この原稿は、単層カーボンナノ チューブ (SWCNT) の合成を説明します-共役、SWCNT の確実な配信との強力な治療効果を発揮する MALAT1 gapmer アンチセンス DNA オリゴヌクレオチド (SWCNT 対策 MALAT1)反 MALAT1 の in vitro および in vivo。合成、修正、活用方法を使用し、SWCNT 反 MALAT1 の注入.
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方法論記事
単層カーボンナノ チューブ (SWCNT) による生体内での多発性骨髄腫細胞の増殖の抑制-MALAT1 アンチセンス Oligos を配信
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
単層カーボンナノ チューブ (SWCNT) は、合成小分子薬、オリゴヌクレオチド、タンパク質などの細胞に複数の種類の薬を提供するのに使用されているナノ粒子の新しいタイプです。SWCNT、カスタマイズ可能な寸法、表面的な広域がありその表面にさまざまな変更を薬で柔軟にバインドできます。したがって、それは細胞に薬を輸送するための理想的なシステムです。長鎖非コード Rna (lncRNAs) 性 RNA 200 以上のクラスターは、nt では、蛋白質に翻訳することはできませんが、生物学的および病態生理学的プロセスに重要な役割を果たします。転移による肺腺癌成績証明書 1 (MALAT1) は非常に節約された lncRNA です。ハイレベル MALAT1 多発性骨髄腫 (MM) を含む様々 な癌の予後に関連していることを示した。我々 は MALAT1 が MM; 重さ: DNA 修復と細胞死を調節することを明らかにしました。したがって、MALAT1 は、ミリメートルのため治療上のターゲットとして考えることが。しかし、体内の MALAT1 の抑制/ノックダウンするアンチセンスの oligo の効率的な配信はまだ問題です。本研究で我々 ペグ 2000 SWCNT を変更してそれに反 MALAT1 オリゴを共役、この化合物の in vitro の配信をテスト、播種 MM マウス モデルに静脈内に挿入し、観察する示す MM 進行を大幅に抑制その SWCNT 反 MALAT1 gapmer DNA の最適な配信シャトルしています。
概要
SWCNT は理想的な忍容性と体外1と生体2で最小毒性安定的かつ効率的に薬、タンパク質、低分子核酸などの様々 なタイプを提供できる斬新なナノ材料です。機能性 SWCNT 素晴らしい生体適合性と水への溶解度が小さい分子シャトルとして使用することができます、細胞膜3,4,5を貫通するそれらを運ぶことができます。
lncRNAs は RNA のクラスター (> 200 nt) それはゲノムから mRNA に転写されますが、タンパク質に変換することはできません。増加する証拠は、lncRNAs 遺伝子式6の規制に参加し、開始と MM7,8,9を含むがんのほとんどの種類の進行に関与していることを示しています。MALAT1 は核濃縮の非翻訳転写 2 (NEAT2) と非常に節約された lncRNA10。MALAT1 転移性肺非小細胞....
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プロトコル
すべての実験動物を含む事前クリーブランド クリニック IACUC (機関動物ケアおよび使用委員会) によって承認されました。
1. 機能性カーボンナノ チューブの合成
- 単層カーボンナノ チューブの 1 mg、5 mg DSPE ・ PEG2000 - アミンとシンチレーション バイアル (20 mL) での滅菌ヌクレアーゼ フリー水 5 mL を混ぜます。それを振るも完全にすべての試薬を溶解します。
- 室温で 1 時間 40 W の電力レベルで水風呂超音波発生装置でバイアルを超音波 (20 分 x 3、RT は、過熱を避けるために水 20 分毎を変更)。6 時間 24,000 × gで遠心分離し、上澄みを収集します。この機能の SWCNT ソリューションは、2 ヶ月の 4 ° C で保存できます。
- 滅菌ヌクレアーゼ フリー水 4 mL に続いて 100 kDa MWCO 遠心ろ過デバイスにステップ 1.2 から SWCNT 溶液 1 mL を追加します。余分な DSPE PEG2000-アミンを削除する RT で 4,000 x gで 10 分間遠心します。水および遠心分離 5 4 mL の添加を繰り返し x。各遠心分離後残った SWCNT 溶液 0.5 mL 以上フィルターにされません。
- 808 で紫外/可視分光器を用いたフィルターの残りの SWCNT の溶液の....
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結果
反 MALAT1 gapmer MM で DNA の抑制効果を示すためには、我々 は MALAT1 の発現をノックダウンし、H929 および MM.1S 細胞でそれを使用します。48 時間後、ノックダウン効率の分析のため収集された細胞と抗 MALAT1 gapmer またはコントロール DNA 細胞のアポトーシスの状態をトランスフェクトしました。qRT PCR 結果反 MALAT1 gapmer DNA が効率的にノックダウン H929 と MM.1S 細胞における MALAT1 の発現を示した (図 2A)。ダウン規制 MALAT1 アポトーシス明らかにフローサイトメトリーによるアポトーシスの状態を求めた (図 2B)。
反 MALAT1 oligos ミリメートル.......
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ディスカッション
証拠は lncRNAs MM7,8,9; を含む癌の多数の生理学的および病態生理学的プロシージャの規則の部分を取ることを示しています。アンチセンスオリゴヌクレオチド20,21,22では実現することができますがん治療の対象となる可能性があります。米国食品医薬品局 (FDA) は、サイトメガロ ウイルス網膜炎23、ホモ接合体家族性高コレステロール血症24の nusinersen の mipomersen の fomivirsen を含むいくつかのアンチセンス オリゴヌクレオチドの薬を承認しました。脊髄性筋萎縮症25日、デュシェンヌ.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
著者に感謝ラーナー研究所ゲノム、プロテオームと彼らの支援のためのイメージング コアとサポートします。資金: この作業は、財政的に NIH/NCI の助成 R00 CA172292 (J.J.Z.) に (J.J.Z.) をスタートアップ資金と臨床トランスレーショナル科学共同 (CTSC) (J.J.Z.) にケース ウェスタン リザーブ大学コア使用率のパイロット グラントのによって支えられました。この作品は、国立機関の健康 SIG グラント 1S10OD019972-01 からの資金で購入したライカ SP8 共焦点顕微鏡を利用されています。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| SWCNTs | ミリポアシグマ | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-アミン | アバンティ 極性脂質 | 880128 | |
| バス超音波処理装置 | VWR | 97043-992 | |
| 4 mL 遠心フィルター | ミリポアシグマ | Z740208-8EA | |
| UV/VIS分光計 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | accuSkan GO UV/Vis マイクロプレート分光光度計 | 808 nm での吸光係数 0.0465 L/mg/cm |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| DTT solution | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| in vivo イメージングシステム | PerkinElmer | ||
| NOD.CB17-Prkdcscid/J マウス | Charles River lab | 250 | |
| Flow cytometer | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| ウシ胎児血清 (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | IDTにより合成会社 | 5' - GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3' | |
| MALAT1-QR: | IDT社 | 5'- TCCTCAACACTCAGCCTTTATTATC - 3' | |
| GAPDH-QF: | IDT社 | 5'- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3' | |
| GAPDH-QR: | IDT社 | 5'- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3' | |
| SYBR Green PCR マスターミックスを使用した定量 | PCR サーモフィッシャーサイエンティフィック | A25780 | |
| RevertAid ファーストスタンド cDNA 合成キット | サーモフィッシャーサイエンティフィック | K1621 | |
| 抗 MALAT1 | IDT 社 | 5'-mC*mG*mA*mA*mA*a*t*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3' | |
| 細胞生存率アッセイキット | プロメガコーポレーション | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit |
| accuSkan GO UV/Vis マイクロプレート分光光度計 | サーモフィッシャー サイエンティフィック | ||
| 遠心フィルター | ミリポアシグマ | UFC910008 | |
| SPSSソフトウェア | IBM | バージョン24.0 | |
| D-ルシフェリン | ミリポアシグマ | L9504 |
参考文献
- Jiang, X., et al. RNase non-sensitive and endocytosis independent siRNA delivery system: delivery of siRNA into tumor cells and high efficiency induction of apoptosis. Nanoscale. 5 (16), 7256-7264 (2013).
- Murakami, T., et al.
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再版と許可
