新規オブジェクト認識と行動の予算上のマウスでテスト オブジェクトの場所

効果的な認知テストは分離し、¹の制御された環境での動作を調べることによって特定の脳部位の神経の機能を評価します。ヒトでは、特定のタスクは、前頭前野の機能のタスクまたはケンブリッジの神経心理学的テスト自動化されたバッテリー (テストを学習ペアの仲間を並べ替えウィスコンシン カードなどの対象となる脳領域のパフォーマンスを評価するために設計されています。CANTAB) 海馬機能^2,3。これらのテストは、それらの領域の神経活動に起因する行動を評価することによって人間の脳の特定領域の機能を研究しています。最も生物医学研究の最終目標は、人の健康の改善しかし、健康や病気で脳機能の多くの研究は、人間の参加者と倫理的実行できません。研究は人間の参加者は使用できませんが、マウスなどの小さい齧歯動物は、しばしば選択のモデルです。マウスモデルを使用して遺伝子発現の変化、損傷の誘導または光遺伝学的手法によって回路活性も変調を含む実験的操作を直接制御できます。人間テストと同様、マウスの行動テストは特定の地域に依存する挙動を測定することにより脳機能に対する実験的変数の影響を評価するために目指しています。

海馬は、人間および齧歯動物の⁴の記憶形成に不可欠な構造です。具体的には、海馬はリレーショナル表現を含む宣言的記憶ですが脳⁴モーターのセンター依存しない手続きの記憶に重要な役割を果たしています。海馬メモリ関数は、摂動に絶妙に敏感であるために、神経科学の多くの分野にまたがる研究の焦点をされています。発作と脳卒中高齢化と長期のストレスに至る負の摂動は、海馬の損傷⁵に関連付けられます。対照的に、社会的相互作用、物理的な環境エンリッチメント、運動などの肯定的な介入は、海馬機能^6,7、8を向上させます。海馬メモリの適切なテストを持つ齧歯類での試験は、異なる環境介入の海馬の機能に及ぼす影響と同様に、メモリの細胞・分子のメディエーターに洞察力を明らかにできます。

齧歯動物、海馬依存した学習とメモリ^9,10,11を研究するいくつかのテストが開発されました。彼らは広く動作の変更を引き出すために情動を伴う刺激を必要とするタスクと新しい刺激に対して¹¹を調査する齧歯動物の嗜好に描画タスクに分割できます。恐怖による凍結挙動^9,11を測定することによって環境のコンテキストおよびコンテキストのメモリで、その後テストで不愉快な刺激 (フット ショック) のペアなど文脈恐怖のエアコン。モリス水迷路とその乾燥版バーンズ迷路空間学習^4,11を促進するために否定的な外部補強を使用します。それぞれのケースでは、齧歯動物は嫌悪事態、冷たい水に浸されたり、それぞれ明るいのプラットフォーム上で公開されるからの脱出を求めます。放射状迷路は対照的に、動物を使って小さな食料品報酬^4,11を取得、空間記憶と相まって自然の採餌行動と肯定的な補強に依存しています。これらのタスクは、広く使用され記憶の海馬について基礎的な知識が得られています。しかし、正および負の外部の援軍やショックのような恐怖を誘発する刺激はこれらの行動に感情的なコンポーネントを追加いくつかのケースでは望ましくないかもしれないことをテストします。たとえば、背側と腹側のなったは、空間記憶の感情的な規制、それぞれ¹²対の異なる機能に関連付けられます。腹側海馬感情調節機能も影響を受ける場合、刺激に対する感情的な反応に依存するテストに障害空間メモリが正確に反映しない場合があります。

OLT は、海馬依存性の空間記憶¹³の測度を提供する簡単で効果的なテストです。タスク追加の外部補強なし目新しさ動物の本質的な好みに依存しています、したがって通常感情的な応答¹³による合併症を避けることができます。OLT の現在のプロトコルはマウスの提示が、装置の寸法が適切にスケーリングされる場合、それはまた、ラットにおける効果的。プロトコルはオープン フィールド テストのアリーナには、マウスを慣らすと、空間環境手がかりに関連して 2 つのオブジェクトを調査することから成っています。マウスがアリーナから削除されます、(間の間隔または ITI) 遅延、中に、オブジェクトの 1 つが移動されます。ITI 後、マウスがアリーナに再導入し、自由に探索できます。一般に、マウスは、目新しさを好む、彼らは彼らの最初の暴露からオブジェクトの位置を覚えて、もし彼らに費やす時間移動したオブジェクトを調査します。海馬病変を有する動物空間コンテキスト学習に障害があるし、その結果新規場所^14,15オブジェクトのための好みを示します。

OLT は、新規オブジェクト認識タスク (水資源) 複数の脳領域から描画する神経活動にメモリの追加テストを単独または組み合わせて使用できます。北風は、オブジェクトの 1 つの新しい場所に移動する代わりに新規オブジェクトによって置き換えテスト フェーズまで、OLT と同じです。OLT の場合と同様に、オブジェクトの良い思い出を持つマウスが自発的に新規オブジェクトを調査を好みます。海馬基板を多用、オブジェクト位置メモリとは対照的物体認識のメモリは、さまざまな脳領域に依存するが表示されます、海馬の関与は決着についていません。多く海馬病変あるいは不活化に影響しないこと新規オブジェクトの好み^10,13,16,17、反対^18,19を見つける他のレポートを研究します。しかし、それはまだ齧歯動物で一般的なメモリ機能を評価する一般的に使用されるタスクです。

ここで提示されたプロトコルは、オープン フィールド テスト アリーナを使用した開始と OLT および水資源、実行に必要な手順を区切ります。市販の行動試験装置はコスト高く、小さい実験室のために特にすることができます。このプロトコルには、最小限のコストで、特殊な工具を使わずに社内の競技場を構築する設計と簡単な手順が含まれます。さらに、このプロトコルは、アリーナ、文脈手がかりと OLT と水資源のプロトコルの実装のための段階を設定するビデオ録画システムの配置を含む理想的な行動のテスト領域を詳しく説明します。すべての材料と試験手順の最適化の重要性を強調し、成功として欠陥のある研究の代表的な結果が掲載されています。

表 1: 行動テストに必要な機材の明細リスト。

次のプロトコルは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) オハイオ州州立大学 (OSU) でによって承認されています。

1. アリーナの構築

1. 表 1に記載されている資料を注文: 5 枚アクリル ・ アクリル セメント ・ 16 G のハイポ アプリケーター。
2. 目、皮膚、およびその他の種類の保護を含めることができます製造元の指示に従って適切な安全装備を着用してください。
3. アクリル シートの保護紙コーティングを削除します。
4. ドライ フィット サイズが正しい (図 1 a) であることを確認するすべての材料です。
5. 組み立てるし、アクリル セメントをシリンジを読み込みます。
6. ベース (パーツ C) の上端を外の壁 (B) の長い方の端に合わせ、組み合わせまたは機械工広場を使用して互いに垂直になります。
7. 注射器を使用すると、結合される 2 つの部分の角に直接セメントの小さい、安定したビードを適用します。
8. (約 5 分) を最初に設定されるまで保留 2 つの場所で (パーツ B と C) の部分します。
   注: 通常、彼らは 80%、24 時間で硬化になりますが、アセンブリは、5 分後に続けることができます。
9. 同じベースに外壁 (一部 B) 手順 1.5-1.7 を繰り返します。
10. 手順 1.5-1.7 を使用してベースに 1 つずつ、2 つ内側壁 (Part A) を添付します。
11. さらに、シリンジを使用して小さなを適用と直接セメントの安定したビード今 (B) の外の壁と内側によって形成されているコーナーに壁 (Part A)。
12. 5 分のための場所のこれらの部分を保持します。
13. 24-48 時間後行動のテスト環境のセットアップに進みます。

2. 行動のテスト環境、機器の設定

1. (前述の説明で) 互いとバトルエリア (図 1 b) でアリーナに直面して向かい環境手がかりを配置します。
2. 2 によって 2 方法床や手がかりと視覚入力マウス (図 1 b) を最大化するカメラから適切な距離に丈夫なテーブルのいずれかで 4 つのテスト アリーナを配置します。
3. アリーナと手がかりの間のこれらの距離が適切であることを確認する手がかりに向かって壁を越えて各アリーナの床から支えメートルの棒を使用して視力の行を確認します。
4. カメラの高さとテーブルの高さを調整することによってすべての 4 つのアリーナのビデオ マニュアルを可能にする最適な光路長を決定します。(図 1 b)。
5. カメラを USB 延長ケーブルに接続します。
6. ケーブル配線管を使用して、天井にケーブルを実行し、ビデオを実行しているコンピューターに壁をソフトウェアをキャプチャします。
7. 研究員 (図 1) からテストの領域でマウスを分けるカーテンの背後にあるコンピューターを非表示には。
8. 4 各約 2-5 cm の長さと幅は、少なくとも 3 の別のオブジェクトを組み立てる (図 1) をテストするために使用する高さで 10 cm まで。

図 1: 行動のテスト準備します。(A) オープン フィールド テスト内壁、外壁、として部分 B とベースとして部分 C に対応するパート A とアリーナ アセンブリ。ベースのエッジ全体を実行する 2 つの外側壁 (B パーツ) とベース (パーツ C) の隣接するエッジの外側の壁の間に合わせて 2 つの内部壁 (パーツ A) 完成したアリーナがあります。すべての壁がベースの上に残りの部分します。(B) 0.62 m 高いテーブル、60 × 90 cm 環境手がかり、ライト、およびすべての 4 つのアリーナのキャプチャを同時に実行できるテスト領域のカメラのアリーナの代表的な配置。(C) A のカーテンは、試験中にマウスから実験者とコンピューター システムを隠します。天井の照明は、この撮影のために、テスト中に床ランプのみがあります。また、環境の手がかりの一つはテストの領域のこの写真は取り外されたが、テスト中に、テーブルの後ろにすべての黒のキューに直面して、アリーナの前に第 4 手掛かりが。(D) の代表的なオブジェクト (およびスケールの定規) OLT や水資源のマウスとテストのために適切です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

9. これらのオブジェクトを検証します。
   1. 使用される実験的マウスのセックス、ひずみ、および年齢別グループの代表者の 8 の野生型マウスの最小値を取得 (例えば、 9 週齢女性と男性 c57bl/6 マウスに 6)。
   2. テストの前に 3-5 日間のコース上の 1 分の毎日のすべてのマウスを処理します。
   3. マウスを 4 つのグループに分割し、既に単独で収容されない場合きれいなケージを持って個々 に移動します。
   4. テストの部屋にそれらをもたらす、少なくとも 30 分順応させることができます。
      注: これらの 30 分のための部屋の実験者の存在は実験者が男性²⁰の場合特にタスク中にマウスにストレスが軽減されます。
   5. 馴化に行われ、実験者を開始する準備ができて後、は、録画を開始します。
   6. (リリース コーナーと呼ばれる) アリーナの一角の壁に直面している各マウスを置きます (図 2 a)。
   7. 10 分間自由にアリーナを探索するマウスを許可します。
   8. 録画を停止します。
   9. 20 分の持続期間のための彼らの清潔保持ケージに戻りマウス。
   10. きれいな動物施設とすべての競技は、洗浄方法、次に使う前に嗅覚手がかりを最小限に抑えるための 70% のエタノールで拭くなどをお勧めします。
   11. 両面テープを使用すると、オブジェクトは 6 × 6 cm² (図 2 b) 角の各壁からアリーナで相殺したその 2 非リリース コーナーの近く 2 つの異なるオブジェクトに貼付します。
   12. ビデオの記録を開始します。
   13. リリース コーナーの壁に直面している各マウスを置きます。
   14. アリーナと 10 分間自由にオブジェクトを調査するマウスを許可します。
   15. 録画を停止します。
   16. 場所マウスは 20 分の持続期間のための清潔保持檻の中でバックアップします。
   17. きれいなすべてのアリーナ、動物実験施設を持つオブジェクトは、嗅覚の手がかりを最小限に抑えるための 70% のエタノールで拭くなどの方法をクリーニングすることをお勧めします。
   18. 2 新しいオブジェクトすべてのオブジェクト (少なくとも 3 つ異なるオブジェクト OLT と水資源の両方を行う場合) は、それぞれマウスでテストされているまで同じ場所に貼付、訓練試験を繰り返します。
   19. マウスをオブジェクトの上に座ることができるオブジェクトを除外します。
   20. 手順 4 に従って、各オブジェクトをそれぞれのマウスの調査時間を分析します。
   21. 正または負の固有値を持つオブジェクトを除外します。

3. 行動テストの実施

1. 試験前 1 週間: 個人行動テストの実施の周知
   1. 9 週齢女性と男性 c57bl/6 マウス試験前に 3-5 日間のコース上の 1 分の毎日に大人 6 を処理します。
2. 1 日目: 慣れセッション
   1. マウスを 4 つのグループに分割し、既に単独で収容されない場合きれいなケージを持って個々 に移動します。
   2. テストの部屋にそれらをもたらすと、少なくとも 30 分の試験会場に慣れることができます。
      注:これらの 30 分のための部屋の実験者の存在は、実験者が男性²⁰の場合特にタスク中にマウスのストレスが軽減されます。
3. 馴化に行われ、実験者を開始する準備ができて後、は、録画を開始します。
4. アリーナ (アリーナあたり 1 つのマウス) の各マウスを置きます (図 2 a) リリース コーナーの壁に直面しています。
5. 6 分間自由にアリーナを探索するマウスを許可します。
6. 録画を停止します。
7. (ITI) の間の間隔の間にきれいな持株檻にマウスを戻ります。
8. きれいな動物施設とすべての競技は、洗浄嗅覚の手がかりを最小限に抑えるための 70% のエタノールで拭くなどの方法をお勧めします。
9. 各マウスの 3 慣れセッションの合計の手順 3.3 – 3.9 2 回を繰り返します。
10. すべてのマウスを彼らの家のケージに戻ります。
11. きれいな動物施設とすべての競技は、洗浄翌日に使用前に嗅覚手がかりを最小限に抑えるための 70% のエタノールで拭くなどの方法をお勧めします。
12. 2 日目: 訓練試験、OLT の水資源
    注: 北風はオプションのテストです。
    1. 24 h 後テスト部屋にマウスの同じグループを持って来ると少なくとも 30 分前の日に慣れセッション前に、と試験会場に慣れることができます。
    2. 2 オブジェクト (図 2 b) アリーナに配置されますを使用しての訓練試験を実施します。
       1. 両面テープを使用して、彼らは分野で相殺、その 2 非リリース コーナーからオブジェクト 6 × 6 cm²に貼付します。
       2. ビデオの記録を開始します。
       3. リリース コーナーの壁に直面して慣れセッションの間に実行される各マウスを置きます。
       4. アリーナと 10 分間自由にオブジェクトを調査するマウスを許可します。
       5. 録画を停止します。
       6. 場所マウスは、20 分の ITI の清潔保持檻の中でバックアップします。
       7. きれいなすべてのアリーナ、動物実験施設を持つオブジェクトは、嗅覚の手がかりを最小限に抑えるための 70% のエタノールで拭くなどの方法をクリーニングすることをお勧めします。
    3. OLT を実行します。
       1. 新しい非リリース コーナーに試用の訓練で使用されるオブジェクトの 1 つを移動し、オブジェクトの両面テープ (図 2) でそのコーナーの各壁から 6 cm を押さなければ。
          注: 他のオブジェクトは、トライアル トレーニング中だったままする必要があります。
       2. ビデオの記録を開始します。
       3. リリース コーナーの壁に直面している各マウスを置きます。
       4. 10 分間オブジェクトを調査するマウスを許可します。
       5. 録画を停止します。
       6. 場所マウスは、20 分の ITI の清潔保持檻の中でバックアップします。
       7. きれいなすべてのアリーナ、動物実験施設を持つオブジェクトは、嗅覚の手がかりを最小限に抑えるための 70% のエタノールで拭くなどの方法をクリーニングすることをお勧めします。
    4. 北風を実行します。
       1. 新規オブジェクトに OLT の中に移動されたオブジェクトを置き換えるし、貼る両面テープ (図 2 D) で隅の 2 つの壁から 6 cm の新規のオブジェクト。
       2. ビデオの記録を開始します。
       3. リリース コーナーの壁に直面している各マウスを置きます。
       4. 10 分間オブジェクトを調査するマウスを許可します。
       5. 録画を停止します。
       6. 自分のホームケージでマウスを配置します。
       7. きれいなすべてのアリーナ、動物実験施設を持つオブジェクトは、次の使用前に嗅覚手がかりを最小限に抑えるための 70% のエタノールで拭くなどの方法をクリーニングすることをお勧めします。

図 2: 試験のためアリーナ構成します。(A) オープン フィールド テスト慣れセッション オブジェクトを持たないアリーナ。黒い矢印は、リリース コーナーを示します。このコーナー各アリーナで同じ相対的な位置、テストされているすべてのマウスと毎回毎回一貫しています。(B) トレーニング試験 2 つの異なるオブジェクトが、それぞれ壁から 6 × 6 cm のオープン フィールドにセキュリティで保護されています。(C) ため、OLT の 1 つのオブジェクトは、新しい場所、壁やリリース コーナーないからまた 6 × 6 cm に移動されます。OLT から移動したオブジェクトは今よく知られた目的、(D) のための水資源、OLT に固定されたオブジェクトが新規オブジェクトに置き換えられます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

4. 行動テスト データの分析

注: ビデオの分析は、少なくとも 2 つの独立した、盲目の実験者によって理想的に完了する必要があります。

1. ビデオ ファイルを開きます。
2. 活発な調査を決定するための画面上の各オブジェクトの周囲 2 cm の枠を提供する透明な円を適用します。アリーナは、定規でビデオ ファイル イメージを使用すると、このグリッドを調整します。
3. マウスの行動を観察してマウスが積極的に 2 cm の最大距離でオブジェクトをそのオブジェクトから先のとがった鼻から成っているオブジェクトを調査した時刻を記録します。
   1. レコード タイムスタンプ マウスは、そのオブジェクトの調査を停止するときにオブジェクトとタイム ・ スタンプを調査を開始します。
   2. 試験の持続期間のためアリーナで両方のオブジェクトのこの手順を繰り返します。
   3. マウスがオブジェクト調査の各インスタンスの停止時刻から開始時刻を減算することとすべてのそれらの値を追加することによって各オブジェクトを調査した累積時間を計算します。
4. 合計調査時間や次の数式を使用して差別インデックスの % を計算します。
   1. 合計調査時間の % の計算 =
      
      注: 50% を超える値は、新規の場所またはオブジェクトのより大きい調査を示します。
   2. 差別インデックスの計算 =
      
      注: 正の値は、新規オブジェクトを調査するより多くの時間を示します。ゼロの差別インデックスは、両方のオブジェクトと等しい時間を示します。
5. 結果と比較されるグループの数に応じて、t 検定や分散分析を使用して完全な統計分析をグラフィカルに表現します。

図 3は、男性と女性のアダルト c57bl/6 マウスこのプロトコル6を使用してにより得られた典型的な肯定的な否定的な結果の例を示します。グループのデータを集計する常に OLT と水資源データの解釈が適用されます (以下の説明を参照してください)。単一のマウスの調査時間は、メモリまたはメモリの不足として解釈できません。ただし、マウスのグループのパフォーマンス (すなわち。、複数のサンプル) 他のグループ、または統計的検定を用いた固定チャンス レベルに比較することができます。典型的な研修試用期間中にマウスのグループを表示しない重要な好み平均オブジェクトのいずれかと同様に小説も (図 3 aと3 b) マウスに任意の本質的に負または正の値を持っていません。マウスのグループのデータを集計は、トレーニング中に別のオブジェクトを 1 つの重要な選好を示す場合、その固有の好み/嫌悪感は後続の試験で結果を混乱させるためはこれらオブジェクトを使用できませんする必要があります。また、すべてのマウスの合計調査の時間は、最低基準を満たす必要があります (20 秒21で伝統的に設定) とメモリの後続のテストに影響を与える調査で基準の違いがないことを確認して比較する必要があります。

OLT の中にオブジェクトの場所のためのメモリは、マウス移動したオブジェクト (図 3 a) と総調査時間の 50% 以上の大きな支出の平均に反映されます。個々 のマウスの合計調査時間が大きく異なる場合は結果、オブジェクト (図 3 b) の差別インデックスとして描かれています。図 3Bの平均差別インデックスの大幅な増加に移った後にマウスがオブジェクトに多くの時間を過ごしたことを示します。時間の割合または差別インデックスの増加によって測定されるかどうか、オブジェクトが移動された後の調査では増加はマウスがオブジェクトが訓練の間に位置していた場所を覚えていること示唆しています。

このプロトコルの最後の試みは、物体認識のメモリを評価します。マウスの 1 つのグループの代表的な例は、肯定的な差別インデックス (図 3 D) がそれぞれ 50% と 0 の固定のコントロールの値と比較して、調査時間 (図 3) の平均割合を示します。として OLT データと個々 のマウス間総調査の時間に有意な変動がある場合差別インデックスがこのデータを視覚化するより良い方法。図 3Eは北風と (説明参照) これらのテストで発生する可能性合併症の統計のいくつかの 2 群比較の例を示します。グループ B の 1 サンプルの t 検定では、50% を大幅に上回る調査を示しています、同じテストをグループ A は行わない。この発見は、A と B がお互いから異なっていることを意味しません。グループの違いを決定する、A をグループ B を比較する独立した 2 標本ノンパラ マンホイットニー検定を実行する必要があります。このグループの代表的なデータの 2 つの標本ノンパラ マンホイットニー検定の大きな違いを示します (p = 0.66) 新規オブジェクト調査時間の割合で 2 つのグループの間。

OLT と水資源がオブジェクトの本質的な価値に非常に敏感と結果を混同することが本質的なバイアスがないことを確認する必要があるオブジェクトの等価性のテストします。図 3 fと3 Gは、不適切なオブジェクトの選択の例を示します。4 のサンプル サイズとパイロット テストでは、マウスは、オブジェクト A はオブジェクト B (図 3 f) と対になってときと調査時間の 50% 未満の支出傾向を示した。これらのオブジェクトは、新しいオブジェクトおよび 16 の大きなサンプル サイズとしてオブジェクト A と水資源の使用された、マウスはよりかなり低い時間の 50% 調査オブジェクト A と (図 3) を過ごした。新規オブジェクトにこの嫌悪感は簡単に認識できるここでは実験の技術的な欠陥としてオブジェクト固有設定/回避のためのパイロット テストが不可欠である理由を例証。

図 3: 野生型アダルト c57bl/6 マウスの行動テスト データ。(A) 調査の結果、オブジェクトが移動された後の OLT ショーの大幅な増加とトライアルのトレーニング中に移動されたオブジェクトの % の合計調査時間の比較。p < 0.0001、t 検定。(B) トレーニングおよび差別インデックスとして表示されます OLT 試験中に移動されたオブジェクト調査のため代表的な結果は、同様に移動後オブジェクトの調査で有意な増加を示すp < 0.0001、t 検定。北風の新規オブジェクトの (C) パーセントの合計調査時は、新規オブジェクトを調査するための重要な設定を示しています。* * p = 0.0024、1 標本 t 検定対。50%。(D) 代表は、識別指数は同様に新規オブジェクトを調査するための好みを示す表示水資源の新規オブジェクト調査の結果します。* * p = 0.0024、1 標本 t 検定対0。(E) マウスの 2 つの異なるグループを含む水資源分析の代表的な結果。グループ B は 1 標本 t 検定によって 50% と大きく異なる (* * p = 0.0024)、グループ A はしていません (p = 0.5837)。分離解析グループを比較する 2 サンプル マンホイットニー検定される不均一なグループのサイズのため、調査に大きな違いが見つからない場合 (p = 0.66、ns)。(F) オブジェクトをサイズの小さいサンプルで検証試験中の時間の割合は、オブジェクトへの嫌悪の傾向を示しています。p = 0.2159、1 サンプルの t テスト。(G) 新規オブジェクトで、サンプル サイズを大きくと、水資源の新規オブジェクトとして使用 (F) からオブジェクト、オブジェクトに大きな嫌悪感が発見です。* p = 0.0270、1 サンプルの t テスト。これは、オブジェクトの選択の技術的な失敗の例です。± SEM. データ C E は前の文書6から合わせられるパネルからの意味、データが掲載されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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