開発および家兎 VX2 モデルの肝臓がん用血管造影

サマリー

この記事の目的は、開発と肝臓がんの VX2 癌家兎モデルの使用のための手引きを提供することです。

要約

家兎 VX2 腫瘍は、一般に肝細胞癌 (HCC) 放射線の分野に関するトランスレーショナル ・ リサーチの利用動物モデルです。このモデルでは、素朴な受信者の肝臓に最終的な収穫と同種移植のドナー ウサギの骨格筋で容易かつ確実に伝達される未分化の扁平上皮細胞癌を採用しています。この腫瘍移植急速に実行可能な血管増生カプセルに囲まれた壊死性コアによって特徴付けられる血管造影を特定できる腫瘍に受信者のウサギの肝臓内で成長します。ウサギの解剖学の物理的なサイズ血管計測アプリケーションを可能にする、様々 なインターベンション技術のテストを容易にするために十分です。これらの利点にもかかわらず、モデルを扱う研究者の具体的な基準として技術的なリソースの不足が存在します。ここで、開発、成長、伝播、および初心者および経験豊富な実務者用ウサギ VX2 腫瘍モデルの血管造影の使用率の技術的側面の包括的な視覚的な概要を紹介します。

概要

家兎 VX2 腫瘍モデル 1935年^1,2年開発以来実験腫瘍学における役割を果たしています。この腫瘍がウイルス性未分化癌腫瘍濃染像、急速な成長および骨格筋^3,4簡単な伝達によって特徴付けられます。家兎 VX2 腫瘍モデルは癌^5,6,7,8; の多数を調査する使用されてきました本稿の焦点は肝細胞癌⁹です。

記載されているメソッドの目的は、肝臓癌のトランスレーショナルリサーチの介入放射線科医によって使用できる肝細胞癌 (HCC) モデルを提示です。薬物動態学的研究、治療の調査、アブレーション法^{10、11,12,13,14,15}のテストに使用できます。

ここに詳細なメソッドはネズミのような齧歯動物モデルなど同じ球内の他のモデル上の複数の利点を生成霊長類¹⁶のような大きなモデルやマーモット、マウス。主な利点の 1 つは、最初後肢伝搬¹⁷ヶ月以内アクティブ腫瘍ラインを確立する研究者を可能にする高速で信頼性の高い腫瘍の成長です。さらに、この腫瘍は簡単な超音波可視性および血管周囲動脈局所治療、アブレーション治療を可能にします。最後に、そして最も重要なは、ウサギの血管のサイズは血管計測¹⁸可能と技術的に簡単の利用を許可します。

プロトコル

次のプロトコルは、すべての要件およびガイドライン - イリノイ大学によって統治を委任シカゴを従います。確認済みであり、ローカルで実行する前に機関動物ケアおよび使用委員会承認します。

1. VX2 後肢腫瘍開発

1. 国立がん研究所部門の癌治療の診断と治療/腫瘍細胞ライン リポジトリから VX2 腫瘍細胞株を調達します。
   注: この時、注文カタログ見つけることができます次のリンクで: https://dtp.cancer.gov/repositories/。
2. インジェクションの細胞懸濁液を準備をするには、彼らは解凍までぬるま湯で冷凍の VX2 サンプルとセルロース培地を配置します。
   1. 解凍の細胞懸濁液の 0.5\u20121 mL と解凍・ メチル セルロース培地の等しい量を 5 mL 注射器に吸引します。
      注: 21 または 22 G 針細胞懸濁液を吸引してメチル セルロース培地を吸引するより大きいゲージの針を使用することがあります。氷の上の注射器を配置します。
3. 1 mg/kg アセプロマジンと筋肉に与えられた 0.02 mg/kg ブプレノルフィンを使用して鎮静から始まる細胞の懸濁液の接種の後肢腫瘍ドナーのウサギを準備します。接種部位 (下肢) をバリカンで剃るし、クリーン、剃毛は、アルコールまたはヨウ素基剤。
   注: メロキシカムできます 0.2 mg/kg の投与量で注射は皮下投与鎮痛のため。ウサギの毛皮は剃りにくいです。研究者に対して、まず毛皮の大部分をクリアし肌にバリカンを押すと、穀物に対して行くことに焦点を当てて複数のパスを実行することをお勧めします。
4. 16 G 針を含む細胞懸濁液 5 mL シリンジに接続し、約 1 cm の深さのドナー ウサギの後肢筋の腹に懸濁液の 1 mL を注入します。必ず大腿骨に沿って明白な groove 内で実行している坐骨神経をガードしてください。
   注: 新鮮な VX2 正常に再接種 88% の被験者間冷凍と解凍の VX2 は¹⁹時間の成功の 33%。
   注意: VX2 腫瘍は迅速に成長します。腫瘍の進行は、注意されるかもしれない副作用: 行動の変化 (例えば、珍しい積極性) 低下覚醒・無気力呼吸数を増加します。したがって、勧告は動物を密接に監視し、接種後 2 週間以内の腫瘍の収穫の計画します。

2. VX2 後肢腫瘍成長と収穫

白々しいあります注: 成功した接種と仮定すると、2 週間以内に注射部位の大きさの腫瘤 (3\u20124 cm)。通常、この結節が触知する約 1 週間。ただし、腫瘍の成長を可能にする十分なティッシュのコレクションをできるようにすることをお勧めします。通常、この結節は、硬結、しっかりと筋肉のレベルの上の高架になります。もし

1. 接種から 2 週間で接種周辺を触診します。2 週間で腫瘍の成長が検出されない場合は、手順 1 をもう一度実行します。図 1を参照してください。
   注: 腫瘍の存在は、超音波を経由しても評価することができます。ない新鮮な在庫と比較して凍結ストックから伝達されたときの腫瘍成長指標の違いを評価するために研究されているが、それは冷凍ストック腫瘍の成長はやや遅く私たちの経験をされているし、その新鮮な在庫後検出することカウンターの一部です。関係なく、どちらの方法は、2 週間で収集可能な腫瘍を得られるはず。
2. 腫瘍の収穫の後肢腫瘍ドナーを準備します。45 mg/kg 5 mg/kg とケタミン ・ キシラジンとウサギを麻酔します。ナトリウム ペントバルビ タール 390 mg/kg 以上の静脈内投与 (IV) 線量と安楽死させます。
3. ウサギが安楽死されて、研究者が適当どちらのサイズの刃でメスを用いた腫瘍結節を覆う皮膚および皮下組織を除去することによって腫瘍を収穫開始します。図 2を参照してください。
4. 後肢筋内腫瘍結節が識別されたら、腫瘍のen のブロックワイド曲線余白を使用を削除します。このための近位および遠位端の腱の添付ファイルのポイントをカット、筋し、トレース、メスの刃、基になる骨に沿って。腫瘍被膜と壊死性コア公開器官培養切片標本を二等分します。図 3を参照してください。
   メモ: VX2 腫瘍高度壊死性のコアがあります。腫瘍被膜への損傷は壊死の高圧吐出につながるので、腫瘍を収穫するときに適切な目の保護とその他の保護具を使用してください。
5. 優しくこすり (例えば鉗子、止血剤) 腫瘍をきれいに鈍器で壊死性のコア。これが腫瘍のカプセルとカプセルと周囲の筋肉の間の転移点のより良い視覚化の許可。図 4を参照してください。
6. このサンプルから腫瘍のいくつかの部分を収穫約 1\u20122 mm³すぐに部屋の温度滅菌生理食塩水の入ったコップに保管します。
   注: その後の肝移植へのこれらの腫瘍のサンプルが使用されます。
7. 滅菌シャーレに残存腫瘍を配置、ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) で浸しなさい。この標本は、氷で冷たい保たれるが場合、は、2\u20123 h までを後で処理するため保存できます。

3. 開腹による肝癌注入

1. 開腹の受信者のウサギを準備します。45 mg/kg ケタミン ・ キシラジン 5 mg/kg を使用して受信者のウサギの麻酔挿管と 1%-- 続いて誘導として 3% イソフルラン必要があります。ウサギは麻酔、バリカンを使用して手術部位を剃る。Betadine スクラブ、70% エタノール、betadine ソリューションと帳票の洗浄を使用して切開部分をきれいにし、滅菌手術方法の腹部をおいましょう。
2. #15 ブレードを使用すると、剣状突起からウサギの皮膚を通して小さな下方垂直正中切開を行い、開腹を開始します。これは簡単に触診する必要があります、大体アメリカのペニーのサイズにする傾向があります。図 5を参照してください。
3. 皮膚を反映し、識別、 linea alba。これは正中線の下方に旅行組織の反射白のバンドをする必要があります。鈍的切離を使用して走査する、 linea albaし腹膜を公開します。図 6を参照してください。
   注: 腹膜は、それ直接、呼吸移動見ることができる腸が覆うされますので簡単に識別されます。
   注意: する傾向にある腹膜表面張力により基になる腸に付着。鈍的外傷を使用して解剖する、リネア アルバ基になる腸穿孔の危険性を消費するのに役立ちます。
4. 一度腹膜を公開すると、慎重に腹膜腔を入力してそれを分析します。肝臓を識別今ことができます。腹部領域を移動するには、皮膚、筋肉、腹膜を介して下方に正中線切開 1\u20122 cm を拡張します。
   注: 正中切開を拡張する行うことができます簡単かつ安全に慎重にで腹膜表面に向けて先端が曲線状で湾曲した止血を腹膜腔に挿入。若干、止血を開くし、止血の 2 本の腕間の組織キュートにブレードを使用します。
5. 腫瘍の注入のサイトを選択するために、肝臓の左葉を識別します。左の葉は infero 側正中線で座っている内側の葉です。
6. 腹膜腔から肝臓を描画する前に、切開部の下面にガーゼの乾燥部分を配置します。
   注: ガーゼは腹部に戻って撤回を防ぐために肝臓を置く付着面を提供します。
7. 非外科的鉗子や湿らせたガーゼを使った指、慎重に切開して腹部から肝臓の左葉を描画、以前置かれて乾燥ガーゼにそれを置きます。図 7を参照してください。
   注意: 肝カプセルは敏感で、簡単に破断することができます。被膜出血、肝挫傷、および/または最終的な腹腔内出血を防ぐためにこの器官を取り扱う際に優しくなることが重要です。
   注: 通常、肝臓、宣言自体視覚的に入ると腹膜腔;ただし、ウサギの胃を膨張させたと、視界から肝臓を頭側プッシュできます。この場合、鈍的プローブを用いた腹壁をそっと持ち上げます。このシナリオでは、肝臓は鈍的プローブを用いた肝臓を慎重に別の表面張力により横隔膜の腹側面に付着する傾向し、それをデタッチする必要があります。非外科的鉗子を使用して、肝臓を引き出します。
8. この時点で注入の腫瘍組織を準備し、それを保護するために肝臓に湿らせたガーゼの部分を配置します。
9. 肝臓に注入用 2.6 ステップ中に生成された腫瘍組織の 1\u20122 mm³の部分を選択します。図 8を参照してください。
10. #11-刃を使用して、肝肝カプセルの背側面を貫通しないように世話 0.5 cm 深いポケットを作る 45 ° の角度で穴を開けます。穿刺を行った後、場所に刃を残します。図 9を参照してください。
11. 肝床に小さなポケットを作成する腹側方向に刃をそっと持ち上げます。鉗子を使用して腫瘍部分を取る、このポケットで腫瘍部分を配置し、ブレードを削除します。
    注: 腫瘍部分を挿入する前にブレードを削除ことができます、しかし、肝臓は、出血、これは困難を識別する穿刺部位を隠すことが。
    注意: 必ず意図的でない腫瘍の播種を防ぐために他の構造と腫瘍との接触を最小限に抑えます。これは、脇注入その後を支援するツールを設定することで回避できます。
12. この時点で、腫瘍部分の放出を防ぐために、止血を促進する腫瘍ポケット上シェービングジェル フォームなどの止血剤の部分に置きます。
13. 止血が確認されれば、肝臓を腹部に戻ります。
14. 3-0 polydioxanone 単純な連続を使用してテーパー針の縫合ステッチし、連続真皮のステッチを使用して切削針 4-0 polyglactin 910 縫合糸で皮膚を閉じると腹壁を閉じます。
    注意: 腹壁を閉じるとき世話大網や縫合スローで他の腸の構造を傷つけない。
    注: この腫瘍 radiographically 決定的に識別する少なくとも 2 週間かかるだろうが、それに達する 1.5\u20122 cm の直径のサイズ成長の 3 週間で。質量と積極的に広がるローカル外方増殖性腫瘍となるので 3.5\u20124 週間成長する肝腫瘍を許可しないように注意します。

4. VX2 腫瘍の懸濁液の準備

1. 50 mL コニカル プロピレン チューブの口の中に 40 μ m ストレーナーを配置します。手順 2.7 から腫瘍を使用して、腫瘍を収集し、ストレーナーにこれらの擦過腫瘍表面をこすりするのに #15 ブレードを使用します。
2. ストレーナー DMEM を使用して腫瘍擦過を洗って、8 分の 1600 rpm でプロピレン チューブを遠心分離します。
3. 遠心分離機の完了後、上澄みを除去し、それを破棄します。セルロースを 1:1 の体積比で残りのセルのブロックに追加します。
4. 次の手順 1.3\u20121.4 後肢ドナー ウサギにこの懸濁液を注入します。低温管 1 mL 因数に残りの懸濁液を配置し、それらを後で使用するための液体窒素で凍結します。

5. 血管造影活用、VX2 肝腫瘍

1. 3.1 の手順で説明するように、ウサギを準備します。
2. 鼠径部の大腿溝を触診します。溝が特定されると、溝に沿って 2\u20123 cm 直線切開を確認します。図 10を参照してください。
3. 鈍的切離を使用して、検索し、大腿静脈、動脈、神経を含む大腿のバンドルを分離します。図 11を参照してください。
4. また、バンドル内の構造体の残りの部分から大腿動脈を分離し、メスのハンドルの上に動脈を特定する鈍的切離を使用します。図 12を参照してください。
5. 3 フランス語イントロデューサ キット針とのアクセスを得るためにセルジンガー法を利用します。ガイドワイヤーを挿入し、容器に 3 フランス語鞘を事前に針を取り出します。図 13を参照してください。
   注意: は、これにより、大腿動脈の断裂 3 フランス語鞘を進める上での過度の力を使用して避けます。
6. 透視、カテーテル、ガイドワイヤー、イオヘキソール造影剤を使用して、[腹腔トランクの選択-通常 T12 レベルに位置する-一般的な肝と適切な経由で左肝動脈にカテーテルを進めると肝。
7. この時点で、カテーテルを通して選択のエージェントを管理します。エージェントに管理され、一度カテーテルを抜きます。
8. 鞘のカーソル位置に、近位および遠位大腿動脈を結紮縫合糸 3-0 シルクを使用して。必ずそれを撤回する出血を防ぐため、シースに近位の結び目を締めてください。
9. 真皮のステッチを使用して切削針 4-0 polyglactin 910 縫合糸と鼠径部切開を閉じる。
10. 標準的な術後ケアとモニター動物回復を維持します。安楽死を実行し、剖検では、必要に応じて標準的な手法を使用します。

結果

図 1を見ると、ウサギの quadricep を拡大することは明らかです。さらに、複数の小さな離散結節であり、通常、筋膜を介して腫瘍の増殖との相関が表示されます。触診の時に注入された肢が非注入肢よりも表示されます。研究者は腫瘍の存在のより決定的な保証を必要とする超音波イメージングが筋肉に埋め込まれた腫瘍を識別するために使用できます。腫瘍が検出されない場合、後肢は腫瘍細胞懸濁液を再注入する必要があります。

正常な血管アクセスを確認するために図 13Dに見られる誤嚥の鞘に返り血を観察します。バスキュラー アクセスが正常に行われなかった場合試行誤嚥は鞘の空気をもたらすまたは注射器のプランジャーを引くときに大きな抵抗を呈する。

ディスカッション

VX2 腫瘍方法論の最初の重要なステップは、ドナーのウサギの後肢で腫瘍の成功伝搬です。この手順の詳細については、「代表結果」セクションの最初の段落を参照してください。

次の重要なステップは、実行可能な腫瘍のカプセルが正しく識別されていることです。腫瘍の懸濁液の準備のため必要がありますだけも選択および肝移植への腫瘍部分を生成するために重要です。図 4では腫瘍と周囲の筋組織間の分界が付きます。懸濁液の準備の間、誤った組織サンプルを削りその後後肢の伝達が失敗します。肝移植の間に発生すると、肝臓の腫瘍の成長は発生しません。これが判明しない血管造影まで。

肝移植の過程で肝臓の左葉に近づくとき注意がすべき。多くの場合、肝臓腹膜に入ったら容易に感じ取ることが、実際にオペレーターを観察している肝臓の内側の葉です。肝臓の内側の葉への注入は、血管造影用の問題のほんの一握りを提示します。最初の背骨と内側の葉の解剖学的関係です。内側の葉腫瘍はしばしば透視確認と腫瘍の治療を困難に背骨で難読化で...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
MethoCult(メチセルロース)	Stemcell Technologies	M3134
VX2細胞株	NCI	VX-2
5 mLシリンジ	BD	309646
16 G ニードル	BD	305197
22 G ニードル	BD	305155
バリカン	Wahl	41870-0438
フォーム断熱ボックス	Mr. ボックス オンライン	10 x 10 x 4
アセプロマジン	ヘンリー シャイン	003845
ブプレノルフィン	パー	42023-179-05
メロキシカム	ヘンリー シャイン	049755
アルコール パッド	Covidien	5033
ケタミン	ヘンリー シャイン	056344
キシラジン	Akorn	59399-110-20
Pentobarbital (Fatal-Plus)	Vortech	9373
滅菌ペトリ皿	Thermo Fisher	172931
DMEM	Gibco	11965092
Saline	Baxter	2F7124
15-blade	Steris	02-050-015
Scalpel Handle x 2	Steris	22-2381
湾曲止血	WPI	501288
非外傷性鉗子	Sklar	52-5077
ガーゼ	メドライン	NON21430LF
11 ブレード	ステリス	02-050-011
Surgicel	Ethicon	1951
3-0 PDS / テーパー	Ethicon	Z305H
4 - 0ビクリル / カッティング	エチコン	J392H
40 μm ストレーナー	BD	352340
50 mL コニカルチューブ	サーモフィッシャー	339652
プラスチックピペット	トーマス サイエンティフィ	HS206371B
遠心分離	Sorvall	75004240
1.40 mL チューブ (めねじ)	Micronic	MP32131-Z20
3-F VSI Micro-HV Introducer Kit	Vascular Solutions	カスタムオーダー (P15180391)
.018 45°角グライドワイヤー	テルモ	RG*GA1818SA
ダイレクシオン ベルン型マイクロカテーテル	ボストン・サイエンティフィック	M001195230
オムニペーク	GE	Y510