レニフォーム線虫抵抗に対する綿のジェノタイプのスクリーニング

サマリー

ここでは、レニフォーム線虫耐性に対する綿のゲノムタイプの迅速な非破壊スクリーニングのためのプロトコルが提示される。このプロトコルは、線虫に感染した綿の苗の根を視覚的に調べて感染反応を決定することを含む。各植物からの栄養芽は、種子生産のための植物を回復するために伝播されます。

要約

線虫管理を改善するためには、耐性綿(ゴシピウムヒルストゥム)品種の開発には、迅速な非破壊性線虫線虫(ロティレンクルス・レニフォルミス)スクリーニングプロトコルが必要である。ほとんどのプロトコルは、綿根系またはポッティング土壌からバーミフォーム線虫または卵を抽出して、人口密度または再生速度を決定することを含む。これらのアプローチは、一般的に、評価される少数のジェノタイプで時間がかかります。ルートシステムが線虫感染について視覚的に検査される別のアプローチについて説明します。このプロトコルは、角線虫で植えた7日後に綿の苗を接種し、接種後28日目に根系に付着した雌の数を決定することを含む。データは、根の成長の変動を調整するために、新鮮な根の体重のグラムあたりの女性の数として表されます。プロトコルは、感染部位を確立する線虫の能力に関連する宿主植物耐性を評価するための優れた方法を提供します。しかし、線虫再生を妨げる抵抗は評価されない。他のスクリーニングプロトコルと同様に、実験内および実験間の個々のゲノタイプ間の線虫感染には一般的に変化が認められる。データは、プロトコルを使用して観察される変動の範囲を示すために提示される。このバリエーションを調整するために、コントロールジェノタイプが実験に含まれています。それにもかかわらず、プロトコルは、ホスト植物耐性を評価するためのシンプルで迅速な方法を提供します。このプロトコルは、G からの耐性アクシビリティを識別するために正常に使用されています。樹木胚芽を収集し、抵抗の遺伝学を決定するために300人以上の個体の分離集団を評価する。また、耐性繁殖のための植物を回収するための栄養伝播法も開発された。線虫評価のための根系を除去した後、栄養シュートは新しい根系の開発を可能にするために植え替えられる。芽の95%以上は、通常、植物が成熟に達する新しい根システムを開発します。

概要

ロティレンチュルス・レニホルビス(リンフォードおよびオリベイラ)は、一般にレニフォーム線虫と呼ばれ、米国南東部の土壌に存在する主要な寄生線虫種^の1つであり、1、2、3である。線虫は、そのライフサイクル2、4を完了するためにホストプラントを必要とする義務的な、座りっぱなしの半エンドパラサイトです。Vermiformの前成人女性線虫は、ステレ2、3に給餌部位を確立するために宿主根系に侵入する。線虫が供給および成熟するにつれて、宿主根の外側に残る後部は卵の産生時に膨らみ、特徴的な腎臓の形を形成する(図1)。ロティレンチュルス・レニフォルムは、綿4を含む300種以上の植物種の根系に餌を与えることができる。高地綿(ゴシピウムヒルスタムL.)は、米国南東部で広く栽培されていますが、Rの欠如. レニホルミス耐性品種は線虫管理2、3を妨げる。ネマチド処理や非宿主作物種による回転などの管理戦略は、土壌Rを減少させるために使用されてきた。レニフォルムは人口密度5、6、しかし、種子綿収量損失は一般的に1から5%2の範囲であり得る。Rの症状.レニホルビス感染は、植物の衝撃、抑制された根の成長、栄養欠乏、果実中絶、および遅れた^成熟2を含むことができる。しかし, フィールド全体の症状の均一性のために症状が明らかでない場合があります。;したがって、R を評価するアプローチ。レニホルビス感染症は、耐性の高地綿の品種を同定し、開発するために必要とされる。Rの評価 .綿のレニフォーム耐性は困難と考^{えられている7}は、感染した根系は、植物が感染の症状を示す場合でも正常に見えることがあるので8.

Rの同定には効果的な線虫スクリーニングプロトコルが必要である。レンチホルマーは、綿胚芽コレクションからの耐性アクセーション、およびこれらのアクセシビリティに対する耐性遺伝学の決定のために。このようなプロトコルは、高地綿への抵抗遺伝子の伝達に役立ちます。Rを評価するために様々なバイオアッセイ法が用いられてきた。綿8、9、10、11、12、13、14、15におけるレニフォーム感染症。 一般に、R の識別には 2 つの主要なアプローチが使用されています。レニフォームは、耐性綿のジェノタイプです。最も頻繁に使用されるアプローチは、感染した植物または土壌8、11、12、14、15から卵および/またはバーミフォーム線虫を抽出することを含む。このアプローチの一般的な方法論は、個々の綿の異種の種子を別々のポットに植え、苗を7~14日間発達させ、Rのvermiformステージの混合物を加えることによって苗を接種することを含む。線虫を土壌に対して30~60日間根系に感染させる。次に、各植物の感染した根系またはポッティング土壌から、バーミフォーム線虫および/または卵を抽出する。次に、抽出された線虫または卵の数は、耐性のゲノム型を同定するために制御されたゲノタイプと比較される集団密度および再生速度を推定するために決定される。

別のアプローチは、ここで説明するように、線虫に感染した綿根系を顕微鏡的に調べて、根10、16を寄生する雌線虫の数を決定することを含む。他のアプローチと同様に、綿のゲノムは別々の鉢に植えられ、植え付けの約7日後にバーミフォーム線虫で接種される。接種後30日以内に、根系を個々の植物から除去し、土壌を根からすすいでくすいだ。次に、根系に付着した線虫を赤い食品着色^剤17で染色し、根を顕微鏡的に調べて、耐性綿の種型を持つ感染部位の数を決定する(1グラム当たりの線虫数に基づいて同定される)のルート)は、影響を受けやすい^{コントロール16}と比較して。この2番目のアプローチは、評価に必要な日数を減らし、単一の実験で評価される個々のジェノタイプの数を増やすことによって、スループットを高める利点があります。集団密度または生殖速度を評価するスクリーニング方法論は、感染徴候7の目視観察に基づくものよりも時間がかかることが多い。しかしながら、このアプローチの1つの制限は、卵産生によって決定される線虫再生を妨げる宿主植物耐性が評価^{されない13}である。

Rのスクリーニング プロトコル 。レニフォーム抵抗は、多くの場合、評価7の間に根系を破壊し、廃棄される栄養シュートを伴う。この制限を克服するために、種子生産のための植物の回収を可能にする栄養伝播の方法^が開発された18.線虫評価のための根系を除去した後、栄養シュートは、根系が再成長できるようにポッティング土壌に植えられています。このメソッドは、ほとんどのRに対して広範なアプリケーションを持っています。レニフォームスクリーニングプロトコル。栄養伝播の簡単で迅速な方法は、Rを繁殖するために非常に重要です。レニフォルムは、子孫の回復が次世代に耐性のゲノムを進めるために必要とされる高地綿の品種に耐性があります。

レニフォーム線虫耐性のための綿のゲノタイプの大規模なスクリーニングのためのプロトコルが提示されます。目標は、耐性の高地綿品種の繁殖を支援するために、線虫耐性のための綿の繁殖集団を評価するためのシンプルで迅速な非破壊スクリーニング方法を開発することです。このプロトコルを使用して、データは通常35日以内に取得され、300以上のジェノタイプが1回の実験で評価されます。これらの方法を用いて一般的に観察される変動を示すために、耐性と感受性の高いゲノムタイプに関するデータが提示されます。

プロトコル

1. Rのソースの維持 .レニフォルミスイノクソム

1. テラコッタ粘土ポット(直径15cm、高さ13.5cm)を、1部の砂と2部の砂の蒸気低温殺菌ミックスで埋めます。各ポットに感受性トマト(ソラナムライコパシコン)品種を植え、ガラスハウスにポットを置きます。
   注:綿などの他の影響を受けやすい植物の品種は、トマトの代わりに使用することができます。
2. トマトの植物をvermiform reniform線虫で接種する(ステップ3.3参照)。約28°Cの温度でガラスハウス内の植物を維持します。

2. R用コットンジェノタイプの植え付けレニフォルミス抵抗評価

1. 畑から採取した1部の砂と2部の細かい砂を組み合わせて土壌を準備します。
2. 蒸気は、土壌が線虫や土壌媒介植物病原体の自由であることを確認するために、土壌混合物を低温殺菌します。
3. 円錐形のプラスチックポット(直径4センチメートル、高さ21センチメートル)に土壌混合物を追加します。ポットを充填する前に、土壌の損失を防ぐために、ポットの底に綿のボールを置きます。鍋の上部から約2cmの土を部分的に充填します。
4. 植える遺伝子型を指定するために、各ポットのためのプラスチックステークを準備します。
5. 評価のために選択された綿のゲノムタイプの植物種子。
   1. 各種子がユニークな遺伝子型を表す分離集団の評価のために、各ポットに単一の種子を植えます。
   2. 綿の品種または胚芽のアクセシレーションの場合、線虫接種の前にポットから取り除かれた他の苗を持つ少なくとも1つの植物の発芽を保証するために、単一のポットに2〜3種子を植えます。
      注:または、種子は、非実行可能な種子を持つポットの数を最小限に抑えるために、植え付け前に24〜72時間発芽することができます。
6. 選択された耐性と感受性制御ジェノタイプの植物種子。
   注: コントロールジェノタイプは5~10回複製され、スクリーニング方法論に固有の自然変動を評価します。
7. 各ポットの種子をカバーするために追加の土壌でポットを埋めます。
8. 成長室にポットを置きます。成長室の周囲の気温である28°Cの一定温度を維持します。16時間の光周期で蛍光灯と白熱ランプの混合物で人工照明を提供します。
9. 各ポットに水エミッタを置き、自動給水システムを使用して1日2回ポットに水をやります。植物が成長するにつれて追加の水を供給するために水やりシステムを調整します。

3. 綿植物の線虫接種と根試料の調製

1. 抽出可能なトマト植物上に維持された抽出物レニフォーム線虫(ステップ1参照)は、接種前日に溶出^体19及び遠心浮^他20の方法論を用いた。抽出した線虫を4°Cに保存します。
   注:バーマン漏斗^抽出21は、線虫抽出のための代替方法である。
2. 100 μLサブサンプル中の線虫の数を数えて抽出した線虫の数を決定し、接種用に水道水中に1,000線虫/mLの懸濁液を準備します。
3. 線虫懸濁液で植えた後、綿の苗7dを接種する。植物の隣の土壌に小さなくぼみを作成し、うつ病にレニフォーム線虫懸濁液のピペット1 mL。
4. 線虫評価のための接種後、ポット28 dから植物を取り除きます。
   注:この段階では、植物は約15センチメートルの高さで、4〜6完全に膨張した葉です。
   1. 鉢から植物を取り除く前に、はさみを使って植物から完全に膨張した葉のほとんどを取り除きます。
   2. ポットから植物を取り除くために、鍋を絞り、手に土をスライドさせます。
   3. 10Lコンテナで水道水の根系を攪拌して根からゆっくりと土を取り除きます。きれいな水道水の容器で根系を簡単に洗い流します。
   4. はさみを使って、土壌線から約1cm下の植物から根系を取り外します。
5. ルートシステムを120 mLプラスチック、非滅菌、使い捨て標本容器に入れ、同定に使用するポットのプラスチックステークと一緒に置きます。
   注: ステップ 3.7 に進む前に、複数のサンプルが処理されます。植物の芽の栄養伝播のためのステップ4に進みます。
6. 根系に取り付けられた線虫を染色するために、水道水に赤い食品^着色17の12.5%(v/v)溶液を調べます。
7. 約30mLの赤い食品着色液を試料容器内の根試料に加え、根系を完全に覆います。
8. 試料容器を電子レンジに入れ、染色液が沸騰し始めるまで根試料を加熱します。電子レンジからサンプルを取り出し、室温で冷却します。
9. 根試料から赤い食品着色液をデカントし、余分な汚れを除去するために、試料容器に約100mLの水道水を加えます。蓋を試料容器に置き、4°Cの冷蔵庫に保管します。ルート感染の評価のためにステップ5に進みます。
   注: 手順 5 に進む前に、プロトコルをここで一時停止できます。

4. 種子生産のための植物を回収するための栄養伝播

1. 円錐形のプラスチックポットの底に綿のボールを置き(ステップ2.3を参照)、部分的に泥炭苔ポッティングメディアでポットを埋めます。その後、ポットに栄養シュートを置き、しっかりとポットを埋めるためにポッティングメディアを追加します。綿の遺伝子型を指定するために、各ポットに新しいラベルのプラスチックステークを配置します。
2. ポットのトレイをプラスチック容器(長さ73.6cm×幅45.7cm×高さ15.2cm)に水を入れ、植物に短時間水を入れ、ポッティングメディアを湿らせます。16時間の光周期を使用して28 °Cの一定温度で成長室にポットを置きます。土壌水分を維持するために必要に応じてプラスチック容器に追加の水を追加します。
3. 約30d.後に種子生産のための大きなポットに植物を移植し、部分的にポッティングメディアで6Lプラスチックポットを充填(ステップ4.1参照)、小さなポットから植物を削除し、6Lポットに植物を配置し、しっかりとポットを埋めるためにポッティングメディアを追加します。
4. 植物をガラスハウスに入れ、ポッティングメディアを湿らせる水を加えます。約28°Cでガラスハウスの温度を維持します(人工照明は必要ありません)。
   1. 水は約30dのために必要に応じて手で植物を。
   2. 植物の約75%が毎日の給水を必要とする場合、自動給水システムを使用して毎日水の植物。植物の成長に必要に応じて、自動給水システムをより頻繁に水に調整します。
   3. 花の開始前に各ポットに約10gの遅放出肥料を追加します。
5. 成熟時に植物を収穫し、綿の種子サンプルを処理して、さらなる評価のために種子を得ます。
   1. 綿の種子を収穫するには、手で植物の開いたボルから綿を取り出し、ラベル付きの紙袋に入れます。種子は綿繊維に取り付けられ、次のステップで除去される。
   2. 10ソーの実験室ジンを使用して種子サンプルから糸くず繊維を取り除きます。
   3. 濃縮硫酸を使用して種子サンプルからファズ繊維を除去します。炭酸ナトリウムの15%(v/v)溶液中で種子サンプルを中和し、水道水でサンプルをすすいで、強制空気乾燥機でサンプルを乾燥させます。
   4. シードサンプルをラベル付きの封筒に入れて保管します。

5. Rの評価.レニフォルミスルート感染

1. 試料容器から根試料を取り出し、立体顕微鏡(20X倍)を使用して根系に取り付けられた雌線虫の数を数えます。
   注:唯一の女性のレニフォーム線虫は、植物の根に感染することができる。
2. 余分な水分を取り除くために、約10分間ペーパータオルの上に根系を置きます。ルートシステムの重量を量り、新しい根の重量を決定します。
3. 線虫数と新鮮なルートウェイトデータをコンピュータスプレッドシートプログラムに入力し、ルートのグラムあたりのメスの数を計算します。

結果

2種類の根系のロティレンチュルス・レニホルム感染を図1に示す。比較的少ない雌のレニフォーム線虫は、感受性遺伝子型と比較して耐性綿遺伝子型の供給部位を確立することができる。ルートの成長の変化は、図 2に示すように、アクシビリティ間で一般的です。新鮮な根の重量によって測定されるこの変動は、同じ遺伝子型の植物間でも観察することができる(表1)。ゴシピウム樹木性ゲノム型は、高地綿の植物型よりも根の成長率が低いことを頻繁に示す。この変動を補うために、データは、各遺伝子型のグラム根組織あたりの雌レニフォーム線虫の数を計算するために使用される新鮮な根の重みで収集されます。耐性ゲノム型の根の1グラム当たりの雌ルネフォーム線虫の数は一般的に10未満であるのに対し、感受性の高いゲノム型は一般的に根の1グラム当たり30以上の線虫を持つ。

ディスカッション

1)Rの同定には効果的なスクリーニングプロトコルが必要である。レジフォルムは耐性の遺伝的な耐性を評価するために、2)耐性品種の繁殖を評価するために耐性綿の遺伝子型。ほとんどのプロトコルはRを評価します。レンチホルミス集団密度または綿根系またはポッティング土壌8、11、12、14、15からバーミフォーム線虫または卵を抽出することによって、生殖速度.これらのアプローチは、多くの場合、より時間がかかり、結果は実験内および実験間でより多様になる傾向があります。さらに、綿のゲノム型は、これらの^{プロトコル11}を用いた非複製ガラスハウス実験において、より頻繁に誤分類されうる。それにもかかわらず、同様の結果は、<...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
レイリーチコーンテイ	ナーStueweとサンズ株式会社	SC10U
コーンテイナートレイ	Stuewe and Sons Inc.	RL98
サンド	各種
コットン ボール	各種
パイロン 4インチ プラント ラベル (4 インチ L x 5/8 インチ W)	パイロン プラティクス	L-4-W	任意のブランドまたはベンダーが受け入れられます。
4オンス標本容器	フィッシャーサイエンティフィック	16-320-731	どのブランドやベンダーでも構いません。
赤い食品着色料	マコーミック&Co.、株式会社
1mLピペットチップ	各種
10L容器	各種		バケツがうまく機能します。
6 Lポット	ナーサリーサプライ株式会社	Poly-tainer-Can No2A	どのブランドやベンダーでも構いません。さまざまなサイズのポットを使用できます
ポッティングメディア	Sun Gro 園芸	Metro-Mix 360	どのブランドやベンダーでも構いません。
肥料	Everris NA Inc.	Osmocote Plus	は、どのブランドやベンダーでも構いません。
プラスチックコンテナ(長さ73.6cm×幅45.7cm×奥行15.2cm)	ラバーメイド	3O29	どのブランドやベンダーでも構いません。