) で遠心分離 50 mL の円錐管の細胞を収集、PBS で 1 回洗浄、遠心分離機の再度、1 x 10 FACS バッファー (1% の FCS + 1 mM EDTA を添加した PBS) の適切な量の餌を中断7細胞/mL、最後に FACS チューブに移すと。
    2. FACS のセルを対象し、テレビ (例えばこのプロトコルで,






















アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

この代表的な実験では、我々 は LTR、tdTomato コーディング シーケンス、および BACH2 遺伝子17のイントロンが 5 で 2 つの座位 polyA 信号系列から成る最小 HIV-1 由来の記者を対象とする分野します。HIV 感染患者2,4,5,6から主な T 細胞のさまざまな研究は、公開された再発統合サイトへの近さに従ってターゲット遺伝子が選ばれました 7,8と PAM モチーフ NGG 二重鎖切断の Cas9 を介した誘導に必要な存在。ターゲット ベクトル建設、説明プロトコルに従って transfected。トランス...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

ここでは、選ばれたプロウイルス統合サイト CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学の応用と HIV 由来 1 Jurkat 記者のモデルを生成するプロトコルについて述べる。

プロトコルのいくつかのポイントでは、計画段階で細心の注意が必要です。いくつかの遺伝子座は他の人よりもターゲットに簡単かもしれませんので対象となる軌跡を注意深く選択する必要があります最初に、(例,地域とターゲットのクロマチン状態に応じてシーケンス自体)。反復シーケンスはターゲットのベクトルにクローンを作成するは難しい、ゲノム内で一意ではありません多くの場合。抑圧的なクロマチン領域は、CRISPR Cas9 システム19,20をターゲットにする困難です。

第二に、gRNA の選択は、CRISPR Cas9 媒介をターゲットに重要です。代表的な統合サイトと HIV 感染のためのモデルを生成するの目的のための統合のホット スポッ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

テクニカル サポート、ブリッタ Weseloh とベッティーナのアベルに感謝します。我々 もありがとうアルネ Düsedau、Jana Hennesen (流れ cytometry 技術プラットフォーム ハインリッヒ Pette Institut) テクニカル サポート。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9Addgene42230ベクター SpCas9 および gRNA
pMK GeneArt哺乳類発現ベクター
cDNA3.1InvitrogenV79020哺乳類発現ベクター
BbsINew England BiolabsR0539S制限酵素
NEBuilder Hifi DNAアセンブリクローニングキットNew England BiolabsE5520Sターゲットベクターの生成に使用されるアセンブリクローニングキット
TaqPlus Precision PCR SystemAgilent Technologies600210DNAポリメラーゼ プルーフリーディング活性 相同性アームの増幅(ステップ1.2.2.2)、インテグレーションサイトとレポーター配列の検証(ステップ3.3.3および3.3.5)、サザンブロット用ゲノムプローブの生成(ステップ3.4.1.5)、オフターゲットイベントの解析に使用(ステップ 3.5.4)
96ウェル組織培養プレート(丸底)TPP92097希釈プレーティング用組織培養プレート
Phusion High-Fidelity DNAポリメラーゼニューイングランドバイオラボM0530 LDNAポリメラーゼは、ターゲティングイベントの検出(ステップ2.4.2)およびサザンブロット用のレポーター特異的プローブの生成に使用されます(ステップ3.4.1.4)
ジメチルスルホキシド(DMSO)Sigma-AldrichD9170PCRとしてのジメチルスルホキシド添加物
塩化マグネシウム(MgCl2)溶液ニューイングランドバイオラボB9021SMgCl<サブ>2溶液としてのPCR添加剤
デオキシヌクレオチド(dNTP)溶液ミックスニューイングランドバイオラボN0447SdNTP混合物 PCR反応のための各NTの10mMとの
5PRIME HotMasterMix5PRIME2200400PCRスクリーニングに使用されるすぐに使えるPCRミックス(ステップ3.2.11)
QIAamp DNA血液ミニキットQiagen51106DNA分離および精製キット
QIAquick PCR精製キットQiagen28106PCR精製キット
RPMI 1640 グルタミンなしロンザBE12-167F細胞培養培地
ウシ胎児血清 南アフリカ チャージPAN バイオテクノロジーP123002細胞培養培地サプリメント
L-グルタミンバイオクロムK 0282細胞培養培地サプリメント
ニシリン/ストレプトマイシン10.000 U / mL / 10.000 & micro;g/mLBiochromA 2212細胞培養培地サプリメント
Gibco Opti-MEM 低血清培地Thermo Fisher Scientific31985062トランスフェクションに最適化された血清濃度低減細胞培養培地
TransIT-JurkatMirus BioMIR2125トランスフェクション試薬
ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテートSigma-AldrichP8139-1MG細胞培養試薬
イオノマイシンSigma-AldrichI0634-1MG細胞培養試薬
シリンジ駆動フィルターユニット、PESメンブレン、0,22 µm菌ろ過用MillexSLGP033RB
Heracell 150iインキュベーターサーモフィッシャーサイエンティフィック51026280組織培養インキュベーター
Amershan Hybond-N+GE ヘルスケアRPN1520BDNAおよびRNAブロッティング用正電荷ナイロンメンブレン
Stratalinker 1800Stratagene400072UV架橋剤
High PrimeRoche11585592001for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers
illustra ProbeQuant G-50 Micro ColumnsGE Healthcare28-9034-08クロマトグラフィースピンカラム 標識DNAの精製用
混合物 ペ 無フィルターユニット

参考文献

  1. Hughes, S. H., Coffin, J. M. What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence. Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).
  2. Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
  3. Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells. Nature Communications. 8 (1), 498(2017).
  4. Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection. Cell. 160 (3), 420-432 (2015).
  5. Han, Y., Lassen, K., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
  6. Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).
  7. Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection. Science. 345 (6196), 570-573 (2014).
  8. Maldarelli, F., Wu, X., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
  9. Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro. The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).
  10. Mack, K. D., Jin, X., et al. HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).
  11. Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).
  12. ZhangLab. CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website. , Available from: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf (2013).
  13. Moser, F. Addgene. Gibson Assembly Protocol. Addgene website. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/ (2009).
  14. Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/ (2014).
  15. Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ (2013).
  16. Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool. Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).
  17. Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection. Virus Research. 249, (2018).
  18. Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems. PloS ONE. 11 (6), e0158294(2016).
  19. Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity. Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).
  20. Jensen, K. T., Fløe, L., et al. Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency. FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).
  21. Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).
  22. Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. Position effects influence HIV latency reversal. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

CRISPR Cas9 HIV 1 RNA
選択したプロウイルス統合サイトの HIV-1 感染の Jurkat レポーターのモデルを生成する CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。