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方法論記事

単層カーボンナノ チューブ (SWCNT) による生体内での多発性骨髄腫細胞の増殖の抑制-MALAT1 アンチセンス Oligos を配信

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DOI:

10.3791/58598

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2018年12月13日

 ,  , 
1Department of Cancer Biology, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Medical Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この原稿は、単層カーボンナノ チューブ (SWCNT) の合成を説明します-共役、SWCNT の確実な配信との強力な治療効果を発揮する MALAT1 gapmer アンチセンス DNA オリゴヌクレオチド (SWCNT 対策 MALAT1)反 MALAT1 の in vitro および in vivo。合成、修正、活用方法を使用し、SWCNT 反 MALAT1 の注入.

要約

単層カーボンナノ チューブ (SWCNT) は、合成小分子薬、オリゴヌクレオチド、タンパク質などの細胞に複数の種類の薬を提供するのに使用されているナノ粒子の新しいタイプです。SWCNT、カスタマイズ可能な寸法、表面的な広域がありその表面にさまざまな変更を薬で柔軟にバインドできます。したがって、それは細胞に薬を輸送するための理想的なシステムです。長鎖非コード Rna (lncRNAs) 性 RNA 200 以上のクラスターは、nt では、蛋白質に翻訳することはできませんが、生物学的および病態生理学的プロセスに重要な役割を果たします。転移による肺腺癌成績証明書 1 (MALAT1) は非常に節約された lncRNA です。ハイレベル MALAT1 多発性骨髄腫 (MM) を含む様々 な癌の予後に関連していることを示した。我々 は MALAT1 が MM; 重さ: DNA 修復と細胞死を調節することを明らかにしました。したがって、MALAT1 は、ミリメートルのため治療上のターゲットとして考えることが。しかし、体内の MALAT1 の抑制/ノックダウンするアンチセンスの oligo の効率的な配信はまだ問題です。本研究で我々 ペグ 2000 SWCNT を変更してそれに反 MALAT1 オリゴを共役、この化合物の in vitro の配信をテスト、播種 MM マウス モデルに静脈内に挿入し、観察する示す MM 進行を大幅に抑制その SWCNT 反 MALAT1 gapmer DNA の最適な配信シャトルしています。

概要

SWCNT は理想的な忍容性と体外1と生体2で最小毒性安定的かつ効率的に薬、タンパク質、低分子核酸などの様々 なタイプを提供できる斬新なナノ材料です。機能性 SWCNT 素晴らしい生体適合性と水への溶解度が小さい分子シャトルとして使用することができます、細胞膜3,4,5を貫通するそれらを運ぶことができます。

lncRNAs は RNA のクラスター (> 200 nt) それはゲノムから mRNA に転写されますが、タンパク質に変換することはできません。増加する証拠は、lncRNAs 遺伝子式6の規制に参加し、開始と MM7,8,9を含むがんのほとんどの種類の進行に関与していることを示しています。MALAT1 は核濃縮の非翻訳転写 2 (NEAT2) と非常に節約された lncRNA10。MALAT1 転移性肺非小細胞癌 (NSCLC)11、当初認識されましたが数多く腫瘍5,12,13; で過剰に発現されています。それは最も高い表現の lncRNAs の一つで、MM8,14の予後と相関しています。MALAT1 の発現レベルは致命的なコース髄 MM 患者のみ15MM と診断されたものと比較して有意に高かった。

以前の研究では、ターゲット MALAT1 gapmer DNA アンチセンス オリゴヌクレオチドを使用してによって、反 MALAT1 oligos 確実 DNA 損傷と MM16アポトーシスにつながるを確認した (アンチ MALAT1) MM 細胞に。Gapmer DNA をアンチセンス DNA 構成・ 2'-青梅-Rna、RNase H 一度バインド活動17MALAT1 胸の谷間を促す可能性がありますしました。アンチセンス oligos の in vivo デリバリー効率はまだその臨床での使用を制限します。

配信をテストするには、DNA は DSPE PEG2000 アミン標識抗 MALAT1 gapmer 抗 MALAT1 gapmer oligos の SWCNT の効果は、SWCNT を官能基化。SWCNT 反 MALAT1、静脈内に注入 MM 播種性マウス モデル;4 回の治療後は、印象的な抑制が観察されます。

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プロトコル

すべての実験動物を含む事前クリーブランド クリニック IACUC (機関動物ケアおよび使用委員会) によって承認されました。

1. 機能性カーボンナノ チューブの合成

  1. 単層カーボンナノ チューブの 1 mg、5 mg DSPE ・ PEG2000 - アミンとシンチレーション バイアル (20 mL) での滅菌ヌクレアーゼ フリー水 5 mL を混ぜます。それを振るも完全にすべての試薬を溶解します。
  2. 室温で 1 時間 40 W の電力レベルで水風呂超音波発生装置でバイアルを超音波 (20 分 x 3、RT は、過熱を避けるために水 20 分毎を変更)。6 時間 24,000 × gで遠心分離し、上澄みを収集します。この機能の SWCNT ソリューションは、2 ヶ月の 4 ° C で保存できます。
  3. 滅菌ヌクレアーゼ フリー水 4 mL に続いて 100 kDa MWCO 遠心ろ過デバイスにステップ 1.2 から SWCNT 溶液 1 mL を追加します。余分な DSPE PEG2000-アミンを削除する RT で 4,000 x gで 10 分間遠心します。水および遠心分離 5 4 mL の添加を繰り返し x。各遠心分離後残った SWCNT 溶液 0.5 mL 以上フィルターにされません。
  4. 808 で紫外/可視分光器を用いたフィルターの残りの SWCNT の溶液の濃度を測定後は最終的な洗浄。最終濃度は、通常 50 mg/L (カムら18によって開発された方法に従って算出) です。
    注:DSPE PEG 修飾単層カーボンナノ チューブが水溶性で 1.4 の手順の後、数週間後表示される集計せず異なる生物学的ソリューションで安定していることを確認します。

2. 2'-O 変更された Rna 機能性 SWCNT が並ぶ反 MALAT1 Gapmer DNA の活用

  1. DSPE PEG2000 アミンの 450 μ L にスルホ LC SPDP の 0.5 mg 修飾 SWCNT を追加します。10 x PBS の 50 μ L を追加し、室温 2 時間インキュベート
  2. 余分なスルホ-LC-SPDP を削除するには、ヌクレアーゼ フリー水 4 mL に続いて 100 kDa MWCO 遠心ろ過デバイスにステップ 2.1 からの反応を追加します。5 倍の水と遠心分離した繰り返しの 4 mL を加えて 4,000 x gで 10 分間遠心します。
  3. 200 nM チオール修飾した反 MALAT1 Cy3 gapmer DNA に商業の DTT 溶液 1.5 mL を追加し、NAP 5 列、次の製造元のプロトコル製品した浄化で 90 分間インキュベートします。溶出が 500 μ L 滅菌ヌクレアーゼ フリー 1 のと反 MALAT1 Cy3 PBS x。
    注:機能性の SWCNT はチオール抗 MALAT1 gapmer DNA の貯蔵の間に形成されるジスルフィド結合を切断可能性があります追加の DTT、と共に格納できます。追加の DTT を SWCNT と共役前に、aNAP 5 列で削除できます。
  4. スルホ LC SPDP 扱われる DSPE PEG2000 アミン SWCNT のソリューションがフィルターに残さを収集し、反 MALAT1 Cy3 ソリューションの 500 μ L で希釈します。その後、4 ° C 24 時間でそれを孵化させなさい。共役 SWCNT 反 MALAT1 は、3 週間の 4 ° C で保存できます。同じ手順に従って、スクランブル アンチセンス オリゴと共役の SWCNT を合成し、SWCNT コントロールとして使用できます。

3 SWCNT 反 MALAT1 の尾静脈注射

  1. MM 播種性マウス モデルを生成します。
    1. 比較の最良の結果を達成するために 14 うなずきをランダムに配置します。試用版または制御グループ (各グループのセブン) を同じ男性/女性の比率が CB17-Prkdcscid/J マウス (8 週齢)。
    2. 操作ベンチをきれいにし、70% アルコールで消毒します。
    3. 尾に表示される静脈のためマウスを暖める暖房ランプを使用します。尾注入落と正しくマウスを抑制します。
    4. 50 μ L の PBS 尾静脈麻酔なしで 5 × 106 MM.1S リュック mCherry セルを挿入します。30 s. マーク挿入されたマウスのアルコール綿で注射部位を押すし、きれいなケージに戻ります。
  2. MM.1S 細胞投与後 7 日目に治療を開始します。
    1. マウスの尾静脈に SWCNT アンチ MALAT1 を含む PBS の 50 μ L を注入します。SWCNT-コントロールをコントロールとしてを含む PBS を使用します。
    2. 30 アルコール綿で注射部位を押して s。
    3. 尾と、1 分間マウスの一般的な動作にローカル出血を観察し、清潔なケージに戻します。ケージをラックが、注射がよく容認されるかどうかを確認するに戻る前に再度すべて注入されたマウスを観察します。
  3. 注入実験の終了まで 7 日ごとを繰り返します。
    1. マウスの一般的な健康の低下に実験を終了する: ない食事や飲酒、薄い足の外観、皮下出血、息切れの活動に触れることができる質量および/または、下肢の麻痺が減少し、腹部を観察すると。

4。 病気の進行の評価

  1. 毎日 MM.1S リュック mCherry 細胞の注入後マウスの全般的な状態を評価します。マウスを開発する場合に特定の注意を払うは、下肢の麻痺します。
  2. システムを使用して生体内イメージング 1 倍の週、SWCNT 反 MALAT1 注入前に腫瘍の成長を評価します。
    1. 1x PBS で新鮮な 15 mg/mL D-ルシフェリンを準備します。
    2. イソフルラン気化器 (誘発のための 3-5% とマウスの状態によって、メンテナンスのための 1-3%) を持つマウスを麻酔します。
    3. 各マウスにおける D-ルシフェリンを 150 mg/kg を腹腔内に注入、イメージ投射; 前に、5 分その後、イメージング システム、スペクトルと腹臥位でマウスをイメージします。
    4. 発光飽和に達するまでマウス 2 分ごとの時系列画像を収集します。D-ルシフェリン取り込み/信号に応じて間隔を調整します。
  3. 実験の終了に達するマウスを犠牲にする CO2を使用します。
  4. これは、MM 播種性モデルは、マウスのように処理します。
    1. 解剖前にマウスの重量を量る。
    2. 血球カウンター マシンによって実行される完全な血計算 (CBC) 分析のための中心から末梢血を収集します。白血球と赤血球のカウントだけでなく、リンパ球の比率は、プライマリ インデックスです。
    3. 脾臓を隔離し、それの重量を量る。脾臓/体重比を計算します。検討 > 脾臓の腫大として 0.5%。
    4. 目に見える転移組織骨髄、脾臓、リンパ節、腎臓の組織を収集します。
    5. マウス下肢の麻痺を開発する場合は、脊椎を収集します。
    6. 骨髄のサンプルから RNA やタンパク質を抽出します。
    7. ホルマリンのすべての残りの組織を修正します。
    8. 脱灰、固定の 24 h 後 5 日間 0.25 M EDTA 溶液 (pH 8.0) で骨標本を浸します。
    9. 長期保存のための 75% アルコールのすべてのサンプルを浸します。
  5. 2 つのグループで同じ時点でルシフェラーゼの信号強度を比較します。両方のグループから各マウスの犠牲の日付を記録し、ソフトウェアで 2 つのグループの生存曲線を計算します。
    注:図 1は、すべての手順をまとめたものです。

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結果

反 MALAT1 gapmer MM で DNA の抑制効果を示すためには、我々 は MALAT1 の発現をノックダウンし、H929 および MM.1S 細胞でそれを使用します。48 時間後、ノックダウン効率の分析のため収集された細胞と抗 MALAT1 gapmer またはコントロール DNA 細胞のアポトーシスの状態をトランスフェクトしました。qRT PCR 結果反 MALAT1 gapmer DNA が効率的にノックダウン H929 と MM.1S 細胞における MALAT1 の発現を示した (図 2A)。ダウン規制 MALAT1 アポトーシス明らかにフローサイトメトリーによるアポトーシスの状態を求めた (図 2B)。

反 MALAT1 oligos ミリメートル...

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ディスカッション

証拠は lncRNAs MM7,8,9; を含む癌の多数の生理学的および病態生理学的プロシージャの規則の部分を取ることを示しています。アンチセンスオリゴヌクレオチド20,21,22では実現することができますがん治療の対象となる可能性があります。米国食品医薬品局 (FDA) は、サイトメガロ ウイルス網膜炎23、ホモ接合体家族性高コレステロール血症24の nusinersen の mipomersen の fomivirsen を含むいくつかのアンチセンス オリゴヌクレオチドの薬を承認しました。脊髄性筋萎縮症25日、デュシェンヌ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者に感謝ラーナー研究所ゲノム、プロテオームと彼らの支援のためのイメージング コアとサポートします。資金: この作業は、財政的に NIH/NCI の助成 R00 CA172292 (J.J.Z.) に (J.J.Z.) をスタートアップ資金と臨床トランスレーショナル科学共同 (CTSC) (J.J.Z.) にケース ウェスタン リザーブ大学コア使用率のパイロット グラントのによって支えられました。この作品は、国立機関の健康 SIG グラント 1S10OD019972-01 からの資金で購入したライカ SP8 共焦点顕微鏡を利用されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
SWCNTsミリポアシグマ704113
DSPE-PEG2000-アミンアバンティ 極性脂質880128
バス超音波処理装置VWR97043-992
4 mL 遠心フィルターミリポアシグマZ740208-8EA
UV/VIS分光計サーモフィッシャーサイエンティフィックaccuSkan GO UV/Vis マイクロプレート分光光度計808 nm での吸光係数 0.0465 L/mg/cm
Sulfo-LC-SPDPProteoChemc1118
DTT solutionMillipore-Sigma43815
NAP-5 columnGE Healthcare17-0853-01
in vivo イメージングシステムPerkinElmer
NOD.CB17-Prkdcscid/J マウスCharles River lab250
Flow cytometerBecton Dickinso
LipofectamineInvitrogen11668019Lipofectamine2000
ウシ胎児血清 (FBS)Invitrogen10437-028
RMPI-1640 mediumInvitrogen11875-093
MALAT1-QF:IDTにより合成会社5' - GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3'
MALAT1-QR:IDT社5'- TCCTCAACACTCAGCCTTTATTATC - 3'
GAPDH-QF:IDT社5'- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3'
GAPDH-QR:IDT社5'- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3'
SYBR Green PCR マスターミックスを使用した定量PCR サーモフィッシャーサイエンティフィックA25780
RevertAid ファーストスタンド cDNA 合成キットサーモフィッシャーサイエンティフィックK1621
抗 MALAT1IDT 社5'-mC*mG*mA*mA*mA*a*t*T
*G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3'
細胞生存率アッセイキットプロメガコーポレーションG7570CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit
accuSkan GO UV/Vis マイクロプレート分光光度計サーモフィッシャー サイエンティフィック
遠心フィルターミリポアシグマUFC910008
SPSSソフトウェアIBMバージョン24.0
D-ルシフェリンミリポアシグマL9504
によって合成 合成 によって合成 製合成

参考文献

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